苜蓿源miR168b通過靶向肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖、凋亡和脂滴積累的調(diào)控研究

賈晶瑩 劉寶寶 蔡小艷*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2.寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細(xì)胞育種重點實驗室,銀川 750021)

奶牛乳腺由汗腺衍生而來,屬于外分泌腺?？傮w上乳腺分為實質(zhì)和間質(zhì)2部分,實質(zhì)主要由乳腺上皮細(xì)胞構(gòu)成,具有合成、分泌和泌乳功能[1]。乳腺上皮細(xì)胞實現(xiàn)泌乳功能過程受到miRNAs的調(diào)節(jié)。如miR-486高表達(dá)促進(jìn)了奶牛細(xì)胞的活性及增殖能力,同時增加了乳糖、乳脂以及乳蛋白的含量;miR-148a高表達(dá)顯著提高了水牛乳腺上皮細(xì)胞的活力,促進(jìn)了細(xì)胞增殖[2-3]。因此,研究miRNAs對乳腺上皮細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)和影響,對探究miRNAs影響乳腺上皮細(xì)胞生物泌乳具有重要作用和意義。

除了牛自身miRNAs以外,在牛血液中還檢測到有外源性植物miR168等miRNAs的出現(xiàn)[4]。生物信息分析也發(fā)現(xiàn),牛、小鼠和人類樣本中有植物miRNAs,其中5條植物miRNAs在牛的樣本中顯著高表達(dá),這些miRNAs主要來自水稻和苜蓿[5]。苜蓿源miR5754被發(fā)現(xiàn)有跨界調(diào)控功能,可以通過降低人體肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(MALAT1)的穩(wěn)定性減少癌細(xì)胞增殖;苜蓿中的miR162被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控牛奶乳蛋白的作用[6-7]。由此可見,苜蓿源miRNAs(mtr-miRNAs)具備遺傳調(diào)節(jié)因子和類營養(yǎng)物質(zhì)的雙重特性,能夠跨界對人體癌細(xì)胞及奶牛乳品質(zhì)產(chǎn)生調(diào)控作用。因此,探究mtr-miRNAs對奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)增殖和凋亡的影響,對明確苜蓿對牛奶產(chǎn)量與品質(zhì)的分子調(diào)控機(jī)制有著重要意義。

2012年,張辰宇教授在犢牛血液中檢測到了植物源miR168,并且靶向低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(LDLRAP1)調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝[4]。本課題組前期研究結(jié)果表明,苜蓿源miR168b(mtr-miR168b)的確可以在奶牛體內(nèi)檢測到,并且通過靶向奶牛體內(nèi)基因發(fā)揮調(diào)控作用。奶牛乳腺上皮細(xì)胞是奶牛乳汁生成和分泌的主要部位。那么mtr-miR168b是否能夠?qū)MECs的增殖、凋亡與脂質(zhì)生成產(chǎn)生調(diào)控作用?本研究基于對這一問題的思考特異性高表達(dá)了mtr-miR168b并敲低了其靶基因肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A(CPT1A)在BMECs中的表達(dá)水平,檢測mtr-miR168b高表達(dá)對BMECs增殖、凋亡和細(xì)胞內(nèi)脂滴生成的影響,以期為后續(xù)研究mtr-miRNAs影響牛奶產(chǎn)量與乳品質(zhì)提供分子層面的支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BMECs和HEK-293T細(xì)胞來自課題組前期保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將BMECs和HEK-293T在含有胎牛血清(10%)、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的基礎(chǔ)DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng),在5% CO2、37 ℃的恒溫加濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加5 μg/mL的胰島素、5 μg/mL的氫化可的松和20 ng/mL的催乳素即為誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)每2 d更換1次培養(yǎng)基,每4 d收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑為Lipo 3000,mtr-miR168b序列模擬物(mtr-miR168b mimics)、mtr-miR168b mimics陰性對照物(NC)、靶基因干擾和干擾片段陰性對照(si-NC)片段委托生物公司合成,通過轉(zhuǎn)染實現(xiàn)在細(xì)胞水平高表達(dá)miRNAs或干擾靶基因表達(dá),轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。對于進(jìn)行誘導(dǎo)試驗的細(xì)胞處理組,轉(zhuǎn)染48 h后更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo),此時記為誘導(dǎo)0 d。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后6、12、24、36和48 h進(jìn)行CCK8檢測,檢測前1 h在孔內(nèi)加入10 μL的CCK8溶液。1 h后使用酶標(biāo)儀檢測每孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力計算公式如下:

