不同品種羔羊胃腸道微生物發(fā)育規(guī)律的比較研究

劉 潔 李 偉 李 鑫 任二軍 劉進(jìn)軍 王朋然 韓學(xué)良 張英杰

(1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院,石家莊 050041;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071000)

動(dòng)物的胃腸道定植著復(fù)雜和多樣的微生物菌群,共生微生物對宿主健康在平衡免疫反應(yīng)、消化營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)節(jié)宿主生理等方面有著至關(guān)重要的作用。遺傳背景對胃腸道微生物的結(jié)構(gòu)和組成具有較大影響,每個(gè)動(dòng)物機(jī)體胃腸道都含有屬于自己的微生物組。胃腸道微生物對于植物纖維的消化、動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康都具有重要作用,但是微生物特征的遺傳性、宿主遺傳成分與瘤胃微生物的關(guān)聯(lián),以及這些遺傳成分與宿主生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)目前還是未知。研究表明,動(dòng)物胃腸道微生物菌群差異的原因主要包括宿主基因型、宿主年齡、宿主飼糧等[1-8]。宿主基因型的多樣性可引起胃腸道菌群不同,每個(gè)動(dòng)物機(jī)體胃腸道都含有屬于自己的微生物組,遺傳背景對胃腸道微生物的結(jié)構(gòu)和組成的具有非常大的影響[9-10]。不同物種間胃腸道菌群多樣性差異顯著[11-12]。在同一飲食和管理?xiàng)l件下的同一物種,不同品種的動(dòng)物胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和組成也存在一定差異[13-17]。

道賽特羊?qū)偃庥眯途d羊引入品種,原產(chǎn)于澳大利亞和新西蘭,具有生長發(fā)育快、體型大、肉用性能好、常年發(fā)情、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[18]。湖羊原產(chǎn)于太湖流域的浙江和江蘇一帶,具有性成熟早、繁殖力高、四季發(fā)情、前期生長速度較快、耐濕熱、耐粗飼、宜舍飼、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)良性狀[19]。小尾寒羊原產(chǎn)于黃河流域的山東、河北及河南一帶,具有性成熟早、繁殖率高、生長發(fā)育快、屠宰率高、肉質(zhì)細(xì)嫩、裘用價(jià)值高、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)良特點(diǎn)[20]。湖羊和小尾寒羊均是我國著名的綿羊品種,優(yōu)點(diǎn)是繁殖性能高、產(chǎn)羔多,但生長速度相對國外引進(jìn)專門化肉羊品種較慢。從開食到斷奶前后是羔羊生長和消化系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵階段,雖然羔羊抗病力差,易發(fā)生腹瀉等疾病,但不同品種羔羊在補(bǔ)料和斷奶等關(guān)鍵環(huán)節(jié)表現(xiàn)出的生長潛力和抗逆性不同。微生物參與動(dòng)物的生長、發(fā)育、消化、吸收、營養(yǎng)、免疫、生物拮抗等方面的過程。研究表明,不同品種的動(dòng)物胃腸道微生物的種類雖然有可能具有一定的相似性,但其胃腸道內(nèi)的菌群的分布及數(shù)量仍然有一定的差異性,可能是導(dǎo)致不同品種具有不同生產(chǎn)特性的原因[21-28]。因此,本研究以道賽特羊、湖羊和小尾寒羊?yàn)檠芯繉ο?在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,通過高通量測序技術(shù)分析比較不同品種綿羊羔羊瘤胃和直腸菌群結(jié)構(gòu)的差異性,揭示不同品種羔羊胃腸道微生物發(fā)育規(guī)律,為研究羔羊胃腸道菌群和宿主關(guān)系及健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼糧

試驗(yàn)于2020年10月至2021年1月在河北省衡水市志豪牧業(yè)有限公司進(jìn)行。試驗(yàn)羔羊均來自同一批次開展同期發(fā)情和人工授精的純種繁育母羊,選取同一產(chǎn)房、胎次和性別相同的1日齡不同品種羔羊各10窩,均為單羔,其中道賽特羊、湖羊和小尾寒羊公羔各10只。15日齡從產(chǎn)房轉(zhuǎn)入母子圈,并開始補(bǔ)飼相同商品羔羊料(購自聯(lián)英飼料有限公司,主要由玉米、豆粕、玉米胚芽粕、石粉、氯化鈉等組成;營養(yǎng)水平為總能16.72 MJ/kg,粗蛋白質(zhì)18.03%,中性洗滌纖維23.16%,酸性洗滌纖維11.99%)。75日齡一次性斷奶,母羊轉(zhuǎn)移,羔羊留在母子圈,飼喂全混合日糧(total mixed ration,TMR),直至120日齡試驗(yàn)結(jié)束。TMR組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期內(nèi),所有試驗(yàn)羊均由固定人員進(jìn)行專門飼養(yǎng),每日分別在07: 00和16: 00各飼喂1次,自由采食和飲水。

