槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、脂代謝和腸道菌群的影響

王 婷 陳景龍 靳杰豪 明建華 邵仙萍 楊 霞 葉金云 吳成龍

(湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,水生動(dòng)物繁育與營(yíng)養(yǎng)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,浙江省水生生物資源養(yǎng)護(hù)與開(kāi)發(fā)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖州 313000)

在集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖中,普遍采用提高飼料脂肪水平以節(jié)約蛋白質(zhì)的策略,以達(dá)到節(jié)約生產(chǎn)成本、減少氮排放和保護(hù)養(yǎng)殖水體環(huán)境的目的[1-2]。然而,魚(yú)類對(duì)脂肪的需求和利用能力受其生理?xiàng)l件的限制,飼料中脂肪含量過(guò)高往往會(huì)導(dǎo)致魚(yú)體脂肪蓄積,引起魚(yú)類脂代謝障礙與紊亂,導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)性脂肪肝,造成氧化應(yīng)激損傷,抗病力下降,甚至?xí)鸨┌l(fā)性死亡,這嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3-5]。因此,通過(guò)綠色飼料添加劑來(lái)調(diào)控魚(yú)體的脂代謝,以降低其脂肪沉積,增強(qiáng)魚(yú)體抗氧化應(yīng)激能力已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

槲皮素(分子式C15H10O7)是一種廣泛存在于各種果蔬和中草藥中的黃酮類化合物,具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等多種生理功能[6-7]。近年來(lái),槲皮素作為一種新型的飼料添加劑在陸生動(dòng)物中的研究較多。據(jù)報(bào)道,飼糧中添加適量槲皮素可改善海南褐蛋雞產(chǎn)蛋中后期的蛋品質(zhì)[8],促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的利用[9],調(diào)控?cái)嗄套胸i糞便微生物組成進(jìn)而促進(jìn)腸道健康,提高其生長(zhǎng)性能[10]。目前,槲皮素在水產(chǎn)動(dòng)物上僅有較少的研究報(bào)道,如飼料中添加適量槲皮素可促進(jìn)團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[11]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)[7]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[12]的生長(zhǎng),改善斑馬魚(yú)(Daniorerio)的焦慮行為和降低其細(xì)胞凋亡[13],增強(qiáng)克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)的抗氧化能力和免疫力[14],可抑制土霉素誘導(dǎo)克林雷氏鲇(Rhamdiaquelen)血漿皮質(zhì)醇水平升高而引起的應(yīng)激反應(yīng)[15]。然而,槲皮素在高脂養(yǎng)殖魚(yú)類上的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

青魚(yú)(Mylopharyngodonpiceus)是我國(guó)主養(yǎng)的淡水肉食性魚(yú)類,其營(yíng)養(yǎng)豐富,經(jīng)濟(jì)效益好,2022年我國(guó)青魚(yú)養(yǎng)殖年產(chǎn)量高達(dá)71.55萬(wàn)t[16]。然而,在集約化的養(yǎng)殖生產(chǎn)中,人工養(yǎng)殖的青魚(yú)脂肪過(guò)度沉積而導(dǎo)致脂代謝紊亂,造成營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝。這類魚(yú)抗病、抗應(yīng)激能力下降,死亡率升高,生長(zhǎng)受阻。因此,本研究以青魚(yú)為研究對(duì)象,在高脂飼料中添加不同劑量的槲皮素,研究其對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)生長(zhǎng)性能、抗氧化能力、脂代謝和腸道菌群的影響,為槲皮素在青魚(yú)高脂飼料中的合理應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料制備

