飼喂沉香葉對(duì)育肥黑山羊瘤胃微生物區(qū)系及其代謝物的影響

閔 力 吳林瑛 童 雄 譚 昇 孫 浩 張志飛 丁迪云 陳衛(wèi)東 徐 斌* 李大剛**

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640;2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室河源分中心,河源 517541;3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南省草地資源創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450046)

沉香(Aquilariasinensis)是瑞香科、沉香屬的一種極具藥用價(jià)值的植物,廣泛分布于我國(guó)華南熱帶、亞熱帶地區(qū)。迄今為止,沉香中超過249種的生物活性物質(zhì)已被分離和鑒定,具有廣泛的生物學(xué)功效[1]。沉香葉是沉香樹的非藥用部位,在沉香樹生長(zhǎng)過程中需要不斷修剪掉,其產(chǎn)量巨大。為了使沉香產(chǎn)業(yè)的商業(yè)價(jià)值最大化,除了沉香的藥用價(jià)值外,近年來也在進(jìn)行沉香葉的開發(fā)與利用[2]。

研究人員通過小鼠和臨床試驗(yàn)對(duì)沉香葉進(jìn)行了毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià),結(jié)果表明:食用沉香葉沒有毒副作用,無(wú)安全隱患[3]。Min等[4]對(duì)沉香葉的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其中含有41.85%的干物質(zhì)、37.10%的有機(jī)物、11.93%的粗蛋白質(zhì)、3.46%的粗脂肪、36.06%的中性洗滌纖維和31.25%的酸性洗滌纖維;能夠作為反芻動(dòng)物的非常規(guī)飼料原料進(jìn)行利用。研究發(fā)現(xiàn),與飼喂基礎(chǔ)飼糧的對(duì)照組相比,飼喂含有20%沉香葉飼糧的試驗(yàn)組3～6月齡育肥黑山羊的平均日采食量(705.4 g/d vs. 697.8 g/d)和平均日增重(53.7 g/d vs. 53.5 g/d)無(wú)顯著差異,但能夠在一定程度上降低飼料成本;在這個(gè)過程中,試驗(yàn)組黑山羊血液中的膽固醇含量顯著降低、血液中的高密度脂蛋白含量顯著提高,飼喂沉香葉導(dǎo)致黑山羊機(jī)體的脂肪分解代謝增強(qiáng);此外,試驗(yàn)組羊肉中的膽固醇含量也顯著降低(366.28 mg/kg vs. 889.02 mg/kg),更有利于人體健康[4]。在前期研究基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究飼糧中添加20%沉香葉對(duì)育肥黑山羊瘤胃微生物區(qū)系及其代謝物的影響,以期從瘤胃功能變化的角度進(jìn)一步完善飼喂沉香葉影響育肥黑山羊的機(jī)理,為沉香葉作為非常規(guī)飼料原料在黑山羊養(yǎng)殖中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用沉香葉采自廣東省陽(yáng)江市陽(yáng)西縣羊場(chǎng)周邊種植的沉香樹,其中營(yíng)養(yǎng)成分含量參見文獻(xiàn)[4]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

本研究是沉香葉作為飼料原料進(jìn)行的黑山羊飼養(yǎng)試驗(yàn)的系列研究的一個(gè)部分,其中試驗(yàn)設(shè)計(jì)、生長(zhǎng)性能和血液生化指標(biāo)等結(jié)果已經(jīng)發(fā)表[4]。在此,試驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)述如下:選取3月齡、體重(16.6±2.8) kg、健康的努比亞羊×雷州山羊雜交后代育肥閹公羊12只,隨機(jī)分為2組(每組6只),分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組)和含有20%沉香葉的試驗(yàn)飼糧(試驗(yàn)組)。對(duì)照組基礎(chǔ)飼糧參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)進(jìn)行配制,試驗(yàn)組試驗(yàn)飼糧使用20%的沉香葉(干物質(zhì)基礎(chǔ))部分替代對(duì)照組基礎(chǔ)飼糧中的青貯玉米秸稈和花生藤,并保持營(yíng)養(yǎng)水平基本一致,飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期90 d。每日于08:00和17:00各飼喂1次,試驗(yàn)羊自由采食,自由飲水。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣本采集