式中:A(mimic)為具有細(xì)胞、CCK8溶液和mimic溶液培養(yǎng)孔的吸光度;A(空白)為具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞培養(yǎng)孔的吸光度;A(0)為具有細(xì)胞而無mimic溶液的培養(yǎng)孔的吸光度。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)試驗。參照EdU說明書進(jìn)行試驗試劑配制。使用前將配制好的EdU工作液預(yù)熱至37 ℃。EdU工作液與細(xì)胞培養(yǎng)液等體積加入6孔板,使EdU終濃度為10 μmol/L。孵育2 h后,加入固定液固定細(xì)胞15 min。細(xì)胞清洗干凈后加入通透液,室溫孵育15 min。清洗干凈后,每孔加入500 μL Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min。清洗干凈后,加入1×Hoechst 33342 1 mL,室溫孵育10 min。再次清洗細(xì)胞,清洗干凈后使用熒光倒置顯微鏡拍攝熒光圖片。

1.2.4 細(xì)胞周期與凋亡檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,分別使用凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期和凋亡分析試劑盒,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期階段。為了檢測細(xì)胞凋亡,用胰蛋白酶消化細(xì)胞。終止消化后將細(xì)胞收集在1.5 mL離心管中,1 000×g離心5 min,去除上清液,并將細(xì)胞重新懸浮在1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中。接下來,將細(xì)胞在50 ℃的水浴中孵化適當(dāng)時間刺激細(xì)胞凋亡。離心收集細(xì)胞,棄去上清液,在細(xì)胞顆粒中加入195 μL V-FITC結(jié)合液、5 μL V-FITC和10 μL碘化丙啶(PI)。在室溫下黑暗中孵化20 min后,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。

為了確定細(xì)胞周期階段,在細(xì)胞懸浮后,再次離心,丟棄PBS。加入70%乙醇,吹打混合,在4 ℃下固定24 h。固定后的細(xì)胞再次離心,吸干乙醇后棄去,加入PBS重懸并清洗細(xì)胞,然后棄去。每管細(xì)胞加入500 μL LPI染色液后,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

提取轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞的總RNA,通過RT-qPCR對mtr-miR168b的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,使用U6作為內(nèi)參。同時對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測。收集轉(zhuǎn)染了si-NC和si-CPT1A的細(xì)胞進(jìn)行定量,檢測CPT1A表達(dá)水平敲低后對下游基因和脂質(zhì)代謝標(biāo)志基因表達(dá)水平的影響,使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。RT-qPCR反應(yīng)使用實時熒光定量PCR儀(CFX 96 Touch,Bio-Rad,美國)和TaKaRa定量試劑盒。反應(yīng)體系為預(yù)混液TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)10 μL,上、下游引物各0.4 μL,DNA樣品(100 ng/μL)2 μL,加入ddH2O將反應(yīng)體系補至20 μL。反應(yīng)程序如下:95 ℃,3 min;95 ℃,5 s;60 ℃,30 s;39個循環(huán),95 ℃,10 s。引物信息見表1。

續(xù)表1基因 Genes引物序列 Primer sequences (5′—3′)固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1 SREBP1F:CAATGTGTGAGAAGGCCAGTR:ACAAGGAGCAGGTCACACAG脂肪酸轉(zhuǎn)位酶36 CD36F:TCCTGGACCCTGAACACTR:ATAATGCCTTGCTGATGC脂蛋白脂肪酶 LPLF:ACGATTATTGCTCAGCATGGR:ACTTTGTACAGGCACAACCG肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1ACPT1AF:TTGCGGCCGCCTTAAGGGACAAGCGATTR:CCTCGAGCAGTCTGATGGAAGGGAA蛋白激酶BAKTF:TCACCATTACGCCACCTGACR:TCCTCTCCATCCTGTGTTGG哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTORF:TGGACACCAACAAGGACGACR:TCCCACTGACCTAAACCCCA