槲皮素購(gòu)自Sigma公司(美國(guó)),純度≥95%。

以進(jìn)口魚(yú)粉、酪蛋白和豆粕為蛋白質(zhì)源,玉米淀粉和面粉為糖源,魚(yú)油和大豆油為脂肪源配制等氮不等能的飼料。試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)對(duì)照組,即正常脂肪組(NFD組,粗脂肪5%)和高脂組(HFD組,粗脂肪15%),以及參考Xu等[7]和Dong等[17]的研究和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果在高脂組飼料中分別添加300(HFDQ1組)、600(HFDQ2組)、900(HFDQ3組)和1 200 mg/kg(HFDQ4組)的槲皮素組成4個(gè)槲皮素添加組(HFDQ組),共配制6種飼料,飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。將各種固體原料粉碎后過(guò)60目篩,通過(guò)逐級(jí)擴(kuò)大法添加微量成分,然后加入魚(yú)油和大豆油混勻,再用飼料造粒機(jī)制成粒徑2 mm的顆粒飼料,置于烘箱中40 ℃烘干,用自封袋封裝標(biāo)注后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items組別 GroupsNFDHFDHFDQ1HFDQ2HFDQ3HFDQ4氯化膽堿 Choline chloride0.500.500.500.500.500.50維生素預(yù)混料 Vitamin premix1)0.100.100.100.100.100.10礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix2)0.300.300.300.300.300.30纖維素 Cellulose9.051.051.020.990.960.93羧甲基纖維素鈉 Sodium carboxymethylcellulose2.002.002.002.002.002.002,6-二叔丁基羥基甲苯 BHT0.050.050.050.050.050.05槲皮素 Quercetin0.030.060.090.12合計(jì) Total100.00100.00100.00100.00100.00100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels3)干物質(zhì) DM94.9395.1595.2495.2995.2095.46粗蛋白質(zhì) CP36.6936.7436.8136.7136.7336.76粗脂肪 EE4.9814.0814.3114.2014.2414.58粗灰分 Ash7.217.267.287.267.287.28

1.2 試驗(yàn)魚(yú)和飼養(yǎng)管理

青魚(yú)幼魚(yú)購(gòu)于湖州南潯菱湖水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)。正式試驗(yàn)前,青魚(yú)在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中以NFD組飼料投喂馴養(yǎng)1周,然后選擇健康的青魚(yú)幼魚(yú)540尾,初體質(zhì)量為(10.57±0.41) g,隨機(jī)分為6組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30尾魚(yú),分別放養(yǎng)于室內(nèi)18個(gè)養(yǎng)殖桶(重復(fù))中。6組試驗(yàn)青魚(yú)分別投喂上述6種飼料,每天飽食投喂2次(08:00、16:30),且每次投飼45 min后收集殘餌并烘干稱重,攝食飼料總量為投飼量減去烘干殘餌量。每天吸污換水1次,換水量為原來(lái)的1/4～1/3,用氣泵持續(xù)充氣增氧,溶氧量≥6 mg/L,水溫(27.0±1.5) ℃,pH 7.5～8.0。試驗(yàn)期8周。

1.3 樣品采集與處理

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后,禁食24 h,將各桶青魚(yú)稱重計(jì)數(shù)。從每桶中隨機(jī)取3尾青魚(yú),用100 mmol/L MS-222快速麻醉后,從尾靜脈用一次性醫(yī)用注射器采血。血樣在4 ℃冰箱中靜置8 h后,在4 ℃下以3 500 r/min離心15 min制備血清,于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩ｔ~(yú)體采血后立即剖開(kāi)腹腔,剝離出內(nèi)臟和肝臟并稱重,取適量肝臟用于生化指標(biāo)分析,并在無(wú)菌條件下取適量的腸道內(nèi)容物,用于腸道菌群分析;同時(shí),另取適量肝臟和腸道用于制作組織切片。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的測(cè)定

增重率(WGR,%)=100×(魚(yú)體末均重-
魚(yú)體初均重)/魚(yú)體初均重;
特定生長(zhǎng)率(SGR,%/d)=100×(ln魚(yú)體末均重-
ln魚(yú)體初均重)/飼喂天數(shù);
飼料系數(shù)(FCR)=攝食飼料總量(風(fēng)干樣重)/
(魚(yú)體末重-魚(yú)體初重);
成活率(SR,%)=100×末魚(yú)尾數(shù)/初魚(yú)尾數(shù);
肝體指數(shù)(HSI,%)=100×每尾魚(yú)末肝臟重/
每尾魚(yú)末體重;
臟體指數(shù)(VSI,%)=100×每尾魚(yú)末內(nèi)臟重/
每尾魚(yú)末體重;
肥滿度(CF,g/cm3)=100×每尾魚(yú)末體重/
每尾魚(yú)末體長(zhǎng)3。

1.4.2 血清和肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定

測(cè)定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(NEFA)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。

肝臟樣品與生理鹽水按1∶9(質(zhì)量體積比)的比例進(jìn)行冰浴電動(dòng)勻漿,然后在4 ℃下以3 500 r/min離心15 min制備上清液用于分析。測(cè)定肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和總抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)含量。