于試驗(yàn)的第90天對(duì)試驗(yàn)羊禁食12 h后空腹稱重,頸靜脈放血處死,迅速取出瘤胃液,倒入無(wú)菌袋中混合均勻后,經(jīng)4層紗布過濾分裝至滅菌的凍存管內(nèi),放入液氮罐中冷凍保存,備用。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 沉香葉中的生物活性物質(zhì)測(cè)定

將沉香葉樣品真空冷凍干燥,用研磨儀研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀。稱取100 mg 粉末,用0.6 mL 70%甲醇提取,于4 ℃冰箱過夜。10 000×g離心10 min,吸取上清液,采用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品,并保存于進(jìn)樣瓶中,用于生物活性物質(zhì)分析。

利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)系統(tǒng)(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A,Applied Biosystems 6500 QTRAP)對(duì)樣本進(jìn)行分析。液相和質(zhì)譜條件參考Cao等[5]的方法。

1.4.2 瘤胃微生物區(qū)系測(cè)定

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)結(jié)合酚-氯仿-異戊醇法提取瘤胃微生物的DNA,測(cè)定樣品DNA的濃度和純度,確保使用的DNA樣品的吸光度(OD)260/OD280在1.8～2.0。

選擇細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為:338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,進(jìn)行27個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 10 min[6]。

回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化,純化后的瘤胃微生物樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作,使用Illumina MiSeq PE 300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序服務(wù)委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.4.3 瘤胃液代謝組學(xué)分析

將瘤胃液樣品解凍,取50 μL樣品與150 μL預(yù)冷的冰甲醇(含1 μg/mL的2-氯苯丙氨酸)旋渦混勻,于1 2000 r/min、4 ℃下離心10 min后,取上清液進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析。液相條件為:色譜柱,Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18,1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流動(dòng)相,A相為超純水(0.1%甲酸),B相為乙腈(0.1%甲酸);洗脫梯度,0 min為水∶乙腈=95∶5(體積比,后同),11.0 min為水∶乙腈=10∶90,12.0 min為水∶乙腈=10∶90,12.1 min為水∶乙腈=95∶5,14.0 min為水∶乙腈=95∶5;流速為0.4 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量2 μL。質(zhì)譜條件為:電噴霧離子源溫度500 ℃,質(zhì)譜電壓5 500 V(正)、-4 500 V(負(fù)),離子源氣體Ⅰ 55 psi、氣體Ⅱ 60 psi,氣簾氣25 psi,碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿中,每個(gè)離子對(duì)根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測(cè)。

基于南京邁維生物科技有限公司MWDB數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)檢測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間、字母離子對(duì)信息及二級(jí)譜數(shù)據(jù)對(duì)代謝物進(jìn)行定性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

瘤胃菌群α多樣性和微生物區(qū)系組間差異顯著性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異顯著,0.05

以變量投影重要性(VIP)>1和差異倍數(shù)(FC)>2或<0.5為標(biāo)準(zhǔn),篩選獲得瘤胃液中的差異顯著代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 沉香葉中的生物活性物質(zhì)分析

沉香葉中共檢測(cè)出418種生物活性物質(zhì)[4]。在前期研究基礎(chǔ)上,將這些活性物質(zhì)進(jìn)行分類,并分析其所占比例。其中,黃酮類化合物占主導(dǎo)地位(19.38%),其次是氨基酸及其衍生物(18.66%)、脂質(zhì)(15.07%)、酚酸(11.96%)、有機(jī)酸(7.89%)以及生物堿(5.26%)等(圖1)。黃酮類化合物中包含了黃酮、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、黃酮碳糖苷、黃烷醇類、花青素和查耳酮。

2.2 飼喂沉香葉對(duì)黑山羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

本試驗(yàn)中,各組樣品測(cè)序的覆蓋度均達(dá)到99%以上,采集的樣品能夠真實(shí)反映瘤胃微生物區(qū)系的變化。其中,與對(duì)照組相比,飼喂沉香葉對(duì)黑山羊瘤胃菌群的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均無(wú)顯著性影響(P>0.05),有降低瘤胃菌群豐富度(Ace指數(shù)和Chao指數(shù))的趨勢(shì)(P=0.052)。

