附聚/超支化陰離子色譜固定相的制備和性能研究

韓宇 寧弘宇 戴徐鑫 黃忠平* 劉會(huì)君 朱巖

1（浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310014）

2（浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310028）

1975 年，Small 等[1]首次提出抑制型離子色譜法，成功地解決了用電導(dǎo)檢測(cè)器連續(xù)檢測(cè)柱流出物的難題。抑制型離子色譜法被廣泛應(yīng)用于食品安全[2-5]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[6-8]和生物醫(yī)藥[9]等行業(yè)。抑制型離子色譜法具有快速、靈敏、可同時(shí)測(cè)定多組分等優(yōu)點(diǎn)，可以測(cè)定很多目前難以用其它方法測(cè)定的離子尤其是陰離子。因此，開發(fā)新型陰離子色譜固定相以滿足日益復(fù)雜的分離需求，已成為離子色譜領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。離子色譜中影響選擇性的關(guān)鍵因素是固定相，包括聚合物的基質(zhì)組成[10]、離子交換基團(tuán)的類型和結(jié)構(gòu)等[11-12]。采用新的材料基質(zhì)、新的修飾技術(shù)及更適宜的裝填方式等方法提高色譜柱的柱效、選擇性和分析速度等，已經(jīng)成為該領(lǐng)域目前的主要研究方向。

聚電解質(zhì)附聚型陰離子交換固定相是由陽離子聚電解質(zhì)主鏈的功能基團(tuán)通過靜電作用吸附于帶負(fù)電荷的基質(zhì)表面制備得到[13-15]。陽離子聚電解質(zhì)是一種水溶性高分子化合物，其鏈段帶有大量可電離基團(tuán)，因此兼具小分子電荷基團(tuán)和高分子長鏈的雙重結(jié)構(gòu)特征[16]。尤其是季銨鹽類高分子化合物，已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)，發(fā)展較快、種類較多，是一類重要的功能性高分子聚電解質(zhì)。Zhao 等[17]通過水熱碳化法將蔗糖轉(zhuǎn)化的碳質(zhì)球作為基質(zhì)，有效避免了有機(jī)聚合物基質(zhì)與可極化陰離子之間的非離子相互作用，采用甲胺（MA）和1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE）制備聚電解質(zhì)并接枝到表面。Zhang 等[18]通過巰基介導(dǎo)的聚合方法在聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）基質(zhì)上引入氨基，采用2-（甲氨基）乙醇和BDDE 合成陽離子聚電解質(zhì)，并與基質(zhì)上的氨基反應(yīng)，探究了巰基介導(dǎo)的聚合過程中形成的羧基/羥基中間層對(duì)固定相交換容量和疏水性的影響。超支化改性方法是在基質(zhì)表面引入反應(yīng)部位，然后通過縮合反應(yīng)等方法接枝高支化聚合物，超支化層附著在基質(zhì)表面，不穿透基底顆粒的孔隙，從而可以提高分離效率[19-22]。Uzhel 等[23]制備了3 種基于PS-DVB 的超支化陰離子交換劑，第一次循環(huán)分別采用甘氨酸、牛磺酸和乙醇胺與BDDE 反應(yīng)，后4 次循環(huán)用甲胺（MA）與BDDE 反應(yīng)，并比較了氨基取代基對(duì)固定相色譜性能的影響。Popov 等[24]采用PS-DVB 作為基質(zhì)，在功能層結(jié)構(gòu)中引入兩性離子片段制備了共價(jià)鍵超支化陰離子色譜固定相，在25 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了7 種常見陰離子的分離。

