一步細(xì)管冷凍解凍牛胚胎移植效果試驗(yàn)

韓志強(qiáng),張洪濤,許紅喜,李長志,李 偉,王洪亮

( 黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所, 哈爾濱 150038 )

目前胚胎移植技術(shù)作為國內(nèi)奶肉?？焖贁U(kuò)繁的重要手段之一,應(yīng)用廣泛。該技術(shù)可以充分發(fā)揮公母畜遺傳優(yōu)勢,對于實(shí)現(xiàn)奶肉牛品種改良、快速擴(kuò)繁意義重大[1]。胚胎移植技術(shù)作為牛良種快速擴(kuò)繁的重要途徑,可以提高母畜繁殖效率,加速遺傳進(jìn)展,縮短世代間隔,更高效地獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)個(gè)體。已有文獻(xiàn)表明,影響胚胎移植效果的因素較多,包括解凍胚胎時(shí)空氣浴環(huán)境溫度、胚胎質(zhì)量、受體牛胎次、生理狀態(tài)及病理狀態(tài)等[2]。胚胎移植過程中胚胎在母體子宮著床率直接影響胚胎移植技術(shù)的應(yīng)用效果,胚胎離開母體后在另一個(gè)子宮內(nèi)著床是一種高度進(jìn)化和完善的生理過程[3],因而,受體妊娠率一直是各國從事生殖技術(shù)研究的科研人員所關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

相較于人工輸精而言,胚胎移植技術(shù)要求高,移植受胎率低,如何提高一步細(xì)管胚胎解凍復(fù)蘇效果是從業(yè)人員急需解決的問題。本研究將一步冷凍胚胎解凍后推入保存液中洗脫乙二醇,再通過胚胎形態(tài)學(xué)鑒定方法進(jìn)行質(zhì)量鑒定、移植,與常規(guī)一步細(xì)管冷凍胚胎解凍后直接裝入輸胚槍內(nèi)移植進(jìn)行對比。通過比較冷凍胚胎解凍后不同處理方式對受胎率的影響,探討冷凍胚胎解凍后延長體外停留時(shí)間對降低胚胎冷凍保護(hù)劑對胚胎和受體牛受胎率影響的可能性,為進(jìn)一步提高一步細(xì)管冷凍胚胎移植受胎率提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 胚胎及受體牛的選擇

胚胎,由黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供,均為同種同批次冷凍胚胎(胚齡7 d,乙二醇作冷凍保護(hù)劑生產(chǎn)胚齡7 d的體內(nèi)胚胎)。

受體牛,選用澳大利亞進(jìn)口原種西門塔爾牛、 國內(nèi)自繁荷斯坦牛共200頭,分別在黑龍江省四方山農(nóng)場肉牛繁育基地和北安農(nóng)墾長鑫牧場專業(yè)合作社飼養(yǎng)。

受體牛選擇標(biāo)準(zhǔn):13～16月齡青年母牛,無繁殖疾病,發(fā)情周期正常,膘情良好。

受體牛散欄式自由采食,精飼料主要成分為玉米、豆粕、5%預(yù)混料和食鹽;粗飼料選用優(yōu)質(zhì)羊草、燕麥草、全株玉米青貯。在移植前30 d補(bǔ)充蛋白質(zhì)(半干苜蓿草)及微量元素(添磚)。

1.2 主要儀器、藥品和試劑

雙目體視鏡,型號為奧林巴斯SZ61;恒溫臺,為日本東海希多品牌;氯前列醇鈉, 寧波第二激素廠生產(chǎn); 維生素AD,購自北京立時(shí)達(dá)藥業(yè)有限公司;孕激素陰道栓,為新西蘭生產(chǎn);移植槍及外套,法國生產(chǎn)。以上儀器、設(shè)備、耗材均來源于黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)分組及處理

1.3.1 試驗(yàn)分組

2022年6月—2023年3月分為 A(2022年6月,西門塔爾牛為受體牛) 、B(2022年10月,荷斯坦牛為受體牛)、C(2023年3月,荷斯坦牛為受體牛)三個(gè)時(shí)間段開展受體牛移植試驗(yàn),將受體牛按照不同冷凍胚胎解凍后處理方式分為試驗(yàn)組和對照組 。

1.3.2 試驗(yàn)組處理

試驗(yàn)組(脫除冷凍劑):將冷凍胚胎從液氮罐取出后停留空氣浴10 s,投入32 ℃水中解凍,待冰晶完全溶化后取出,擦凈細(xì)管上的水珠,拔出細(xì)管塞,將胚胎推入裝有胚胎保存液的35 mm平皿內(nèi)洗脫冷凍保護(hù)劑中,再轉(zhuǎn)移到另一個(gè)裝有保存液的35 mm平皿內(nèi),參照國際胚胎移植學(xué)會推薦的胚胎形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行質(zhì)量鑒定評級。透明帶完整或有裂痕均視為合格胚胎,卵裂球破碎視為不可移植胚胎。更換新鮮胚胎保存液后重新裝入0.25 mL細(xì)管內(nèi)進(jìn)行移植。