在門水平上(圖2-A),黑山羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群依次為:擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)和藍(lán)藻門(Cyanobacteria)。飼喂沉香葉后,瘤胃中的擬桿菌門相對(duì)豐度由65.07%提高至75.86%(P=0.175),厚壁菌門相對(duì)豐度由27.61%降低至19.26%(P=0.182),軟壁菌門和藍(lán)藻門相對(duì)豐度分別由3.27%和1.02%降低至1.07%和0.29%。

在屬水平上(圖2-B),飼喂沉香葉后,黑山羊瘤胃中的普雷沃氏菌屬1(Prevotella_1)相對(duì)豐度由38.94%提高至54.54%(P=0.097),理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)相對(duì)豐度由7.92%降低至4.96%,未定級(jí)_f_F082(norank_f_F082)相對(duì)豐度由2.08%提高至8.47%(P=0.080);瘤胃中未定級(jí)_f_擬桿菌目RF16群(norank_f_Bacteroidales_RF16_group,6.01%)、未分類_f_毛螺菌科(unclassified_f_Lachnospiraceae,3.22%)、未定級(jí)_f_普雷沃氏菌科(norank_f_Prevotellaceae,3.04%)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio,3.51%)、普雷沃氏菌科UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003,3.09%)相對(duì)豐度均降低至3%以下。

Class Ⅰ:物質(zhì)Ⅰ級(jí)分類;Class Ⅱ:物質(zhì)Ⅱ級(jí)分類;Alkaloids:生物堿;Amino acids and derivatives:氨基酸及其衍生物;Anthocyanins:花青素;Anthraquinone:蒽醌;Chalcones:查耳酮;Coumarins:香豆素;Dihydroflavonol:二氫黃酮醇;Flavanols:黃烷醇類;Flavonoid:黃酮;Flavonoids:黃酮類化合物;Flavonoid carbonoside:黃酮碳糖苷;Flavonols:黃酮醇;Free fatty acids:游離脂肪酸;Glycerol ester:甘油酯;Isoflavones:異黃酮;Lignans and coumarins:木脂素和香豆素;Lignans:香豆素;Lipids:脂質(zhì);LPC:溶血磷脂酰膽堿 lysophosphatidylcholine;LPE:溶血磷脂酰乙醇胺 lysophosphatidyl ethanolamine;Monoterpenoids:倍萜;Nucleotides and derivatives:核苷酸及其衍生物;Organic acids:有機(jī)酸;Others:其他類;PC:磷脂酰膽堿 phosphatidylcholine;Phenolamine:酚胺;Phenolic acids:酚酸;Plumerane:吲哚類生物堿;Proanthocyanidins:原花青素;Quinones:醌類;Saccharides and alcohols:糖及醇類;Sphingolipids:鞘脂;Tannins:單寧酸;Terpenoids:萜類;Triterpene:三萜;Triterpene Saponin:三萜皂苷;Vitamin:維生素;Xanthone:口山酮。

組間差異顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果(圖3-A)表明:飼喂沉香葉的黑山羊瘤胃中普雷沃氏菌科UCG-003、未定級(jí)_f_普雷沃氏菌科(norank_f_Veillonellaceae)、未定級(jí)_f_擬桿菌目BS11腸道群(norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group)、毛螺菌科ND3007群(Lachnospiraceae_ND3007_group)、帕匹桿菌屬(Papillibacter)以及未定級(jí)_f_未定級(jí)_o_紅蝽菌目(norank_f_norank_o_Coriobacteriales)等相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05);瘤胃中厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)、丹毒絲菌科UCG-009(Erysipelotrichaceae_UCG-009)、疣微菌科UCG-004(Ruminococcaceae_UCG-004)和顫螺菌屬(Oscillospira)相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)。