表1 全混合日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集及測序分析

在羔羊出生后20(轉(zhuǎn)圈補(bǔ)料后)、70(斷奶前)、90(斷奶后)和120日齡(4月齡),晨飼前每組采集5只體重相近羔羊的瘤胃液和糞便樣品,瘤胃液采用瘤胃導(dǎo)管從口腔采集,糞便樣品通過佩戴一次性手套從直腸采集,迅速裝入2 mL無菌離心管中,置于液氮速凍,存放于-80 ℃冰箱保存待測。

瘤胃和直腸微生物區(qū)系分析采用高通量測序Illumina MiSeq PE300平臺(北京奧維森基因科技有限公司)。細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)選用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)擴(kuò)增。真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)選用引物ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2(5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴(kuò)增。繪制韋恩圖分析共有操作分類單元(OTU)和特有OTU數(shù)量。采用Chao1指數(shù)、覆蓋度、觀測到的物種數(shù)、PD whole tree指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)分析Alpha多樣性。采用主坐標(biāo)分析(PCoA)方法評價(jià)Beta多樣性,并用相似性分析(ANOSIM)方法進(jìn)行OTU數(shù)量的組間差異檢驗(yàn)。比較相對豐度>1.0%的菌群在門水平和屬水平的組間差異。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019初步整理,采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙因素方差分析(two-way ANOVA),差異顯著者采用Duncan氏法分析進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著,0.05≤P<0.10為有顯著趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌區(qū)系

2.1.1 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌特異性分析

由圖1可知,20日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃細(xì)菌共計(jì)2 938個(gè)OTU,共有OTU為928個(gè),占總OTU的31.59%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為1 873、1 705和2 151個(gè),特有OTU分別為213、291和571個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖1-A)。70日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃細(xì)菌共計(jì)2 058個(gè)OTU,共有OTU為976個(gè),占總OTU的47.42%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為1 681、1 378和1 537個(gè),特有OTU分別為215、112和169個(gè);道賽特羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖1-B)。90日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃細(xì)菌共計(jì)2 631個(gè)OTU,共有OTU為1 440個(gè),占總OTU的54.73%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為2 044、2 090和2 111個(gè),特有OTU分別為163、125和169個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖1-C)。120日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃細(xì)菌共計(jì)2 380個(gè)OTU,共有OTU為1 360個(gè),占總OTU的57.14%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為1 953、1 801和1 949個(gè),特有OTU分別為136、95和186個(gè);道賽特羊OTU數(shù)量最多,小尾寒羊特有OTU數(shù)量最多(圖1-D)。

DL20:20日齡道賽特羊;HL20:20日齡湖羊;XL20:20日齡小尾寒羊;DL70:70日齡道賽特羊;HL70:70日齡湖羊;XL70:70日齡小尾寒羊;DL90:90日齡道賽特羊;HL90:90日齡湖羊;XL90:90日齡小尾寒羊;DL120:120日齡道賽特羊;HL120:120日齡湖羊;XL120:120日齡小尾寒羊。下圖同。

2.1.2 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌Alpha多樣性分析

由表2可知,小尾寒羊瘤胃細(xì)菌PD whole tree指數(shù)顯著高于湖羊(P<0.05),與道賽特羊之間差異不顯著(P>0.05)。日齡對瘤胃細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

表2 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌Alpha多樣性分析

2.1.3 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌Beta多樣性分析

由圖2可知,基于Bray-Curtis的主坐標(biāo)分析聯(lián)合相似性分析結(jié)果表明,20和90日齡時(shí),不同品種之間瘤胃細(xì)菌群落差異顯著(P<0.05);其他日齡時(shí),不同品種之間瘤胃細(xì)菌群落差異不顯著(P>0.05)。

2.1.4 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌結(jié)構(gòu)分析

由表3可知,在瘤胃細(xì)菌門水平上(相對豐度>1.0%),道賽特羊和湖羊的互養(yǎng)菌門相對豐度顯著高于小尾寒羊(P<0.05),道賽特羊和湖羊之間差異不顯著(P>0.05)。日齡顯著影響羔羊的擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和互養(yǎng)菌門相對豐度(P<0.05),對變形菌門相對豐度無顯著影響(P>0.05)。