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)

收集轉(zhuǎn)染48 h后的BMECs,用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。每孔加入100 μg蛋白提取物,通過10%十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用阻斷液阻斷15 min,將膜與抗體進(jìn)行孵化。使用GAPDH(AB0036, 1∶3 000, Abways)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)(D220014, 1∶500, Sangon Biotech)、BAX(CY5059, 1∶500, Abways)的一級抗體,二級抗體為山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(ZB-2301,1∶20 000,ZSGB-生物)?；瘜W(xué)發(fā)光ECL Western blot系統(tǒng)(Tanon-5200)用于信號檢測,使用ImageJ軟件測量蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 氟硼二吡咯(Bodipy)染色

使用二甲基亞砜(DMSO)配制Bodipy工作液,被轉(zhuǎn)染的BMECs分別誘導(dǎo)至第0、4和8天時進(jìn)行Bodipy染色。染色前使用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞40 min。清洗干凈后加入Bodipy工作液,室溫避光染色30 min。再次清洗,加入4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液對細(xì)胞核進(jìn)行染色。清洗干凈后,使用熒光倒置顯微鏡拍攝熒光圖片。

1.2.8 雙熒光素酶報告靶基因

PCR擴(kuò)增CPT1A的序列,使用Primer Premier 5軟件設(shè)計包含mtr-miR168b種子區(qū)在內(nèi)的靶基因3′ UTR區(qū)引物(表1),并在引物5′端上分別添加XhoⅠ和NotⅠ的酶切位點和相應(yīng)的保護(hù)堿基。目的片段經(jīng)雙酶切和純化回收后,與Psicheck-2載體連接,構(gòu)建CPT1A與Psicheck-2野生型(WT-CPT1A)載體。基因突變型載體(MUT-CPT1A)委托生物公司合成,酶切位點與載體同上。將mtr-miR168b mimics和mtr-miR168b NC分別與構(gòu)建好的野生型和突變型載體共轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染試劑為Lipo 3 000。轉(zhuǎn)染48 h后,按照雙熒光素酶試劑盒說明書步驟收集細(xì)胞,對細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.2.9 油紅O染色

干擾CPT1A的細(xì)胞脂質(zhì)由油紅O進(jìn)行染色,根據(jù)試劑公司要求進(jìn)行試驗操作。將誘導(dǎo)0、4與8 d的細(xì)胞用PBS洗滌,加入4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗滌后加入油紅O染色液對細(xì)胞中的脂質(zhì)進(jìn)行染色,棄去染色液,PBS清洗至無多余染色液后加入Mayer蘇木素染色液對細(xì)胞核進(jìn)行染色。棄去Mayer蘇木素染色液后在顯微鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

RT-qPCR結(jié)果用2-ΔΔCt進(jìn)行處理,每組數(shù)據(jù)至少設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)學(xué)重復(fù)。使用GraphPad Prism 7軟件的t檢驗對RT-qPCR結(jié)果和雙熒光結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtr-miR168b表達(dá)水平檢測

RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染mtr-miR168b mimics和NC 48 h后mtr-miR168b的表達(dá)水平。結(jié)果表明,mimics組mtr-miR168b的表達(dá)水平極顯著高于NC組(P<0.01;圖1)。結(jié)果證明了轉(zhuǎn)染試驗特異性高表達(dá)了BMECs中mtr-miR168b,為后續(xù)檢測mtr-miR168b高表達(dá)對細(xì)胞增殖、凋亡和脂質(zhì)代謝提供了研究基礎(chǔ)。

*表示差異顯著(P<0.05); **表示差異極顯著(P<0.01);ns表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.2 mtr-miR168b高表達(dá)抑制BMECs活力