A:門水平 at phylum level;B:屬水平 at genus level;Bacteroidetes:擬桿菌門;Firmicutes:厚壁菌門;Tenericutes:軟壁菌門;Cyanobacteria:藍(lán)藻門;Prevotella_1:普雷沃氏菌屬1;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9腸道群;Norank_f_F082:未定級(jí)_f_F082;Norank_f_Bacteroidales_RF16_group:未定級(jí)_f_擬桿菌目RF16群;Unclassified_f_Lachnospiraceae:未分類_f_毛螺菌科;Norank_f_Prevotellaceae:未定級(jí)_f_普雷沃氏菌科;Pseudobutyrivibrio:假丁酸弧菌屬;Prevotellaceae_UCG-003:普雷沃氏菌科UCG-003;Succiniclasticum:解琥珀酸菌屬;Christensenellaceae_R-7_group:克里斯滕森菌科R-7群;Lachnospiraceae_XPB1014_group:毛螺菌科XPB1014群;Anaeroplasma:厭氧原體屬;Veillonellaceae_UCG-001:韋榮球菌科UCG-001;Selenomonas_1:月形單胞菌屬1;[Ruminococcus]_gauvreauii_group:[瘤胃球菌屬] gauvreauii群;Unclassified_c_Mollicutes:未分類_c_柔膜菌綱;Unclassified_f_Veillonellaceae:未分類_f_韋榮球菌科;Oribacterium:假丁酸菌屬;Others:其他。

LEfSE多級(jí)物種差異判別分析的結(jié)果(圖3-B)表明:飼喂沉香葉的黑山羊瘤胃中毛螺菌科XPB1014群(g_Lachnospiraceae_XPB1014_group)、未分類_c_柔膜菌綱(unclassified_c_Mollicutes)、未分類_f_韋榮球菌科(unclassified_f_Veillonellaceae)、紅蝽菌目(o_Coriobacteriales)及帕匹桿菌屬等相對(duì)豐度降低;f_F082、纖維桿菌從纖維桿菌門(Fibrobacteres)至纖維桿菌屬(Fibrobacter)以及丹毒絲菌從丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)至丹毒絲菌科UCG-004(g_Erysipelotrichaceae_UCG-004)相對(duì)豐度均提高。

2.3 飼喂沉香葉對(duì)黑山羊瘤胃中代謝物的影響

在黑山羊瘤胃液中共鑒定出450種代謝物(圖4-A)。其中,飼喂沉香葉導(dǎo)致瘤胃液中26種代謝物含量顯著提高,其中?；蛆Z去氧膽酸(log2FC=16.55)和馬尿酸(log2FC=14.57)含量的變化最大(表3,圖4-B);54種代謝物含量顯著降低,其中4-香豆酸(log2FC=-14.26)含量的變化最大(表4,圖4-B)。差異代謝物的京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析顯示:飼喂沉香葉主要影響了黑山羊瘤胃中的代謝途徑(metabolic pathways)、蛋白質(zhì)消化吸收(protein digestion and absorption)、氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)等通路(圖4-C)。

3 討 論

3.1 沉香葉中的生物活性物質(zhì)分析

沉香葉具有抗炎、抗菌、抗氧化及保護(hù)肝臟等多種功效[7]。在肉雞飼糧中添加2%的沉香葉粉能夠顯著提高其生長(zhǎng)性能、屠宰性能和飼糧養(yǎng)分消化率,提高免疫器官指數(shù)以及抗氧化和血脂分解代謝能力[8-9]。作為反芻動(dòng)物的非常規(guī)飼料原料,飼喂含有20%沉香葉的飼糧能夠顯著降低黑山羊血液中的膽固醇含量,促進(jìn)脂肪分解代謝[4],這可能是由于沉香葉中富含黃酮和酚酸等促進(jìn)脂肪分解代謝的生物活性物質(zhì)[10-11]。沉香葉中的芫花素、山奈酚、芒果苷等酚酸類活性物質(zhì)能夠發(fā)揮過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)激動(dòng)劑的作用效果[12],在臨床上能夠有助于治療人體的高膽固醇血癥。此外,沉香葉中的生物堿、單寧酸、萜類等活性物質(zhì),具有降低機(jī)體血脂的作用[13-15]。