以上指標(biāo)測(cè)定均按照南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.3 肝臟和腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

肝臟和腸道于4%的中性甲醛中固定48 h后,送至杭州浩克生物技術(shù)有限公司進(jìn)行脫水、透明、浸蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色,然后進(jìn)行顯微觀察并拍照。使用ImageJ軟件測(cè)量各組腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度。

1.4.4 腸道菌群分析

利用通用引物F338/R806(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)域序列。PCR產(chǎn)物純化后在上海派森諾生物科技股份有限公司的Illumina PE250平臺(tái)上測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用QIIME 2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析和質(zhì)量篩選而得到優(yōu)化序列,對(duì)有效操作分類單元(OTU)進(jìn)行聚類分析,通過(guò)Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)評(píng)估樣本的alpha多樣性。通過(guò)QIIME 2在門和屬分類水平對(duì)菌群組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異化分析,并計(jì)算腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù),計(jì)算公式為:

穩(wěn)態(tài)指數(shù)=[梭桿菌門(Fusobacteria)+厚壁菌門
(Firmicutes)+擬桿菌門(Bacteroidetes)]/
變形菌門(Proteobacteria)。

同時(shí),利用PICRUSt2預(yù)測(cè)青魚(yú)腸道菌群功能。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,NFD組與HFD組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析;HFD組和HFDQ組則采用單因素方差分析(one-way ANOVA),若組間差異顯著,則采用Tukey氏法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異顯著。所有結(jié)果數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知,與NFD組相比,HFD組青魚(yú)末體重、WGR、SGR和SR顯著降低(P<0.05),HSI、VSI和CF顯著提高(P<0.05),而FCR無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組青魚(yú)末體重、WGR、SGR和SR呈先升高后降低的變化趨勢(shì),且均當(dāng)添加量為600 mg/kg時(shí)達(dá)到最高,并顯著高于HFD組(P<0.05);而FCR、HSI和CF呈先降低后升高的變化趨勢(shì),且當(dāng)添加量為600和900 mg/kg時(shí)達(dá)到較低水平,并顯著低于HFD組(P<0.05);當(dāng)槲皮素添加量為1 200 mg/kg時(shí),VSI最低,并顯著低于HFD組(P<0.05)。如圖1所示,利用青魚(yú)WGR與槲皮素添加量的折線模型擬合得出,青魚(yú)高脂飼料中槲皮素的適宜添加量為597.13 mg/kg。

表2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

圖1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)WGR的影響

2.2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知,與NFD組相比,HFD組青魚(yú)肝臟SOD、CAT、GPx和GR活性及T-AOC顯著降低(P<0.05),而肝臟MDA含量顯著提高(P<0.05)。隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組青魚(yú)肝臟SOD、CAT、GPx和GR活性及T-AOC均呈先升高后降低的變化趨勢(shì),且當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí)肝臟SOD和GPx活性最高,當(dāng)添加量為600 mg/kg時(shí)肝臟GR活性和T-AOC最高,當(dāng)添加量為900 mg/kg時(shí)肝臟CAT活性最高,并均顯著高于HFD組(P<0.05);肝臟MDA含量呈先降低后升高的變化趨勢(shì),當(dāng)添加量為900 mg/kg時(shí),肝臟MDA含量最低,顯著低于其他各組(P<0.05)。

表3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)血清脂代謝指標(biāo)的影響

由表4可知,與NFD組相比,HFD組青魚(yú)血清TG、TC、LDL-C和NEFA含量顯著提高(P<0.05),而血清HDL-C含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組青魚(yú)血清TG、TC和NEFA含量呈先降低后升高的變化趨勢(shì),而血清HDL-C含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì),當(dāng)添加量為900 mg/kg時(shí),血清TG、TC和NEFA含量達(dá)到最低,顯著低于HFD組(P<0.05);當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí),血清HDL-C含量最高,顯著高于HFD組(P<0.05)。當(dāng)槲皮素添加量為900和1 200 mg/kg時(shí),血清LDL-C含量較低,顯著低于HFD組(P<0.05)。