CCK8法測定mtr-miR168b高表達(dá)對BMECs活力的影響。結(jié)果表明,與NC組相比,轉(zhuǎn)染mtr-miR168b mimics組的細(xì)胞活力極顯著降低(P<0.01),并且隨著時間的推移,細(xì)胞活力也極顯著下降(P<0.01),但36 h后細(xì)胞活力不會再有顯著降低趨勢(P>0.05;圖2)。

2.3 mtr-miR168b高表達(dá)抑制BMECs增殖

通過EdU熒光染色檢測mtr-miR168b高表達(dá)后對BMECs增殖的影響。紅色熒光顯示的是加入染色液孵育2 h內(nèi)新增長細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色,藍(lán)色熒光為全部細(xì)胞的細(xì)胞核染色(圖3-a)。試驗結(jié)果表明,mtr-miR168b高表達(dá)極顯著抑制了細(xì)胞增殖(P<0.01;圖3-b)。RT-qPCR結(jié)果表明,mtr-miR168b mimics組細(xì)胞增殖標(biāo)志基因CDK4和PCNA的表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01; 圖3-c)。

2.4 mtr-miR168b高表達(dá)對細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測mtr-miR168b高表達(dá)后BMECs的細(xì)胞周期。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mtr-miR168b后乳腺上皮細(xì)胞S期數(shù)量減少,G1期數(shù)量增加,說明G1～S期進(jìn)程被延長,細(xì)胞增殖受到抑制。細(xì)胞周期標(biāo)志基因CyclinD1和CyclinD2表達(dá)水平也極顯著降低(P<0.01;圖4)。

a: 與NC組相比,mimics組細(xì)胞活力降低; b: mimics組隨著時間推移細(xì)胞活力下降。

2.5 mtr-miR168b高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡結(jié)果(圖5)顯示,與NC組相比,mtr-miR168b高表達(dá)極顯著促進(jìn)了BMECs的凋亡(P<0.01);同時細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因BAX表達(dá)水平極顯著增高(P<0.01)。對PCNA和BAX的蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,Western blot蛋白條帶顯示,與NC組相比,mimics組PCNA蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01),BAX蛋白表達(dá)水平極顯著增加(P<0.01),這與定量結(jié)果一致。

同時,對AKT和mTOR基因進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平均有顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),推測mtr-miR168b通過AKT-mTOR信號通路調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和凋亡(圖5)。

2.6 mtr-miR168b高表達(dá)降低BMECs脂滴含量

對誘導(dǎo)0、4和8 d的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行Bodipy染色。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染mtr-miR168b mimics的細(xì)胞熒光強(qiáng)度均低于NC組,mtr-miR168b能夠減少Bodipy著色細(xì)胞數(shù),降低脂滴含量(圖6)。

CDK4:細(xì)胞增殖基因周期蛋白依賴性激酶4 cell proliferation gene cyclin dependent kinase 4;PCNA:增殖細(xì)胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen。

Cyclin D1:細(xì)胞周期蛋白D1;Cyclin D2:細(xì)胞周期蛋白D2。

2.7 mtr-miR168b靶基因驗證

為了明確mtr-miR168b對BMECs的調(diào)控機(jī)制,通過RT-qPCR和雙熒光素酶報告驗證了mtr-miR168b與CPT1A基因的靶向關(guān)系。試驗首先檢測了mtr-miR168b高表達(dá)后細(xì)胞中CPT1A基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明,mimics組CPT1A基因表達(dá)水平較NC組極顯著降低(圖7-a;P<0.01)。構(gòu)建CPT1A基因野生型和突變型載體進(jìn)行雙熒光素酶報告靶基因(圖7-b)。結(jié)果顯示:WT-CPT1A+mtr-miR168b mimics組較WT-CPT1A+mtr-miR168b NC組熒光素酶活性極顯著下降(P<0.01);MUT-CPT1A+mtr-miR168b mimics組與MUT-CPT1A+mtr-miR168b NC組熒光素酶活性差異不顯著(圖7-c;P>0.05),這證明mtr-miR168b與CPT1A基因具有靶向關(guān)系。