A:組間差異顯著性檢驗(yàn) significance test of differences between groups;B:LEfSE多級(jí)物種差異判別分析 LEfSE multilevel discriminant analysis of species differences;Prevotellaceae_UCG-003:普雷沃氏菌科UCG-003;Norank_f_Veillonellaceae:未定級(jí)_f_韋榮球菌科;Anaerovibrio:厭氧弧菌屬;Norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group:未定級(jí)_f_擬桿菌目BS11腸道群;Lachnospiraceae_ND3007_group:毛螺菌科ND3007群;Erysipelotrichaceae_UCG-009:丹毒絲菌科UCG-009;Ruminococcaceae_UCG-004:疣微菌科UCG-004;Papillibacter:帕匹桿菌屬;Norank_o_Coriobacteriales:未定級(jí)_o_紅蝽菌目;norank_f_norank_o_Coriobacteriales:未定級(jí)_f_未定級(jí)_o_紅蝽菌目;Oscillospira:顫螺菌屬;Lachnospiraceae_XPB1014_group:毛螺菌科XPB1014群;Unclassified_c_Mollicutes:未分類_c_柔膜菌綱;Unclassified_f_Veillonellaceae:未分類_f_韋榮球菌科;Pseudomonadales:假單胞菌目;[Eubacterium]_ventriosum_group:凸腹真桿菌群;Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科UCG-001;Coprococcus_2:糞球菌屬2;Norank_f_F082:未定級(jí)_f_F082;Fibrobacterales:纖維桿菌目;Fibrobacteria:纖維桿菌綱;Fibrobacteres:纖維桿菌門;Fibrobacteraceae:纖維桿菌科;Fibrobacter:纖維桿菌屬;Erysipelotrichaceae:丹毒絲菌科;Erysipelotrichia:丹毒絲菌綱;Erysipelotrichales:丹毒絲菌目;Prevotellaceae_UCG-004:普雷沃氏菌科UCG-004。

不過,沉香葉是如何通過調(diào)節(jié)黑山羊機(jī)體脂質(zhì)代謝信號(hào)通路從而發(fā)揮降血脂的作用機(jī)制,需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。后續(xù)可對(duì)黑山羊血液和肌肉中的脂類物質(zhì)進(jìn)行深入解析,檢測(cè)肌肉中與脂肪代謝相關(guān)的標(biāo)志基因變化。本文重點(diǎn)關(guān)注飼喂沉香葉對(duì)黑山羊瘤胃功能的影響,并結(jié)合前期研究結(jié)果,解析瘤胃、血液、肌肉三者之間所發(fā)生變化的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

3.2 飼喂沉香葉對(duì)黑山羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

研究表明,胃腸道中擬桿菌門的相對(duì)豐度與宿主機(jī)體的體脂含量呈顯著負(fù)相關(guān)[16],擬桿菌門相對(duì)豐度的提高有利于增強(qiáng)宿主的脂肪分解代謝能力。在本試驗(yàn)中,飼喂沉香葉后,黑山羊瘤胃中擬桿菌門的相對(duì)豐度由65.07%提高至75.86%,這一趨勢(shì)與黑山羊血液和肌肉中膽固醇含量顯著降低的結(jié)論[4]相一致,這也進(jìn)一步佐證了飼喂沉香葉可能導(dǎo)致機(jī)體脂肪分解代謝激活的推論。在本試驗(yàn)中,飼喂沉香葉導(dǎo)致黑山羊瘤胃中普雷沃氏菌科UCG-003的相對(duì)豐度顯著降低。Hassan等[17]給奶水牛飼喂含有印度獐牙菜葉子等植物混合物后,瘤胃中普雷沃氏菌科UCG-003的相對(duì)豐度也出現(xiàn)了顯著降低。給灘羊飼喂桑葉青貯替代苜蓿青貯的飼糧,導(dǎo)致瘤胃中普雷沃氏菌科UCG-003的相對(duì)豐度降低;且普雷沃氏菌科UCG-003的相對(duì)豐度與灘羊血液中的丙二醛含量呈正相關(guān),與血液總抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性呈負(fù)相關(guān)[18]。然而,目前尚不能確定普雷沃氏菌科UCG-003菌群變化在這一過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能。