對照組(一步解凍):將冷凍胚胎從液氮罐取出后停留空氣浴10 s,投入32 ℃水中,待冰晶完全溶化后取出,擦凈細(xì)管上的水珠,拔出細(xì)管塞,裝入移植槍內(nèi)并做好保溫, 輸入受體牛有黃體一側(cè)的子宮角深處。

1.4 同期發(fā)情

受體牛除發(fā)情當(dāng)天外的任意一天于陰道內(nèi)放入 CIDR,同時(shí)肌注10 mg維生素AD,黃體酮100 mg,雌二醇5 mg,記為第0天 ,第7天上下午各肌注PGF 2α 0.5 mg。第9天上午撤CIDR同時(shí)肌注10 mg維生素AD,準(zhǔn)確觀察發(fā)情,并記錄發(fā)情時(shí)間。

1.5 移植

1.5.1 黃體檢查

采用直腸檢查方式對發(fā)情6～8 d的受體牛進(jìn)行黃體檢查。

檢查標(biāo)準(zhǔn):受體牛黃體豐滿,觸摸黃體明顯突出于卵巢表面,質(zhì)地柔軟充實(shí),呈火山口形;卵巢上無大卵泡共存。

1.5.2 胚胎植入

(1)取出胚胎空氣浴10 s;(2)投入32 ℃水中,待冰晶完全溶化后取出;(3)擦凈細(xì)管上水珠并裝入移植槍; (4) 將移植槍輸入有黃體一側(cè)子宮角深處,操作時(shí)要盡量避免子宮受傷、減少子宮刺激,從胚胎解凍開始到輸胚完成時(shí)間要求5～7 min[2]。

1.6 移植效果判定

對受體牛進(jìn)行跟蹤觀察,在移植30,60天時(shí)分別進(jìn)行B超檢查,統(tǒng)計(jì)受胎數(shù),計(jì)算受胎率。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和預(yù)處理,采用SPSS 22進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)組解凍鏡檢移植效果

在2022年6月、2022年10月、2023年3月開展三批移植試驗(yàn),試驗(yàn)組共解凍胚胎130枚,126支細(xì)管直接將胚胎推出,4支細(xì)管經(jīng)清洗細(xì)管棉塞得到(胚胎吸附在0.25 mL細(xì)管內(nèi)壁,無法隨液流推出,將棉塞推至細(xì)管對側(cè)出口進(jìn)入胚胎保存液平皿中)。透明帶完整的102枚,透明帶有裂痕的19枚,透明帶破損的6枚。卵裂球破損的3枚未做胚胎移植。共移植127頭受體牛,30 d孕檢妊娠77頭,移植妊娠率為60.6%,60 d孕檢妊娠75頭(2頭早期流產(chǎn)),移植妊娠率為59.1%。分批分期的孕胎情況見表1。

表1 冷凍胚胎移植后受胎情況Tab.1 Conditions of implantation after frozen embryo transfer

2.2 對照組解凍移植效果

對照組共解凍胚胎105枚,解凍時(shí)水浴過程中細(xì)管塞蹦出,導(dǎo)致未完全融化的冰晶液體溢出而損失2枚胚胎;移植胚胎103枚,30 d孕檢妊娠50頭,移植妊娠率為48.5%;60 d孕檢妊娠49頭(1頭早期流產(chǎn)),移植妊娠率為47.6%。分批分期的孕胎情況見表1。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)下程控冷凍儀生產(chǎn)的牛體內(nèi)胚胎進(jìn)行移植時(shí),大多數(shù)技術(shù)人員主要采取空氣浴加水浴一步法解凍移植,該項(xiàng)技術(shù)采用的冷凍保護(hù)劑主要為乙二醇[4-5],該方法減少了脫出冷凍保護(hù)劑程序,便于現(xiàn)場操作,提高工作效率。此冷凍保護(hù)劑對胚胎具有一定的毒性,要求技術(shù)人員從胚胎解凍到移植槍插入輸出胚胎在5～7 min內(nèi)完成。如在一些受體牛保定困難或是子宮頸口不宜通過的時(shí)候很難在5～7 min內(nèi)完成胚胎植入。胚胎在解凍后盡快脫除保護(hù)劑(子宮內(nèi)或是保存液內(nèi))提高胚胎復(fù)蘇效果是非常必要的,一方面是因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑對胚胎有一定的毒性, 在常溫下這種毒性更大。另一方面,部分冷凍胚胎細(xì)管內(nèi)除中間胚胎段是冷凍液,其他液段也都是冷凍液未吸入保存液段,把有較高濃度冷凍保護(hù)劑的胚胎直接移植到受體的子宮中,由于細(xì)胞內(nèi)外存在較高的滲透壓差,大量的水分子進(jìn)入細(xì)胞而使其膨脹。而胚胎保存液中含有較高濃度的非滲透性溶劑,如蔗糖等。蔗糖在稀釋細(xì)胞內(nèi)保護(hù)劑時(shí),起到緩沖滲透壓的作用,從而維持了細(xì)胞外液較高的滲透壓,使細(xì)胞內(nèi)保護(hù)劑滲出,同時(shí)控制細(xì)胞外水分滲入的速度和滲入量,防止因水分的迅速滲入而導(dǎo)致細(xì)胞過度膨脹,減少了細(xì)胞滲透性休克的發(fā)生[6]。本研究通過解凍脫冷凍保護(hù)劑后進(jìn)行質(zhì)量鑒定,二次篩選重新裝管的方式,洗脫胚胎冷凍保護(hù)劑最大限度減少了胚胎冷凍液對胚胎的損傷,能解放傳統(tǒng)胚胎移植解凍后5～7 min內(nèi)必須將胚胎移植操作完成,以防胚胎出現(xiàn)異?；驌p傷的限制[7]。