2.8 mtr-miR168b靶基因CPT1A干擾片段的篩選

為了揭示CPT1A對BMECs脂質(zhì)代謝的作用,用特異性siRNA對CPT1A進(jìn)行沉默。委托公司合成3條CPT1A基因的干擾片段,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞檢測CPT1A表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)干擾1 002位點,80 nmol/L濃度下干擾效率最高(圖8-a、圖8-b)。后續(xù)試驗均按上述條件對CPT1A基因進(jìn)行干擾。si-CPT1A轉(zhuǎn)染后,同時對CPT1A下游基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)CPT1A下游基因的表達(dá)均受到極顯著抑制(P<0.01;圖8-c)。

BAX:Bcl2關(guān)聯(lián)X蛋白;Bcl2-associated X protein;PCNA:增殖細(xì)胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;AKT:蛋白激酶B protein kinase B;mTOR:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin。

圖6 mtr-miR168b高表達(dá)后Bodipy染色

a: RT-qPCR檢測CPT1A基因表達(dá)水平;b: mtr-miR168b與構(gòu)建的靶基因載體序列比對;c:相對熒光素酶活性檢測靶基因。

CPT2:肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2 carnitine palmitoyl transferase 2;ACADL:?；o酶A脫氫酶長鏈acyl-CoA dehydrogenase long chain;ACADVL:極長鏈?；o酶 A脫氫酶 very long chain acyl-CoA dehydrogenase;ACADM:酰基輔酶A脫氫酶中鏈 acyl-CoA dehydrogenase middle chain。

2.9 CPT1A敲低對BMECs活力和凋亡的影響

CCK8法測定CPT1A敲低對BMECs活力的影響。結(jié)果表明,與si-NC組相比,轉(zhuǎn)染si-CPT1A組的細(xì)胞活力極顯著降低(P<0.01),并且隨著時間的推移細(xì)胞活力也極顯著下降(P<0.01;圖9-a、圖-b)。同時,對增殖標(biāo)志基因CDK4、PCNA和CyclinD1進(jìn)行定量,定量結(jié)果顯示上述基因表達(dá)水平在si-CPT1A組極顯著降低(P<0.01;圖9-c),這與CCK8結(jié)果一致。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,si-CPT1A組晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量增加(圖9-d)。上述結(jié)果趨勢與mtr-miR168b高表達(dá)結(jié)果趨勢一致。

2.10 CPT1A敲低對BMECs脂質(zhì)代謝基因和脂滴積累的影響

CPT1A沉默后,CD36、PPARγ、SCD1、CEBP/β、SREBP1和LPL等基因在BMECs中的表達(dá)水平均極顯著下調(diào)(P<0.01),證明CPT1A沉默后抑制了BMECs中脂質(zhì)代謝過程(圖10-a)。此外,油紅O結(jié)果顯示,si-CPT1A減少了BMECs中脂滴的生成(圖10-b),Bodipy結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染si-CPT1A組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度均低于si-NC組,證明si-CPT1A降低脂滴含量(圖11)。上述結(jié)果表明,mtr-miR168b的靶基因CPT1A表達(dá)水平降低,可以抑制BMECs中脂肪的生成,與高表達(dá)mtr-miR168結(jié)果一致。

3 討 論

3.1 mtr-miR168b過表達(dá)調(diào)節(jié)BMECs增殖和凋亡

乳腺(乳房)能夠分泌乳汁滋養(yǎng)新生兒,是將哺乳動物與其他動物區(qū)分開的重要器官。哺乳動物的乳腺會隨著動物胚胎期、青春期和生殖期分階段發(fā)育,同時,乳腺也是動物成年后唯一一個還能夠進(jìn)行分化的器官[8]。

CDK4:細(xì)胞增殖基因周期蛋白依賴性激酶4 cell proliferation gene cyclin dependent kinase 4;PCNA:增殖細(xì)胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen;Cyclin D1:細(xì)胞周期蛋白D1。