附聚型離子色譜固定相結(jié)合超支化修飾方法是現(xiàn)代商用固定相最主要的修飾形式[25]。Pohl 等[26]采用二環(huán)氧試劑和伯胺（摩爾比1∶1）在柱內(nèi)磺化基質(zhì)上原位生成線性結(jié)構(gòu)的聚電解質(zhì)，再進(jìn)行二環(huán)氧試劑和伯胺試劑交替循環(huán)反應(yīng)形成超支化層，已應(yīng)用于商業(yè)化色譜柱（如IonPac AS19-24）生產(chǎn)。近年來，研究者多嘗試采用不同材質(zhì)的固定相基質(zhì)，或以不同的環(huán)氧和伯胺試劑制備聚電解質(zhì)和超支化層，但未見類似柱內(nèi)原位合成的研究報(bào)道。Huang 等[27]在PS-DVB 基質(zhì)中嵌入氧化后的納米金剛石，提高了基質(zhì)微球的機(jī)械強(qiáng)度，后續(xù)以BDDE 和MA 制備陽離子聚電解質(zhì)和超支化層制備陰離子柱，在20 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了7 種陰離子的基線分離。Huang 等[28]以環(huán)氧氯丙烷和MA 為單體制備季銨鹽陽離子聚電解質(zhì)和超支化層，15 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了5 種常規(guī)陰離子和3 種極化陰離子的分離。上述研究考察了固定相的選擇性受基質(zhì)類型和二環(huán)氧試劑的結(jié)構(gòu)、超支化修飾次數(shù)等的影響，但陽離子聚電解質(zhì)的合成條件及修飾量對(duì)柱效和選擇性的影響尚未見報(bào)道。

柱容量、選擇性和柱效是評(píng)價(jià)離子色譜固定相的3 個(gè)主要指標(biāo)。離子色譜固定相的柱容量和選擇性受洗脫條件、色譜柱溫[29]、超支化層數(shù)以及基質(zhì)表面官能團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)[30-31]等因素的影響；柱效主要由固定相基質(zhì)類型[32]、基質(zhì)修飾方式[12]和裝填方式[33]決定。本研究以PS-DVB 微球?yàn)榛|(zhì)，通過BDDE 和MA 制備陽離子聚電解質(zhì)層，考察了聚電解質(zhì)的合成條件及修飾量、基質(zhì)微球的孔徑和超支化次數(shù)對(duì)固定相分離度及柱效的影響，確定了最佳的合成條件。此外，對(duì)固定相的批間重現(xiàn)性及穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ICS-1100 離子色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ZD-10 裝柱機(jī)（大連日普利公司）；TG-16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀公司）；SK2510HP 超聲波清洗儀（上海KUDOS 公司）；SHZ-D Ⅲ循環(huán)水式真空泵（鞏義予華公司）；不銹鋼柱（150 mm×4.6 mm，大連日普利公司）。

10 μm PS-DVB 微球（孔徑分別為10 和30 nm，蘇州納微科技有限公司）；BDDE（60%）、MA（40%）和冰醋酸（99.5%）購自上海阿拉丁公司；NaF、NaBr、NaNO2和NaNO3（99%）購自上海麥克林公司；Na3PO4（99%）購自宜興第二化學(xué)試劑廠；（NH4）2SO3（99%）購自上海五四化學(xué)試劑廠；Na2CO3（99.8%）購自太倉美達(dá)試劑公司；NaHCO3（99.5%）購自溫州市化學(xué)用料廠。所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將購買的PS-DVB 微球乳液用循環(huán)水式真空泵抽濾，再用無水乙醇洗滌2～3 次，置于60 ℃烘箱中烘干，備用。

1.2.1 固定相的制備

參考文獻(xiàn)[26]的方法合成陽離子聚電解質(zhì)。配制40 mL BDDE（10%，m/V）溶液，加入250 mL 三口燒瓶中，水浴升溫至60 ℃，用恒壓漏斗在1 h 內(nèi)滴加40 mL 甲胺（4%，m/V）溶液，滴加完成后冷卻至室溫。將制備的陽離子聚電解質(zhì)以5000 r/min 離心5 min，棄去沉淀，備用。

參考文獻(xiàn)[26]的方法對(duì)基質(zhì)磺化和陽離子聚電解質(zhì)的附聚接枝。取2.5 g PS-DVB 微球置于250 mL三口燒瓶中，加入15 mL 冰醋酸攪拌10 min。在30 ℃下加入3 mL 二氯甲烷溶脹，攪拌30 min。緩慢滴加7 mL 濃H2SO4，攪拌3 min 后將反應(yīng)液倒入1 mol/L 冰的稀H2SO4中猝滅。將磺化微球用去離子水反復(fù)清洗至過濾液為中性。將磺化后的基質(zhì)超聲分散于100 mL 去離子水中，在40 ℃水浴中，加入80 mL陽離子聚電解質(zhì)，恒溫?cái)嚢韪骄?4 h，用去離子水洗滌至過濾液呈中性。將微球超聲分散于100 mL 去離子水中，置于60 ℃水浴中，倒入20 mL BDDE 水溶液反應(yīng)30 min，用去離子水洗滌3 次。將微球重新分散于100 mL 去離子水中，置于60 ℃水浴中，加入20 mL 甲胺溶液，反應(yīng)30 min，完成一次接枝反應(yīng)。反應(yīng)路線如圖1 所示。