胚胎冷凍如采用液氮冷凍介質(zhì)的CL5500或者CL8800冷凍儀,胚胎細(xì)管豎直插入方式,在冷凍室內(nèi)平衡過程中會導(dǎo)致部分胚胎下沉到冷凍保護(hù)液底部,水浴解凍時(shí)細(xì)管內(nèi)各液段內(nèi)產(chǎn)生的氣泡有導(dǎo)致解凍后胚胎脫離液體環(huán)境而吸附于氣泡上,從而降低活力的風(fēng)險(xiǎn),采用質(zhì)量鑒定法可以彌補(bǔ)這一漏洞,可在極短時(shí)間內(nèi)將胚胎浸入保存液內(nèi),提升復(fù)蘇效果,達(dá)到較高的受胎率,降低犢牛生產(chǎn)成本。通過胚胎移植前質(zhì)量鑒定可現(xiàn)場判定該次胚胎移植所用胚胎的數(shù)量及質(zhì)量;常規(guī)解凍后直接移植,不能直觀反映胚胎數(shù)量及質(zhì)量,如胚胎吸附在棉塞上未有效輸入等情況。而采用解凍法移植前處理可有效避免胚胎發(fā)生未植入性著床導(dǎo)致的失敗。

本研究結(jié)果表明,冷凍胚胎經(jīng)過脫除冷凍保護(hù)劑再移植受胎率的效果顯著好于常規(guī)一步法移植。且質(zhì)量鑒定后,胚胎受胎率與張震等[8]報(bào)道的牛鮮胚移植受胎率一般在50%以上、冷凍胚一步移植法妊娠率一般在41.5%～48.3%相吻合;與其不同之處在于,本研究中冷凍胚胎解凍后先進(jìn)行質(zhì)量鑒定,再重新裝管處理后進(jìn)行胚胎移植的試驗(yàn)組,第30,60天的胚胎受胎率均顯著高于對照組。與張秀陶等[9]報(bào)道的“解凍后重新鑒定裝管移植效果差異不顯著”不同,本試驗(yàn)也未發(fā)生其報(bào)道的解凍后胚胎丟失現(xiàn)象。

然而,冷凍胚胎解凍后進(jìn)行二次質(zhì)量鑒定、裝管對于操作環(huán)境及操作人員技術(shù)水平均有一定的要求,需配有專業(yè)胚胎質(zhì)量鑒定技術(shù)人員和操作間,不適于在基層單位推廣使用。本研究結(jié)果表明,經(jīng)質(zhì)量鑒定重新裝管后胚胎移植受胎率較直接移植法有顯著提高。此種對冷凍胚胎預(yù)處理后移植的方式對于規(guī)?；翀龃笈可a(chǎn)胚胎犢牛或部分生產(chǎn)單位開展高價(jià)值種用級胚胎移植具有參考價(jià)值,同時(shí)也為進(jìn)一步提高胚胎移植效果提供了可能性。

綜上所述,冷凍胚胎解凍鏡檢可以減少胚胎丟失,脫除冷凍保護(hù)劑可以增加優(yōu)質(zhì)胚胎利用率,使冷凍胚胎達(dá)到鮮胚移植受孕效果。同時(shí)可以考慮將解凍破碎的胚胎組織與完整胚胎進(jìn)行組合移植,以增強(qiáng)移植受體牛妊娠信號,該項(xiàng)技術(shù)可以有效提高胚胎移植受胎率、受體牛只利用率。