由表4可知,在瘤胃細(xì)菌屬水平上(相對豐度>1.0%),小尾寒羊理研菌科RC-9腸道群和克里斯滕森菌科R-7群相對豐度顯著高于道賽特羊和湖羊(P<0.05),道賽特羊和湖羊之間差異不顯著(P>0.05);小尾寒羊瘤胃球菌科NK4A214群和厭氧弧菌屬相對豐度顯著高于湖羊(P<0.05),與道賽特羊之間差異不顯著(P>0.05);不同品種之間其他菌屬相對豐度均差異不顯著(P>0.05),小尾寒羊普雷沃氏菌屬相對豐度表現(xiàn)出降低的趨勢(P=0.063)。日齡顯著影響羔羊的普雷沃氏菌屬、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌屬、普雷沃氏菌科NK3B31群、克里斯滕森菌科R-7群、毛螺菌科NK3A20群相對豐度(P<0.05),對其他菌屬相對豐度無顯著影響(P>0.05)。

2.2 不同品種羔羊瘤胃真菌區(qū)系

2.2.1 瘤胃真菌特異性分析

由圖3可知,20日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃真菌共計(jì)1 408個(gè)OTU,共有OTU為456個(gè),占總OTU的32.39%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為870、861和964個(gè),特有OTU分別為130、137和310個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖3-A)。70日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃真菌共計(jì)1 001個(gè)OTU,共有OTU為483個(gè),占總OTU的48.25%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為738、716和773個(gè),特有OTU分別為77、90和91個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖3-B)。90日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃真菌共計(jì)1 149個(gè)OTU,共有OTU為367個(gè),占總OTU的31.94%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為635、693和804個(gè),特有OTU分別為169、132和232個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖3-C)。120日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊瘤胃真菌共計(jì)1 609個(gè)OTU,共有OTU為455個(gè),占總OTU的28.28%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為1 081、1 037和749個(gè),特有OTU分別為366、312和128個(gè);道賽特羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖3-D)。

PC1:主坐標(biāo)1;PC2:主坐標(biāo)2。圖4、圖6和圖8同。

表3 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌門水平的相對豐度(相對豐度>1.0%)

續(xù)表3項(xiàng)目Items品種 Breed道賽特羊Dorset lambs湖羊Hulambs小尾寒羊Small tail Hanlambs日齡 Day of age207090120SEMP值 P-value品種Breed日齡Day of age品種×日齡Breed×day of age互養(yǎng)菌門Synergistota0.42a0.32a0.08b0.94b2.90a0.19b0.35b0.4190.0130.0220.001變形菌門Proteobacteria0.940.901.441.031.920.710.720.2160.4860.1250.076

表4 不同品種羔羊的瘤胃細(xì)菌屬水平的相對豐度(相對豐度>1.0%)

續(xù)表4項(xiàng)目Items品種 Breed道賽特羊Dorset lambs湖羊Hulambs小尾寒羊Small tail Hanlambs日齡 Day of age207090120SEMP值 P-value品種Breed日齡Day of age品種×日齡Breed×day of age克里斯滕森菌科R-7群Christensenellaceae_R-7_group1.09b1.13b2.07a2.25a1.65ab0.85b0.96b0.1860.0160.0060.010瘤胃球菌科NK4A214群Ruminococcaceae_NK4A214_group0.98ab0.81b1.37a1.480.960.910.870.1140.0450.0760.001厭氧弧菌屬Anaerovibrio0.85ab0.50b1.67a0.071.781.121.040.2370.1030.0740.496

圖3 不同品種羔羊瘤胃真菌韋恩圖

2.2.2 瘤胃真菌Alpha多樣性分析

由表5可知,不同品種羔羊瘤胃真菌Alpha多樣性指數(shù)均差異不顯著(P<0.05)。日齡顯著影響Chao1指數(shù)、觀測到的物種數(shù)、PD whole tree指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)(P<0.05),對覆蓋度無顯著影響(P>0.05)。

表5 不同品種羔羊的瘤胃真菌Alpha多樣性指數(shù)分析

2.2.3 瘤胃真菌Beta多樣性分析

由圖4可知,基于Bray-Curtis的主坐標(biāo)分析聯(lián)合相似性分析結(jié)果表明,20、70和90日齡時(shí),不同品種之間瘤胃真菌群落差異顯著(P<0.05);120日齡時(shí),不同品種之間瘤胃真菌群落差異不顯著(P>0.05)。