研究人員通過深入研究確定了部分miRNAs調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的信號通路,明確了其調(diào)控機(jī)制。如miR-24-3p通過靶向多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤致病因子1(MEN1)基因調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖,并對乳蛋白含量產(chǎn)生影響;miR-103通過靶向磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3R1)調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路,進(jìn)而增加了細(xì)胞增殖,促進(jìn)了BMECs脂肪酸的合成;miR-21被上游基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)調(diào)控,同時靶向胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP5),通過該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖[9-11]。上述研究均為miRNAs促進(jìn)細(xì)胞增殖,對奶牛泌乳具有正向影響,但同時,也有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖。如miR-139高表達(dá)抑制了乳腺上皮細(xì)胞的增殖,降低了β酪蛋白的蛋白含量;miR-221和miR-15a抑制細(xì)胞增殖和活力,降低泌乳量[12-13]。這些miRNAs與本試驗研究的mtr-miR168b具有相似的調(diào)控結(jié)果,即通過調(diào)控相關(guān)信號通路抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。故根據(jù)先前研究進(jìn)展,推測mtr-miR168b對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的泌乳功能和乳品質(zhì)可能也具有負(fù)向影響。這與張辰宇教授研究發(fā)現(xiàn)的植物miR168靶向低密度脂蛋白受體銜接蛋白1(LDLRAP1)抑制機(jī)體脂質(zhì)代謝的作用相似[4]。不過苜蓿作為優(yōu)質(zhì)牧草,含有多種miRNAs,其他miRNAs可能對乳脂具有正向調(diào)控作用。并且miRNAs具有多靶向的調(diào)節(jié)特點,同一miRNAs靶向結(jié)合不同的基因?qū)C(jī)體的調(diào)節(jié)作用并不一致,本試驗研究結(jié)果只能表明mtr-miR168b對BMECs的調(diào)節(jié)作用,并不能代表苜蓿整體對奶牛的影響。

PPARγ:過氧化物酶體增殖物活化受體γ peroxisome proliferator activated receptor gamma;SCD1:硬脂酰輔酶A去飽和酶1 stearoyl CoA desaturase 1;CEBP/β:轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β transcription factor CCAAT enhancer binding protein β;SREBP1:固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1 sterol regulatory element binding protein1; CD36:脂肪酸轉(zhuǎn)位酶36 fatty acid translocator 36;LPL:脂蛋白脂肪酶 lipoprotein lipase。

圖11 si-CPT1A后Bodipy染色

3.2 mtr-miR168b過表達(dá)調(diào)節(jié)BMECs增殖和凋亡的信號通路

AKT-mTOR信號通路是一個較為典型的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的通路,被完全激活的AKT-mTOR信號通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡[14]。AKT-mTOR信號通路表達(dá)水平降低,會抑制細(xì)胞增殖,有助于細(xì)胞周期停滯;而激活A(yù)KT-mTOR信號通路則會促進(jìn)細(xì)胞增殖[15-17]。前期課題組生物信息學(xué)分析預(yù)測結(jié)果表明,mtr-miR168b的靶基因顯著富集在mTOR信號通路,并且mtr-miR168b跨界靶向的CPT1A基因處于AKT-mTOR信號通路,對其具有調(diào)節(jié)作用[18]。為了明確mtr-miR168b對細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)節(jié)作用的信號通路,試驗檢測了mtr-miR168b高表達(dá)對AKT和mTOR基因的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),mtr-miR168b高表達(dá)抑制了AKT和mTOR的基因表達(dá)水平。此外,前期研究結(jié)果還表明,mtr-miR168b通過靶向相關(guān)靶基因參與AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)信號通路的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞內(nèi)ATP消耗和AMP水平增加會導(dǎo)致能量應(yīng)激,同時激活A(yù)MPK,而長期能量應(yīng)激最終會誘發(fā)細(xì)胞凋亡[19-21]。這也與本試驗研究結(jié)果一致,即mtr-miR168b高表達(dá)激活了AMPK,導(dǎo)致能量應(yīng)激,最終造成凋亡細(xì)胞數(shù)量增多。結(jié)合前期結(jié)論與本研究結(jié)果我們推測出了mtr-miR168b可能同時調(diào)控AKT-mTOR信號通路和AMPK信號通路影響細(xì)胞增殖與凋亡。