1.2.2 固定相的裝填

將固定相分散于60 mL 去離子水中形成勻漿液，將勻漿液倒?jié)M勻漿罐，在20 MPa 壓力下進(jìn)行填充，勻漿液以及頂替液均為去離子水，待流出液為500 mL 時(shí)裝柱停止，在30 min 內(nèi)緩慢降低流速將壓力降為0 MPa。將色譜柱拆下后，以2 mmol/L Na2CO3和2 mmol/L NaHCO3溶液為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，沖洗平衡6 h 后，備用。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

采用賽默飛世爾科技有限公司IonPac AS19-24 商品柱性能報(bào)告中的7 種典型陰離子（F–、Cl–、NO2–、Br–、NO3–、PO43–和SO42–）評(píng)價(jià)自制色譜柱的分離性能。稱取相應(yīng)質(zhì)量的NaF、NaCl、NaNO2、NaBr、NaNO3、Na3PO4?10H2O 和（NH4）2SO4，配制成濃度為1000 mg/L 的儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。將各離子的單標(biāo)溶液配制成相應(yīng)濃度（F–為2 mg/L，Br–為20 mg/L，NO2–為10 mg/L，Cl–為5 mg/L，NO3–為20 mg/L，PO43–為30 mg/L，SO42–為10 mg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 色譜條件及柱容量的測(cè)定

色譜條件 在未特別注明的情況下，采用的色譜柱均為不銹鋼柱（150 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：2.0 mmol/L Na2CO3和2.0 mmol/L NaHCO3的混合溶液；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；抑制電流：25 mA；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器。

柱容量的測(cè)定 用1.0 mol/L NaCl 溶液在高壓泵上以1.0 mL/min 流速?zèng)_洗色譜柱6 h，使所有季銨基吸附位點(diǎn)帶上Cl–。采用去離子水以相同的流速?zèng)_洗色譜柱6 h，沖出柱中游離的Cl–。最后，采用2.0 mmol/L Na2CO3和2.0 mmol/L NaHCO3的混合液以1.0 mL/min 流速?zèng)_洗色譜柱6 h，并收集洗出液，用離子色譜檢測(cè)洗出液中Cl–的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 陽離子聚電解質(zhì)的合成優(yōu)化

在制備過程中，MA 與BDDE 反應(yīng)時(shí)易發(fā)生凝膠結(jié)塊現(xiàn)象，所得的陽離子聚電解質(zhì)在與磺化基質(zhì)附聚后結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，并且接枝兩次后不能實(shí)現(xiàn)7 種常見陰離子的基線分離。通過調(diào)節(jié)恒壓漏斗活塞控制MA 的滴加速率制備陽離子聚電解質(zhì)，分別調(diào)整滴加速率使得甲胺溶液在0.5 和1.0 h 內(nèi)加至BDDE 中。兩種不同的MA 流速下制備的陽離子聚電解質(zhì)均未發(fā)生凝膠結(jié)塊的情況。以兩種方式制備的陽離子聚電解的色譜分離圖如圖2 所示，經(jīng)過附聚接枝后，兩種色譜性能差異明顯?；|(zhì)微球附聚0.5 h 內(nèi)滴加MA 制備的陽離子聚電解所得的固定相，可對(duì)7 種常規(guī)陰離子進(jìn)行初步的分離，而在1.0 h 內(nèi)滴加MA 制備的陽離子聚電解質(zhì)所得的固定相對(duì)陰離子保留較弱。然而，通過后續(xù)的接枝修飾后，情況卻發(fā)生了相反的變化，如圖2A 所示，附聚后對(duì)陰離子有初步分離能力的固定相未能實(shí)現(xiàn)7 種陰離子的分離；但是，附聚后對(duì)陰離子保留較弱的固定相卻在兩次接枝后具有較好的選擇性，實(shí)現(xiàn)了7 種陰離子的基線分離，如圖2B 所示。在1.0 h 內(nèi)滴加MA 控制反應(yīng)速率，使聚合的電解質(zhì)呈線性生長，避免反應(yīng)速率過快導(dǎo)致電解質(zhì)聚合封閉成環(huán)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用在1.0 h 內(nèi)滴加MA 制備陽離子聚電解質(zhì)。