圖4 不同品種羔羊瘤胃真菌基于Bray-Curtis的主坐標(biāo)分析

2.2.4 瘤胃真菌結(jié)構(gòu)分析

由表6可知,在瘤胃真菌門水平上(相對豐度>1%),道賽特羊和湖羊子囊菌門相對豐度顯著高于小尾寒羊(P<0.05),道賽特羊和湖羊之間差異不顯著(P>0.05);小尾寒羊新美鞭菌門相對豐度顯著高于道賽特羊和湖羊(P<0.05),道賽特羊和湖羊之間差異不顯著(P>0.05);湖羊擔(dān)子菌門相對豐度表現(xiàn)出降低的趨勢(P=0.088)。日齡顯著影響羔羊的子囊菌門、擔(dān)子菌門和新美鞭菌門相對豐度(P<0.05)。

由表7可知,在瘤胃真菌屬水平上(相對豐度>1.0%),道賽特羊和小尾寒羊酵母菌屬和Symmetrospora相對豐度顯著高于湖羊(P<0.05),曲霉菌屬和念珠菌屬相對豐度顯著低于湖羊(P<0.05),道賽特羊和小尾寒羊之間差異不顯著(P>0.05);小尾寒羊盲腸菌屬和瘤胃壺菌屬相對豐度顯著高于道賽特羊和湖羊(P<0.05),道賽特羊和湖羊之間差異不顯著(P>0.05)。日齡顯著影響羔羊的酵母菌屬、青霉菌屬、Pseudoascochyta、曲霉菌屬、盲腸菌屬、鐮刀菌屬、籃狀菌屬、瘤胃壺菌屬、小囊菌屬、Symmetrospora、節(jié)丹菌屬和念珠菌屬相對豐度(P<0.05)。

表7 不同品種羔羊的瘤胃真菌屬水平的相對豐度(相對豐度>1.0%)

2.3 不同品種羔羊直腸細(xì)菌區(qū)系

2.3.1 直腸細(xì)菌特異性分析

由圖5可知,20日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊直腸細(xì)菌共計(jì)1 122個(gè)OTU,共有OTU為419個(gè),占總OTU的37.34%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為844、725和689個(gè),特有OTU分別為231、102和72個(gè);道賽特羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖5-A)。70日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊直腸細(xì)菌共計(jì)1 981個(gè)OTU,共有OTU為1 156個(gè),占總OTU的58.35%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為1 666、1 579和1 546個(gè),特有OTU分別為131、105和91個(gè);道賽特羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖5-B)。90日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊直腸細(xì)菌共計(jì)2 144個(gè)OTU,共有OTU為1 185個(gè),占總OTU的55.27%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為1 769、1 557和1 704個(gè),特有OTU分別為188、116和139個(gè);道賽特羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖5-C)。120日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊直腸細(xì)菌共計(jì)2 364個(gè)OTU,共有OTU為1 424個(gè),占總OTU的60.24%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為1 889、1 871和1 978個(gè),特有OTU分別為131、75和208個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖5-D)。

圖5 不同品種羔羊直腸細(xì)菌韋恩圖

2.3.2 直腸細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)分析

由表8可知,不同品種羔羊間直腸細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。日齡顯著影響Chao1指數(shù)、觀測到的物種數(shù)、PD whole tree指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)(P<0.05),對覆蓋度無顯著影響(P>0.05)。

表8 不同品種羔羊的直腸細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)分析

2.3.3 直腸細(xì)菌Beta多樣性分析

由圖6可知,基于Bray-Curtis的主坐標(biāo)分析聯(lián)合相似性分析表明,70日齡時(shí),不同品種之間直腸細(xì)菌群落差異顯著(P<0.05);其他日齡時(shí),不同品種之間直腸細(xì)菌群落差異不顯著(P>0.05)。

2.3.4 直腸細(xì)菌結(jié)構(gòu)分析

由表6可知,在直腸細(xì)菌門水平上(相對豐度>1.0%),不同品種羔羊之間各菌門相對豐度均差異不顯著(P>0.05),道賽特羊螺旋體門相對豐度表現(xiàn)出升高的趨勢(P=0.086)。日齡顯著影響羔羊的變形菌門、螺旋體門相對豐度(P<0.05),對厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和彎曲桿菌門相對豐度無顯著影響(P>0.05)。