表4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)血清脂代謝指標(biāo)的影響

續(xù)表4項(xiàng)目Items組別 GroupsNFDHFDHFDQ1HFDQ2HFDQ3HFDQ4低密度脂蛋白膽固醇LDL-C/(mmol/L)1.45±0.24?1.70±0.15a1.56±0.35ab1.52±0.27ab1.29±0.24b1.17±0.18b高密度脂蛋白膽固醇HDL-C/(mmol/L)0.98±0.171.05±0.18b1.59±0.21a1.45±0.22ab1.22±0.19ab1.14±0.16b游離脂肪酸NEFA/(μmol/L)638.22±77.96?807.34±123.42a753.11±117.32ab554.82±118.68c531.34±81.17c617.59±68.24bc

2.4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)肝臟和腸道組織形態(tài)的影響

如圖2所示,NFD組青魚(yú)肝細(xì)胞分布均勻,細(xì)胞核和細(xì)胞膜的界限清晰;而HFD組肝細(xì)胞核溶解或缺失,部分出現(xiàn)空泡化。在高脂飼料中添加槲皮素后,肝細(xì)胞空泡化程度與HFD組相比有所下降,其中HFDQ1組肝細(xì)胞核溶解或缺失現(xiàn)象有所改善,但仍存在空泡化現(xiàn)象;而HFDQ2組、HFDQ3組和HFDQ4組肝細(xì)胞核較清晰,細(xì)胞空泡化現(xiàn)象也明顯改善。

He:肝細(xì)胞 hepatocyte;N:細(xì)胞核 nucleus;HS:肝血竇 hepatic sinusoid;HPV:肝細(xì)胞空泡化 hepatocyte vacuolation;Ka:細(xì)胞核溶解 karyolysis。

如圖3所示,NFD組青魚(yú)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整清晰,絨毛排列緊密有序;而HFD組腸道絨毛高度降低,不夠致密完整。在高脂飼料中添加槲皮素后,腸絨毛高度有所提高,排列也較致密。由表5可知,NFD組青魚(yú)絨毛高度和肌層厚度顯著高于HFD組(P<0.05),而2組之間絨毛寬度無(wú)顯著差異(P>0.05);與HFD組相比,HFDQ組絨毛高度均顯著提高(P<0.05),且HFDQ1組絨毛寬度和HFDQ1組、HFDQ2組、HFDQ4組肌層厚度也均顯著提高(P<0.05)。

2.5 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群的影響

2.5.1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群alpha多樣性的影響

由表6可知,各組樣本的覆蓋率均高于99%,表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)已經(jīng)覆蓋了大多數(shù)微生物物種。與NFD組相比,HFD組Chao1指數(shù)較高,Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)較低,但2組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與HFD組相比,隨著飼料中槲皮素添加量的增加,HFDQ組Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈先升高后降低的變化趨勢(shì),但各組之間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

VH:絨毛高度 villus height;VW:絨毛寬度 villus width;MT:肌層厚度 muscular thickness;GC:杯狀細(xì)胞 goblet cell。

表5 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

表6 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群alpha多樣性的影響

2.5.2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群組成和穩(wěn)態(tài)指數(shù)的影響

如圖4所示,在門水平上,青魚(yú)腸道菌群主要有變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門,其中變形菌門在6個(gè)組中的相對(duì)豐度分別為57.38%、71.43%、51.05%、60.69%、56.62%和69.29%。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)(表7和圖5),與HFD組相比,高脂飼料中添加槲皮素提高了厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度以及腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù),降低了變形菌門的相對(duì)豐度,但各組之間菌門的相對(duì)豐度和穩(wěn)態(tài)指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群在門水平上相對(duì)豐度的影響

由表7可知,在屬水平上,青魚(yú)腸道菌群主要有乳球菌屬(Lactococcus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、紅桿菌屬(Rhodobacter)和氣單胞菌屬(Aeromonas)。其中,隨著飼料中槲皮素添加量的增加,乳球菌屬和紅桿菌屬的相對(duì)豐度呈先升高后降低的變化趨勢(shì),而不動(dòng)桿菌屬、鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬的相對(duì)豐度則呈先降低后升高的變化趨勢(shì),但各組之間菌屬的相對(duì)豐度均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表7 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群在門和屬水平上相對(duì)豐度的影響

2.5.3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群的功能預(yù)測(cè)