圖2 7 種常規(guī)陰離子在固定相上分離的色譜圖：（A）在0.5 h 內(nèi)滴加40 mL MA 制備陽離子聚電解質(zhì)制備的固定相；（B）在1 h 內(nèi)滴加40 mL MA 制備陽離子聚電解質(zhì)制備的固定相Fig.2 Chromatograms of separation of seven conventional anions on cationic polyelectrolyte agglomeration stationary phases prepared by dropping 40 mL of methylamine within(A) 0.5 h and (B) 1 h,respectively

2.2 不同附聚修飾量的固定相的色譜性能對(duì)比

采用不同量的陽離子聚電解質(zhì)與磺化基質(zhì)進(jìn)行附聚及接枝修飾，并測(cè)試了所制備的固定相的色譜性能。如圖3 所示，經(jīng)過2 次接枝修飾反應(yīng)后，采用不同量陽離子聚電解質(zhì)附聚制備的固定相色譜性能相近，柱效都維持在同一水平。但是，Br–峰型不同，通過計(jì)算Br–峰的不對(duì)稱因子（峰不對(duì)稱因子：峰兩側(cè)峰高10%處距峰值位置的距離之比）可知，在采用40 mL 陽離子聚電解質(zhì)附聚時(shí)，所制備的固定相對(duì)Br–的峰不對(duì)稱因子為1.35，不對(duì)稱因子較大。但是，當(dāng)附聚的陽離子聚電解質(zhì)體積達(dá)到80 mL 時(shí)，Br–峰型有所改善，不對(duì)稱因子為1.12。磺化基質(zhì)表面需要附聚足夠量聚電解質(zhì)，以消除基質(zhì)對(duì)離子的作用力。聚電解質(zhì)量為40 mL 時(shí)，附聚量不足，使得部分微球基質(zhì)表面暴露于流動(dòng)相中，導(dǎo)致Br–峰的不對(duì)稱因子較大。當(dāng)聚電解質(zhì)量增大至80 和120 mL 時(shí)，色譜柱性能沒有變化，說明磺化基質(zhì)表面已經(jīng)有足夠量的聚電解質(zhì)進(jìn)行附聚。因此，后續(xù)研究采用80 mL 陽離子聚電解質(zhì)附聚在磺化的基質(zhì)上。

圖3 采用（A）40 mL、（B）80 mL 和（C）120 mL 陽離子聚電解質(zhì)附聚制備的固定相的色譜分離圖Fig.3 Chromatograms of stationary phase prepared by attachment of 40 mL(A),80 mL (B) and 120 mL(C) of cationic polyelectrolyte

2.3 不同孔徑基質(zhì)的色譜性能

考察了10 nm 孔徑的10 μm 微球與30 nm 孔徑的10 μm 微球基質(zhì)在相同條件下制備的固定相的色譜性能，結(jié)果如圖4 所示，兩種基質(zhì)的固定相均能實(shí)現(xiàn)7 種常規(guī)陰離子的基線分離。在相同的流動(dòng)相條件下，采用孔徑10 nm 的基質(zhì)微球制備的固定相對(duì)常規(guī)陰離子的分離度更大，但是保留時(shí)間過長；而孔徑30 nm的基質(zhì)微球可在20 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)分離，相較孔徑10 nm 的基質(zhì)微球具有更快的分析速度。原因在于孔徑10 nm 的基質(zhì)微球比孔徑30 nm 的基質(zhì)微球具有更大的比表面積，能夠附聚更多量的陽離子聚電解質(zhì)，因此同樣量的固定相其交換容量越大，保留能力越強(qiáng)。后續(xù)研究均采用孔徑30 nm 微球基質(zhì)制備固定相。