CyclinD1和CyclinD2表達(dá)水平降低表明細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng),細(xì)胞增殖能力減弱;PCNA和CDK4基因表達(dá)水平降低可抑制癌細(xì)胞增殖;BAX是凋亡標(biāo)志基因,基因與蛋白表達(dá)水平升高證明細(xì)胞凋亡水平升高[22-26]。對上述增殖與凋亡標(biāo)志基因和蛋白的水平檢測結(jié)果提示mtr-miR168b過表達(dá),可以抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,這與信號通路調(diào)控結(jié)果一致。

3.3 mtr-miR168b過表達(dá)調(diào)節(jié)BMECs脂滴生成

為了探究miRNAs對BMECs脂滴生成的影響,對細(xì)胞進(jìn)行了成脂誘導(dǎo)。隨著誘導(dǎo)時間延長,細(xì)胞凋亡數(shù)量增多,脂滴增多,導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少并且黏連情況嚴(yán)重,Bodipy染色結(jié)果隨著誘導(dǎo)時間的推移細(xì)胞形態(tài)不明顯。但熒光圖仍能看出mtr-miR168b高表達(dá)后BMECs中綠色熒光強(qiáng)度低于對照組,這表明mtr-miR168b高表達(dá)抑制BMECs中脂滴的生成,這會導(dǎo)致牛奶乳脂含量降低,與前期推論mtr-miR168b對BMECs的泌乳功能和乳品質(zhì)具有負(fù)向影響一致。

3.4 mtr-miR168b靶向CPT1A調(diào)節(jié)BMECs脂滴生成

為了進(jìn)一步了解mtr-miR168b的作用機(jī)制,試驗通過雙熒光報告驗證了mtr-miR168b的靶基因CPT1A。為了明確mtr-miR168b對脂滴生成的抑制作用是否通過靶基因CPT1A發(fā)揮作用,試驗?zāi)M了mtr-miR168b高表達(dá),CPT1A表達(dá)水平降低的情況下BMECs脂質(zhì)生成的情況。敲低CPT1A表達(dá)后,定量檢測發(fā)現(xiàn)CPT1A通路的下游基因和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)水平均顯著降低。CPT1A的下游基因長鏈酰基輔酶A脫氫酶(ACADL)、超長鏈酰基輔酶A脫氫酶(ACADVL)和中鏈?；o酶A脫氫酶(ACADM)基因均為?；o酶A脫氫酶,是參與脂肪酸代謝的重要輔酶家族。ACADL是催化脂肪酸氧化中第1步的催化酶,在長鏈脂肪酸β氧化中起著重要作用,其不足或缺失會造成線粒體功能紊亂進(jìn)而影響脂質(zhì)代謝[27]。ACADVL和ACADM基因都能夠參與脂質(zhì)代謝相關(guān)生物過程,影響脂肪酸和甘油的合成與分解,在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[28-30]?；蚨俊⒂图tO染色與Bodipy染色結(jié)果均表明CPT1A低表達(dá)影響了BMECs脂代謝,抑制細(xì)胞脂質(zhì)的生成,這與mtr-miR168b高表達(dá)抑制脂肪酸生成的結(jié)果一致,同時證實了研究的假設(shè),即mtr-miR168b通過靶向CPT1A調(diào)節(jié)BMECs脂質(zhì)生成。

4 結(jié) 論

① 高表達(dá)mtr-miR168b顯著抑制了BMECs的細(xì)胞活力,抑制了細(xì)胞的增殖,延長了細(xì)胞S～G1期,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,降低了AKT和mTOR基因的表達(dá)水平。

② 高表達(dá)mtr-miR168b降低了BMECs中脂滴的積累。

③ 敲低mtr-miR168b的靶基因CPT1A后,BMECs活力被抑制,促進(jìn)了細(xì)胞晚期凋亡,下調(diào)CPT1A下游基因表達(dá)。

④ 敲低mtr-miR168b的靶基因CPT1A后,降低了脂質(zhì)代謝標(biāo)志基因PPARγ、SCD1、CEBP/β、SREBP1、CD36和LPL的表達(dá)水平,抑制了BMECs脂滴積累。