由表10可知,在直腸細(xì)菌屬水平上(相對豐度>1.0%),不同品種羔羊之間各菌屬相對豐度均差異不顯著(P>0.05);道賽特羊密螺旋體屬相對豐度表現(xiàn)出升高的趨勢(P=0.086)。日齡顯著影響羔羊的UCG-005菌屬、擬桿菌屬、大腸桿菌-志賀菌屬、布勞特氏菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、理研菌科RC-9腸道群、瘤胃球菌屬、普雷沃菌科UCG-003、普雷沃氏菌屬、泰勒菌屬、Monoglobus、密螺旋體屬和毛螺菌科NK4A136群相對豐度(P<0.05),對其他菌屬相對豐度無顯著影響(P>0.05)。

2.4 不同品種羔羊直腸真菌區(qū)系

2.4.1 直腸真菌特異性分析

由圖7可知,20日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊直腸真菌共計(jì)914個(gè)OTU,共有OTU為262個(gè),占總OTU的28.67%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為597、480和626個(gè),特有OTU分別為140、81和166個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖7-A)。70日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊直腸真菌共計(jì)883個(gè)OTU,共有OTU為240個(gè),占總OTU的27.18%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為573、463和552個(gè),特有OTU分別為177、80和161個(gè);道賽特羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖7-B)。90日齡時(shí),3個(gè)品種羔羊直腸真菌共計(jì)1 233個(gè)OTU,共有OTU為305個(gè),占總OTU的24.74%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為673、805和788個(gè),特有OTU分別為146、127和232個(gè);小尾寒羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖7-C)。120日齡時(shí)3個(gè)品種羔羊直腸真菌共計(jì)1 209個(gè)OTU,共有OTU為474個(gè),占總OTU的39.21%;道賽特羊、湖羊和小尾寒羊OTU分別為828、871和774個(gè),特有OTU分別為118、177和124個(gè);湖羊OTU和特有OTU數(shù)量最多(圖7-D)。

表9 不同品種羔羊的直腸細(xì)菌門水平的相對豐度(相對豐度>1.0%)

表10 不同品種羔羊的直腸細(xì)菌屬水平的相對豐度(相對豐度>1.0%)

續(xù)表10項(xiàng)目Items品種 Breed道賽特羊Dorset lambs湖羊Hulambs小尾寒羊Small tail Hanlambs日齡 Day of age207090120SEMP值 P-value品種Breed日齡Day of age品種×日齡Breed×day of age克里斯滕森菌科R-7群Christensenellaceae_R-7_group3.21 2.72 3.36 0.79b3.69a3.80a4.11a0.3140.613 <0.0010.709 理研菌科RC-9腸道群Rikenellaceae_RC-9_gut_group2.22 2.48 2.57 0.06b3.45a2.80a3.38a0.2870.827 <0.0010.813 瘤胃球菌屬Ruminococcus2.45 2.81 1.90 0.38c2.92ab2.31b3.92a0.2520.163 <0.0010.696 密螺旋體屬Treponema3.28 1.24 1.46 0.02b1.95ab3.17a2.83a0.4320.086 0.036 0.477 普雷沃菌科UCG-003Prevotellaceae_UCG-0030.90 2.06 2.37 0.03b0.34b2.05ab4.69a0.5140.411 0.003 0.476 普雷沃氏菌屬Prevotella2.28 1.48 1.34 0.51b1.21b1.62b3.46a0.3120.321 0.003 0.126 毛螺菌科NK4A136群Lachnospiraceae_NK4A136_group1.42 2.18 1.27 0.91b1.73ab1.45ab2.41a0.1870.075 0.028 0.365 泰勒菌屬Yzzerella1.41 0.91 2.51 5.66a0.24b0.34b0.20b0.5430.344 <0.0010.258 另枝菌屬Alistipes1.60 1.61 1.35 0.99 1.86 1.76 1.46 0.1720.786 0.276 0.172 乳桿菌屬Lactobacillus2.79 0.59 1.00 4.79 1.04 0.01 0.00 0.7630.434 0.080 0.368 彎曲桿菌屬Campylobacter1.02 0.25 2.80 0.15 1.80 3.29 0.18 0.6130.224 0.219 0.628 考拉桿菌屬Phascolarctobacte-rium1.46 1.10 1.36 1.54 1.43 1.07 1.19 0.1510.648 0.722 0.948 Monoglobus1.19 1.47 1.20 0.03c1.34b1.11b2.67a0.1650.463 <0.0010.008 普雷沃氏菌科NK3B31群Prevotellaceae_NK3B31_group0.75 1.91 0.64 0.04 0.88 1.41 2.07 0.3980.357 0.324 0.366 毛螺菌科NK3A20群Lachnospiraceae_NK3A20_group1.01 1.23 0.97 0.73 1.58 1.35 0.60 0.178 0.788 0.123 0.070