基于PICRUSt2對(duì)6組青魚(yú)腸道菌群樣品進(jìn)行功能預(yù)測(cè),利用京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)得到33種二級(jí)功能通路,其中參與代謝的通路最多,占比33.33%。根據(jù)每個(gè)樣品中的通路豐度信息及其功能進(jìn)行聚類分析,繪制成如圖6所示的熱圖。結(jié)果顯示,不同組青魚(yú)腸道菌群在功能上存在差異,其中HFDQ1組、HFDQ2組和HFDQ3組青魚(yú)腸道中與脂代謝、其他次生代謝物的生物合成、能量代謝以及外源生物降解和代謝等功能有關(guān)的通路豐度高于HFD組,而心血管疾病和免疫性疾病的通路豐度低于HFD組;HFDQ1組和HFDQ2組細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、萜類和聚酮類化合物代謝、氨基酸代謝以及輔助因子和維生素代謝的通路豐度高于HFD組;HFDQ3組內(nèi)分泌系統(tǒng)、復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝、折疊、分類和降解、翻譯、其他氨基酸代謝、聚糖生物合成和代謝、細(xì)胞群落-原核生物以及信號(hào)分子和相互作用的通路豐度高于HFD組。

3 討 論

3.1 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

研究表明,高脂飼料養(yǎng)殖團(tuán)頭魴30 d可以顯著提高其WGR,而飼喂60 d后其WGR與正常脂肪飼料相比無(wú)顯著差異[18]。另外,也有研究報(bào)道,高脂飼料會(huì)降低大口黑鱸(Micropterussalmoides)[19]、草魚(yú)[20]和日本黃姑魚(yú)(Nibeajaponica)[21]的生長(zhǎng)性能。本研究中,與NFD組相比,HFD組青魚(yú)WGR、SGR和SR均顯著降低,而HSI和VSI顯著提高,說(shuō)明高脂對(duì)青魚(yú)的生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響。這可能與魚(yú)體攝入的脂肪超出了自身的需求有關(guān),造成其在肝臟和內(nèi)臟中過(guò)度積累,導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪含量增加,肝臟脂肪變性,脂代謝紊亂,從而表現(xiàn)出生長(zhǎng)性能下降[22-23]。

數(shù)據(jù)柱無(wú)標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。

圖6 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群功能的預(yù)測(cè)

據(jù)報(bào)道,槲皮素對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。孫如意等[24]在飼料中添加100 mg/kg槲皮素可以顯著提高黃河鯉(Cyprinuscarpio)的WGR和SGR,并降低FCR。李劍等[25]在飼料中添加200 mg/kg槲皮素可顯著提高吉富羅非魚(yú)(GIFTOreochromisniloticus)幼魚(yú)WGR、SGR、蛋白質(zhì)效率(PER)和CF,并降低FCR。Jia等[11]報(bào)道,高脂飼料中添加0.8%的槲皮素可以提高團(tuán)頭魴的WGR。Dong等[17]研究也發(fā)現(xiàn),高脂飼料中添加0.5和1.0 g/kg的槲皮素可以顯著提高花鱸(Lateolabraxmaculatus)的WGR和SGR,降低FCR。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飼料中添加600和900 mg/kg槲皮素可顯著提高青魚(yú)WGR、SGR和SR,降低FCR、HSI和VSI,從而促進(jìn)青魚(yú)的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果類似,但不同研究者得出的槲皮素添加量不同,這可能與魚(yú)的品種和養(yǎng)殖環(huán)境有關(guān),其促進(jìn)生長(zhǎng)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

脂肪在魚(yú)體中過(guò)度沉積會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)自由基,若抗氧化系統(tǒng)未能及時(shí)清除這些自由基,則會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化損傷[26-27]。魚(yú)類在進(jìn)化過(guò)程中形成了抗氧化酶防御系統(tǒng),如SOD可催化超氧陰離子歧化生成氧氣(O2)和過(guò)氧化氫(H2O2),H2O2又在CAT和GPx的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)化為無(wú)害的水(H2O)和O2,從而保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷[28];而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要產(chǎn)物,可作為衡量氧化應(yīng)激程度的標(biāo)志[29]。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)肝臟SOD、CAT、GPx和GR活性及T-AOC顯著降低,而肝臟MDA含量顯著提高。這與在花鱸[17]、青魚(yú)[30]和黃河鯉[31]上的研究結(jié)果一致,說(shuō)明高脂飼料會(huì)引起魚(yú)體抗氧化能力降低,引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。