表3 飼喂沉香葉后黑山羊瘤胃液中含量顯著提高的26種代謝物

表4 飼喂沉香葉后黑山羊瘤胃液中含量顯著提高的54種代謝物

續(xù)表4編號(hào) No.代謝物 Metabolites代謝物類別 Metabolite categories變量投影重要性 VIPlog2差異倍數(shù) log2FC編號(hào) No.代謝物 Metabolites代謝物類別 Metabolite categories變量投影重要性 VIPlog2差異倍數(shù) log2FC95′-單磷酸-2′-脫氧腺苷核苷酸及其代謝物1.66-2.0436甘氨酰苯基丙氨酸氨基酸及其代謝物1.54-1.3810二甲基鳥苷核苷酸及其代謝物1.17-1.9837L-亮氨酸氨基酸及其代謝物1.04-1.3711L-鳥氨酸氨基酸及其代謝物1.54-1.9538L-天冬氨酸-L-苯丙氨酸氨基酸及其代謝物1.24-1.37127-甲基鳥嘌呤核苷酸及其代謝物1.55-1.9339反-4-羥基-L-脯氨酸氨基酸及其代謝物1.03-1.37132-苯基乙酰胺苯及其衍生物1.20-1.9240膽堿膽堿類1.44-1.3514L-蛋氨酸氨基酸及其代謝物1.61-1.8741十三烷酸脂質(zhì)1.80-1.30152,6-二氨基庚二酸有機(jī)酸及其衍生物1.30-1.87425-尿嘧啶核苷酸核苷酸及其代謝物1.44-1.29162′-脫氧尿苷核苷酸及其代謝物1.04-1.8643L-瓜氨酸氨基酸及其代謝物1.11-1.2917L-異亮氨酸氨基酸及其代謝物1.19-1.8444L-酪氨酸氨基酸及其代謝物1.33-1.2718L-苯丙氨酸氨基酸及其代謝物1.58-1.8445N′-甲?；虬彼嵊袡C(jī)酸及其衍生物1.71-1.2619阿拉伯糖醇碳水化合物及其代謝物1.52-1.8146吲哚-3-乙酸吲哚及其衍生物1.75-1.2520乙酰基組胺有機(jī)酸及其衍生物1.64-1.77472-甲基苯甲酸苯及其衍生物1.31-1.2321阿斯巴甜有機(jī)酸及其衍生物1.01-1.7448尿刊酸有機(jī)酸及其衍生物1.29-1.1822黃嘌呤核苷酸及其代謝物1.43-1.6849N-異戊酰氨基乙酸氨基酸及其代謝物1.56-1.1723DL-O-酪氨酸有機(jī)酸及其衍生物1.33-1.6550甘氨鵝脫氧膽酸膽汁酸1.04-1.1624色胺色胺及其衍生物1.89-1.6551D-海藻糖碳水化合物及其代謝物1.07-1.14254,4′-二氨基二苯基甲烷苯及其衍生物1.37-1.6252馬來酸有機(jī)酸及其衍生物1.86-1.0826氯化膽堿其他1.65-1.6053ω-羥基十二烷酸脂質(zhì)2.08-1.0727DL-亮氨酸氨基酸及其代謝物1.14-1.5754L-脯氨酸氨基酸及其代謝物1.77-1.04

帕匹桿菌屬是瘤胃中的一類丁酸產(chǎn)生菌,富含有機(jī)酸的環(huán)境不利于帕匹桿菌屬的生長(zhǎng)[19]。沉香葉中含有33種有機(jī)酸(占比7.89%),飼喂20%沉香葉可能導(dǎo)致黑山羊瘤胃中帕匹桿菌屬的生長(zhǎng)受到抑制,帕匹桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。未定級(jí)_f_F082是擬桿菌目的一類未知菌屬,Han等[20]研究表明,飼喂桑葉青貯替代玉米青貯和豆粕的飼糧后,灘羊瘤胃中未定級(jí)_f_F082的相對(duì)豐度顯著提高,且未定級(jí)_f_F082與灘羊瘤胃的發(fā)酵參數(shù)密切相關(guān),認(rèn)為其在非常規(guī)飼料(桑葉青貯)的消化利用過程中發(fā)揮著重要的作用。本試驗(yàn)中,飼喂沉香葉后黑山羊瘤胃中未定級(jí)_f_F082的相對(duì)豐度由2.08%提高至8.47%。