圖7 不同品種羔羊直腸真菌韋恩圖

2.4.2 直腸真菌Alpha多樣性指數(shù)分析

由表11可知,湖羊直腸真菌的辛普森指數(shù)顯著高于道賽特羊(P<0.05),與小尾寒羊之間差異不顯著(P>0.05);不同品種羔羊之間其他Alpha多樣性指數(shù)均差異不顯著(P>0.05)。日齡顯著影響Chao1指數(shù)、觀測到的物種數(shù)、覆蓋度、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)(P<0.05),對PD whole tree指數(shù)影響不顯著(P>0.05)。

表11 不同品種羔羊的直腸真菌Alpha多樣性指數(shù)分析

2.4.3 直腸真菌Beta多樣性分析

由圖8可知,基于Bray-Curtis的主坐標(biāo)分析聯(lián)合相似性分析結(jié)果表明,90和120日齡時(shí),不同品種之間直腸真菌群落差異顯著(P<0.05);其他日齡差異不顯著(P>0.05)。

圖8 不同品種羔羊直腸真菌基于Bray-Curtis的主坐標(biāo)分析

2.4.4 直腸真菌結(jié)構(gòu)分析

由表12可知,在直腸真菌門水平上(相對豐度>1.0%),不同品種羔羊之間子囊菌門和擔(dān)子菌門相對豐度均差異不顯著(P>0.05)。日齡顯著影響羔羊的子囊菌門相對豐度(P<0.05),對擔(dān)子菌門相對豐度無顯著影響(P>0.05)。

表12 不同品種羔羊的直腸真菌門水平的相對豐度(相對豐度>1.0%)

由表13可知,在直腸真菌屬水平上(相對豐度>1.0%),小尾寒羊青霉菌屬相對豐度顯著高于道賽特羊和湖羊(P<0.05),道賽特羊和湖羊之間差異不顯著(P>0.05);湖羊曲霉菌屬顯著高于道賽特羊和小尾寒羊(P<0.05),道賽特羊和小尾寒羊之間差異不顯著(P>0.05);不同品種羔羊之間其他菌屬均差異不顯著(P>0.05)。日齡顯著影響羔羊的青霉菌屬、曲霉菌屬、酵母菌屬、籃狀菌屬、紅曲霉屬、Tausonia、小囊菌屬、枝孢屬和假殼二孢屬相對豐度(P<0.05),對節(jié)丹菌屬和木霉菌屬相對豐度均無顯著影響(P>0.05)。

表13 不同品種羔羊的直腸真菌屬水平的相對豐度(相對豐度>1.0%)

3 討 論

3.1 不同品種羔羊胃腸道微生物多樣性

胃腸道微生物主要由細(xì)菌、古生菌和真核生物(真菌和原蟲)構(gòu)成,隨著宿主的成長而不斷變化,在此過程中,微生物會受到如飼糧、日齡、宿主生活環(huán)境、抗生素以及親緣關(guān)系等多種因素的影響。宿主基因型是影響胃腸道微生物多樣性的因素之一。微生物多樣性對于維持穩(wěn)定的微生物群落起著至關(guān)重要的作用。崔浩然等[29]比較了35 kg體重的湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的差異性,發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種瘤胃細(xì)菌的特有OTU數(shù)量及占比不同,卡拉庫爾羊瘤胃菌群多樣性和豐富度極顯著高于湖羊。這與本試驗(yàn)結(jié)果相似,道賽特羊、湖羊和小尾寒羊3個(gè)品種羔羊瘤胃細(xì)菌特有OTU數(shù)量及占比不同,小尾寒羊具有較高的瘤胃細(xì)菌多樣性。研究表明,瘤胃細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)與飼料效率有關(guān),低飼料效率的個(gè)體擁有更復(fù)雜和多樣化的微生物群落[30-34]。Li等[35]對安格斯牛、夏洛萊牛和Kinsella牛3個(gè)品種肉牛瘤胃微生物組的影響及其與飼料效率的關(guān)系的研究表明,更多樣化的瘤胃微生物群落能夠發(fā)酵更廣泛的底物,但飼料轉(zhuǎn)化率較低,而“簡單瘤胃”可能會產(chǎn)生更多有效被宿主吸收和利用的產(chǎn)物。Shabat等[36]對奶牛飼料效率研究也得出了類似的結(jié)果,表明微生物組基因含量和類群豐富度越低,飼料效率越高。微生物多樣性可能成為一種新的生物標(biāo)志物或健康指標(biāo),雖然不同類型的微生物多樣性在宿主健康中的作用仍有待確定,但微生物多樣性可能與羔羊的生產(chǎn)性能有關(guān)[37]。在本試驗(yàn)中,小尾寒羊具有較高的瘤胃細(xì)菌多樣性,可能是在相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,小尾寒羊羔羊在3個(gè)品種中表現(xiàn)出較低生長速度、消化能和代謝能的原因。