槲皮素是一種強(qiáng)抗氧化劑,其分子結(jié)構(gòu)中存在2個(gè)抗氧化基團(tuán),即B環(huán)中的鄰苯二酚基團(tuán)和AC環(huán)3位點(diǎn)上的羥基(—OH)基團(tuán)[32],具有強(qiáng)抗氧化活性,能夠有效清除體內(nèi)自由基,從而減少機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[33]。研究表明,槲皮素可提高黃河鯉[24]、斑馬魚(yú)[34]、鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)[35]和烏鱧(Channaargus)[36]肝臟中的抗氧化酶活性,降低肝臟MDA含量。本試驗(yàn)中,高脂飼料中添加600 mg/kg槲皮素可顯著提高青魚(yú)肝臟CAT、GPx和GR活性以及T-AOC,降低肝臟MDA含量,從而增強(qiáng)青魚(yú)機(jī)體的抗氧化能力。Dong等[17]在高脂飼料中添加1 g/kg槲皮素也可顯著提高花鱸肝臟CAT和SOD活性、T-AOC以及谷胱甘肽(GSH)含量,降低肝臟MDA含量。本研究與在花鱸[17]上的研究結(jié)果類似,說(shuō)明槲皮素可以提高青魚(yú)抗氧化酶活性,緩解高脂誘導(dǎo)而引起的氧化應(yīng)激,進(jìn)而維持肝臟的氧化還原穩(wěn)態(tài)。

3.3 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)血清脂代謝指標(biāo)的影響

閆亞楠[38]報(bào)道,高脂飼料中添加0.4%和0.8%的槲皮素可以降低團(tuán)頭魴血清TG和TC含量。劉超[39]也報(bào)道了用分蘗蔥頭槲皮素對(duì)高脂血癥小鼠灌胃50 d后,可降低其血清TG、TC和LDL-C含量,從而降低血脂水平。同樣,槲皮素還可通過(guò)降低高脂飼糧飼養(yǎng)小鼠血清和肝臟TG和TC含量,改善小鼠肝臟的脂肪變性[40]。本研究中,高脂飼料中添加900 mg/kg槲皮素可顯著降低青魚(yú)血清TG、TC、LDL-C和NEFA含量,表明槲皮素可降低高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)的血脂水平。

3.4 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)肝臟和腸道組織形態(tài)的影響

肝臟組織形態(tài)觀察是了解肝臟病理情況的重要手段之一。本研究中,肝臟組織切片顯示,高脂飼料誘導(dǎo)了青魚(yú)肝細(xì)胞損傷,如肝細(xì)胞空泡化、細(xì)胞核溶解或消失,這與在鯉魚(yú)[41]和草魚(yú)[42]上的相關(guān)報(bào)道類似。然而,在青魚(yú)高脂飼料中添加600～1 200 mg/kg槲皮素后,可以減輕上述癥狀,表明槲皮素可改善青魚(yú)肝細(xì)胞的脂代謝,有利于青魚(yú)肝臟健康。這與以前的一些報(bào)道相吻合,如古送汗·買提尼亞孜等[40]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可有效抑制高脂飼糧飼養(yǎng)小鼠肝臟脂滴的聚集;同樣,槲皮素還可明顯改善非酒精性脂肪肝炎大鼠肝臟脂質(zhì)沉積和纖維化病變,減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[43-44]。

腸道是魚(yú)類消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所,腸絨毛在吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和提高生長(zhǎng)性能方面發(fā)揮著重要作用[45]。腸道絨毛高度、絨毛寬度和腸壁肌層厚度通常與腸道健康和營(yíng)養(yǎng)吸收效率密切相關(guān)[46]。Liu等[47]報(bào)道,高脂飼料可誘導(dǎo)草魚(yú)腸道絨毛發(fā)生結(jié)構(gòu)性紊亂,如絨毛萎縮、粘連或脫落,且高脂顯著降低草魚(yú)幼魚(yú)腸道絨毛高度和絨毛寬度。Zhao等[48]也研究發(fā)現(xiàn),高脂飼料飼養(yǎng)斑馬魚(yú)的腸道絨毛萎縮,絨毛高度顯著下降。在本研究中,與NFD組相比,HFD組青魚(yú)幼魚(yú)腸道絨毛高度和肌層厚度顯著降低,而在高脂飼料中添加適量槲皮素可以提高青魚(yú)腸道絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度,說(shuō)明槲皮素可以改善高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)的腸道組織形態(tài),有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。