圖4 （A）孔徑30 nm 和（B）孔徑10 nm 微球制備的基質(zhì)色譜性能的對(duì)比Fig.4 Comparison of chromatographic performance of different stationary phase matrices: (A) Pore size of 30 nm;(B) Pore size of 10 nm

2.4 不同接枝次數(shù)的固定相色譜性能對(duì)比

陽離子聚電解質(zhì)通過靜電力與范德華力作用附聚于磺化的PS-DVB 微球基質(zhì)的表面，形成類似核殼結(jié)構(gòu)的薄膜[13-14]，而離子交換固定相的功能基團(tuán)是季銨基，微球表面的季銨功能基團(tuán)的數(shù)量可以通過接枝次數(shù)控制，因此本研究考察了不同接枝修飾次數(shù)固定相的色譜性能。如圖5 所示，接枝2 次和3 次的固定相具有良好的選擇性，接枝3 次的固定相柱容量為0.43 mmol/column，高于接枝2 次的固定相（0.27 mmol/column）。當(dāng)接枝4 次時(shí)，固定相柱容量上升至0.54 mmol/column，但選擇性下降，NO3–與PO43–無法達(dá)到基線分離。接枝5 次后固定相的選擇性進(jìn)一步下降。推測(cè)是隨著接枝次數(shù)增加，基質(zhì)表面季銨功能基團(tuán)數(shù)量增多，基質(zhì)表面的電荷密度變小，造成柱效與選擇性下降[34-35]。后續(xù)研究均對(duì)附聚后的微球基質(zhì)接枝2 次制備固定相。

圖5 不同接枝次數(shù)的固定相色譜性能的對(duì)比Fig.5 Comparison of chromatography performances of stationary phases with different numbers of grafting

2.5 固定相的評(píng)價(jià)

2.5.1 固定相的批次間重現(xiàn)性

在確定了色譜固定相合成的最佳條件后，考察了批次間合成的重現(xiàn)性。在2 個(gè)月內(nèi)合成了8 批次的柱填料，并分別按照相同步驟進(jìn)行色譜柱的裝填，采用7 種常規(guī)陰離子的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜性能測(cè)試，結(jié)果如圖6 與表1 所示，所有批次的柱填料均在相同色譜條件下測(cè)試，固定相的背景壓力均小于4.83 MPa。對(duì)于SO42–，所有批次固定相的柱效均大于30000 N/m，峰不對(duì)稱因子在0.98～1.24 之間，保留時(shí)間在22.71～25.85 min 之間。因此，本研究中的固定相的合成與填裝方法的重現(xiàn)性良好，具有實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)。

表1 不同批次固定相的色譜性能數(shù)據(jù)Table 1 Chromatographic performance data of different batches of stationary phase

圖6 不同批次固定相的色譜分離圖Fig.6 Chromatographic separation diagrams of different batches of stationary phases

2.5.2 固定相的穩(wěn)定性

在相同的色譜條件下，采用7 種常規(guī)陰離子混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行了100 次分離測(cè)試，并每隔4 針選取1 針分析結(jié)果進(jìn)行色譜圖的疊加繪制，如圖7 所示，各離子保留時(shí)間的RSD 均不超過1.1%，峰高與峰面積的RSD 均小于6%，表明此固定相具有良好的穩(wěn)定性和耐久性。

圖7 7 種常見陰離子在固定相上的分離疊加圖Fig.7 Separation and superimposition diagram of 7 kinds of common anions on the stationary phase

3 結(jié)論

考察了影響附聚型陰離子色譜固定相柱效和分離度的因素，解決了聚陽離子電解質(zhì)在合成過程中容易產(chǎn)生凝結(jié)及難以重現(xiàn)的問題，探究了聚陽離子電解質(zhì)對(duì)固定相柱效及分離度的影響。優(yōu)化后的固定相性能良好，背景壓力低且塔板數(shù)較多，柱效較高，可在30 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)7 種常規(guī)陰離子的分離，并且重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。本研究為制備聚附型陰離子固定相的產(chǎn)業(yè)化提供了良好的技術(shù)參考。