Chang等[38]對1歲道賽特羊、小尾寒羊、西藏羊和杜泊羊4個(gè)不同品種綿羊的腸道細(xì)菌群落進(jìn)行研究,表明4個(gè)品種綿羊的OTU數(shù)量存在差異,西藏羊具有較低的OTU數(shù)量,而且細(xì)菌群落豐度和多樣性顯著低于其他3個(gè)品種綿羊。在本試驗(yàn)中,不同品種腸道菌群Alpha多樣性差異不顯著,70日齡時(shí)主坐標(biāo)分析差異顯著,這可能與羊只年齡有關(guān),本試驗(yàn)中羔羊均為4月齡內(nèi)羔羊,且腸道細(xì)菌多樣性受日齡顯著影響,可能是造成直腸細(xì)菌未表現(xiàn)出明顯的品種差異的原因。研究表明,胃腸道微生物多樣性指數(shù)隨動(dòng)物年齡的增長而升高[39]。微生物多樣性對維持穩(wěn)定的微生物群落起著至關(guān)重要的作用,較高的微生物多樣性與對環(huán)境較強(qiáng)適應(yīng)性和抵抗力密切相關(guān)[37]。Yin等[40]對0～4月齡湖羊羔羊糞便中細(xì)菌群落演替及其與血清免疫指標(biāo)相關(guān)性進(jìn)行研究,表明日齡顯著影響羔羊的生產(chǎn)性能、血清參數(shù)、糞便細(xì)菌群落和功能。本試驗(yàn)對胃腸道微生物多樣性的研究也得出相似結(jié)果,瘤胃和直腸細(xì)菌和真菌多樣性總體上隨日齡增長而增加,并且通過主坐標(biāo)分析和相似性分析表明不同品種羔羊瘤胃細(xì)菌和真菌群落在20、90日齡均存在顯著差異,這可能是造成不同品種羔羊在20(補(bǔ)料后)、90日齡(斷奶后)2個(gè)飼養(yǎng)關(guān)鍵階段免疫指標(biāo)和腹瀉率存在差異的原因。研究表明,幼齡反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落具有很強(qiáng)可塑性[41],提示在補(bǔ)料和斷奶應(yīng)激狀態(tài)下,可以通過外部干預(yù)進(jìn)行調(diào)控,引導(dǎo)瘤胃微生物菌群有序定植和健康發(fā)酵,以降低羔羊發(fā)病率和提高健康水平及后續(xù)生產(chǎn)性能。

3.2 不同品種羔羊胃腸道微生物群落組成

瘤胃微生物對植物纖維消化、動(dòng)物生產(chǎn)性能和健康都具有重要作用,腸道微生態(tài)系統(tǒng)與宿主的營養(yǎng)、代謝和免疫等方面密切相關(guān),反芻動(dòng)物胃腸道微生物能夠?qū)暭Z中營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可供反芻動(dòng)物吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì),同時(shí)對動(dòng)物代謝和健康也發(fā)揮著重要作用。研究表明,胃腸道中菌群的建立除受到飼糧、環(huán)境和疫病等因素影響外,宿主腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)與動(dòng)物的遺傳背景密切相關(guān),具有個(gè)體特異性,會因?yàn)閯?dòng)物品種遺傳學(xué)差異引起微生物群落相對豐度的差異[42-45]。張瑜等[46]比較了3～4歲都安山羊和努比亞山羊母羊的瘤胃微生物區(qū)系特征及品種之間的差異,結(jié)果表明都安山羊和努比亞山羊的瘤胃微生物優(yōu)勢菌群相似,但努比亞山羊隸屬于厚壁菌門的菌群相對豐度更高。Langda等[47]比較相同高原牧場的藏山羊和藏綿羊瘤胃微生物多樣性和組成的差異,發(fā)現(xiàn)2個(gè)物種的瘤胃細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物中厚壁菌門、擬桿菌門、新美鞭菌門和纖毛菌門相對豐度最高,但在多個(gè)分類水平上存在顯著差異,綿羊中新麗鞭菌科(Neocallimastigaceae)和后毛屬(Metadinium)相對豐度較高,山羊中則Saccharofermentans和毛螺菌科XPB1014(Lachnospiraceae_XPB1014)相對豐度較高。本試驗(yàn)與以上研究結(jié)果類似,3個(gè)品種羔羊的胃腸道菌群結(jié)構(gòu)具有相似性,瘤胃細(xì)菌和直腸細(xì)菌優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門和厚壁菌門,瘤胃真菌優(yōu)勢菌門為子囊菌門、擔(dān)子菌門和新美鞭菌門,直腸真菌優(yōu)勢菌門為子囊菌門和擔(dān)子菌門,但在一些特異性門屬的相對豐度上存在差異,道賽特羊的直腸細(xì)菌螺旋體門和密螺旋體屬相對豐度較高,螺旋體門屬于有益菌,可以有效降解纖維素、果膠和磷酸酯,發(fā)酵形成揮發(fā)性脂肪酸,為動(dòng)物機(jī)體提供能量[48-49],這可能是道賽特羊表現(xiàn)出較好生產(chǎn)性能的原因。