3.5 槲皮素對(duì)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道菌群的影響

魚(yú)類腸道菌群在維持腸道健康、促進(jìn)腸道發(fā)育、抵御病原侵襲以及促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和脂代謝等方面均具有重要的作用[49]。Liu等[47]研究表明,高脂飼料飼養(yǎng)草魚(yú)腸道菌群Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均有所降低。但也有報(bào)道稱,高脂脅迫未顯著改變大口黑鱸[50]、斑馬魚(yú)[48,51]腸道菌群的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和ACE指數(shù),本試驗(yàn)結(jié)果與之類似。羅君等[52]在基礎(chǔ)飼料中添加0.381 g/kg的槲皮素-5′-磺酸鈉可顯著提高雜交石斑魚(yú)腸道菌群的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。本研究中,高脂飼料中添加600和900 mg/kg槲皮素可提高青魚(yú)腸道菌群的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù),這表明在高脂飼料中添加適量槲皮素有利于提高青魚(yú)腸道菌群的alpha多樣性。

本研究中,在門水平上,青魚(yú)幼魚(yú)腸道菌群主要為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門。這與黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)[53]的腸道菌群組成類似。有研究指出,變形菌門是腸道炎癥的特征微生物[54],擬桿菌門可作為衡量動(dòng)物腸道健康的指標(biāo)[55],而厚壁菌門和放線菌門在促進(jìn)魚(yú)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收及代謝中起著重要作用[56-57]。腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù)可作為評(píng)價(jià)魚(yú)類腸道菌群結(jié)構(gòu)特征的參數(shù),能有效反映飼料對(duì)菌群組成的總體影響,其值較高表明魚(yú)體的健康狀況較佳[58-59]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在門水平上,高脂飼料中添加槲皮素提高了高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)腸道厚壁菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度以及腸道菌群穩(wěn)態(tài)指數(shù),而降低了變形菌門的相對(duì)豐度。在屬水平上,主要有益菌為乳球菌屬[60]和紅桿菌屬[61],主要有害或潛在有害菌為不動(dòng)桿菌屬[62]、鄰單胞菌屬[63]和氣單胞菌屬[62]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在屬水平上,有益菌相對(duì)豐度隨槲皮素添加量的增加有升高的變化趨勢(shì),而有害菌相對(duì)豐度呈下降的變化趨勢(shì)。在門和屬水平上的研究結(jié)果表明,槲皮素可以使一些有益菌的相對(duì)豐度提高,而使有害菌的相對(duì)豐度降低。以前也有類似的研究報(bào)道,Porras等[64]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素干預(yù)后顯著降低了高脂飼料飼養(yǎng)小鼠腸道變形菌門的相對(duì)豐度,而提高了擬桿菌門的相對(duì)豐度。以上研究表明,槲皮素可調(diào)節(jié)高脂所誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂,改善腸道菌群的組成。

青魚(yú)腸道菌群的功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),在高脂飼料中添加適量的槲皮素,與脂代謝、其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、能量代謝、萜類和聚酮類化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子和維生素代謝、其他氨基酸代謝以及聚糖生物合成和代謝等有關(guān)代謝功能的通路豐度有所升高,免疫性疾病、心血管疾病等有關(guān)疾病的通路豐度有所降低,這表明槲皮素可以促進(jìn)腸道菌群參與機(jī)體代謝過(guò)程,提高機(jī)體的抗病力。這可能與槲皮素提高了青魚(yú)腸道門水平上厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度,降低了變形菌門的相對(duì)豐度有關(guān)。

4 結(jié) 論

高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)導(dǎo)致其生長(zhǎng)性能下降以及氧化應(yīng)激損傷,出現(xiàn)脂代謝和肝臟、腸道組織病理學(xué)異常以及腸道菌群紊亂;而在高脂飼料中添加適量槲皮素(600～900 mg/kg)可促進(jìn)高脂飼料飼養(yǎng)青魚(yú)的生長(zhǎng),增強(qiáng)其抗氧化能力,促進(jìn)脂代謝,減少魚(yú)體脂肪過(guò)度沉積,改善腸道菌群組成。