本試驗(yàn)中,小尾寒羊瘤胃細(xì)菌中普雷沃氏菌屬相對豐度較低,理研菌科RC-9腸道群和克里斯滕森菌科R-7群相對豐度較高。普雷沃氏菌屬作為反芻動(dòng)物的核心菌群,主要承擔(dān)發(fā)酵功能,不僅可以消化利用淀粉,還能降解非結(jié)構(gòu)性的碳水化合物和蛋白質(zhì)[50],理研菌科RC-9腸道群相對豐度與揮發(fā)性脂肪酸中丙酸含量和揮發(fā)性脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[51-52]。丙酸作為反芻動(dòng)物碳水化合物代謝中一種重要的揮發(fā)性脂肪酸,通過糖異生作用生成葡萄糖或者進(jìn)入三羧酸循環(huán)氧化供能?？死锼闺芌-7群與宿主體重指數(shù)呈負(fù)相關(guān)[53],本試驗(yàn)中,小尾寒羊瘤胃細(xì)菌中普雷沃氏菌屬相對豐度較低,理研菌科RC-9腸道群和克里斯滕森菌科R-7群相對豐度較高,以及瘤胃真菌中具有分解纖維功能的子囊菌門相對豐度較低,意味著小尾寒羊?qū)I養(yǎng)物質(zhì)的利用率較低,提示可能是小尾寒羊在生產(chǎn)中表現(xiàn)出相對較低生產(chǎn)性能的原因。研究表明,日齡是影響反芻動(dòng)物胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的重要因素,隨日齡增長,擬桿菌門、厚壁菌門、普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、密螺旋體菌屬等相對豐度逐漸升高,變形菌門、埃希氏菌屬、乳酸桿菌屬等相對豐度逐漸降低[54-56]。本試驗(yàn)對不同品種羔羊胃腸道微生物發(fā)育規(guī)律研究結(jié)果與以上研究相似,表明微生物群落組成受日齡顯著影響,部分菌群表現(xiàn)出隨日齡增長的規(guī)律變化,其中螺旋體門、子囊菌門、普雷沃氏菌屬、密螺旋體屬和青霉菌屬相對豐度隨日齡增長顯著增加,變形菌門、新美鞭菌門、大腸桿菌-志賀菌屬、克里斯滕森菌科R-7群、曲霉菌屬、盲腸菌屬相對豐度隨日齡增長顯著降低。胃腸道微生物相對豐度會隨著日齡增長而發(fā)生變化,其主要原因是幼齡動(dòng)物胃腸道處于逐漸發(fā)育的過程。本試驗(yàn)中,小尾寒羊胃腸道中普雷沃氏菌屬和子囊菌門相對豐度較低,新美鞭菌門和克里斯滕森菌科R-7群相對豐度較高,意味著小尾寒羊胃腸道發(fā)育相對較慢,提示這也可能是影響小尾寒羊生長和消化性能的因素。

4 結(jié) 論

小尾寒羊、湖羊和道賽特羔羊的胃腸道菌群多樣性和結(jié)構(gòu)具有相似性,也存在一定差異。小尾寒羊具有較高的瘤胃細(xì)菌多樣性,湖羊具有較高的直腸真菌多樣性,道賽特羊直腸細(xì)菌中螺旋體門和密螺旋體屬相對豐度較高,小尾寒羊瘤胃細(xì)菌中普雷沃氏菌屬相對豐度較低以及理研菌科RC-9腸道群和克里斯滕森菌科R-7群相對豐度較高。胃腸道微生物區(qū)系差異可能是導(dǎo)致不同品種羔羊生產(chǎn)性能差異的原因之一。