普雷沃氏菌屬1是瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群,能夠消化和利用植物來源的淀粉、單糖和非纖維素多糖等營(yíng)養(yǎng)成分并提供能量[21]。普雷沃氏菌屬1還與蛋白質(zhì)和多肽的消化吸收以及瘤胃中的氨基酸代謝相關(guān)[22],泌乳奶牛直接飼喂布氏普雷沃氏菌25A(Prevotellabryantii25A)能夠顯著提高瘤胃中氨態(tài)氮含量[23]。瘤胃中普雷沃氏菌屬1相對(duì)豐度的提高有利于增加飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分的消化利用[24-25]。此外,Li等[26]和Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn),在飼料利用效率高的肉牛和綿羊的瘤胃中,韋榮球菌科(Veillonellaceae)的相對(duì)豐度均降低。在本試驗(yàn)中,飼喂沉香葉有提高瘤胃中普雷沃氏菌屬1相對(duì)豐度的趨勢(shì),并降低了韋榮球菌科的相對(duì)豐度。盡管黑山羊的平均日采食量和增重?zé)o顯著差異[4],但瘤胃中未定級(jí)_f_F082、普雷沃氏菌屬1和韋榮球菌科的相對(duì)豐度變化有利于飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分的消化利用。

研究表明,厭氧弧菌屬參與了瘤胃中的脂肪分解代謝[28],將脂肪分解成脂肪酸。飼喂120 g/d富含花青素(黃酮類化合物)的甘藍(lán)提取物,能夠顯著提高西門塔爾育肥牛瘤胃中厭氧弧菌屬的相對(duì)豐度,改善瘤胃的脂肪代謝[29]。此外,有研究指出,毛螺菌科XPB1014群的相對(duì)豐度與體脂呈負(fù)相關(guān)[30];飼喂桑葉青貯替代苜蓿青貯的飼糧,導(dǎo)致灘羊瘤胃中毛螺菌科XPB1014群的相對(duì)豐度降低,生物氫化過程被抑制,更多的不飽和脂肪酸被消化吸收利用[18]。本試驗(yàn)中,與飼喂基礎(chǔ)飼糧相比,飼喂沉香葉顯著提高了育肥黑山羊瘤胃中厭氧弧菌屬的相對(duì)豐度,降低了毛螺菌科XPB1014群的相對(duì)豐度;這2種菌群的變化能夠促進(jìn)瘤胃中脂肪分解代謝,從而導(dǎo)致黑山羊機(jī)體的脂肪分解代謝增強(qiáng),羊肉中的膽固醇含量降低。然而,這2種菌是否直接參與了膽固醇的代謝有待進(jìn)一步的研究。

3.3 飼喂沉香葉對(duì)黑山羊瘤胃中代謝物的影響

?；蛆Z去氧膽酸是動(dòng)物膽汁酸的主要活性物質(zhì),具有調(diào)節(jié)膽固醇和脂肪代謝的作用。?；蛆Z去氧膽酸在微生物的作用下產(chǎn)生鵝去氧膽酸激活法尼醇X受體(FXR)通路,通過調(diào)節(jié)膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)的表達(dá)從而控制膽固醇的代謝。給大鼠灌胃?；蛆Z去氧膽酸能夠顯著提高肝臟中FXR的基因和蛋白表達(dá)量[31]。Huang等[32]在高脂肪飲食小鼠飼糧中添加15 mg/kg石斛生物堿,試驗(yàn)組小鼠肝臟中?；蛆Z去氧膽酸含量顯著增加,FXR基因表達(dá)量提高,表明其可以促進(jìn)機(jī)體膽固醇排泄,減少肝臟脂質(zhì)積累,改善肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。飼喂沉香葉能夠顯著提高黑山羊瘤胃液中?；蛆Z去氧膽酸的含量,其可通過瘤胃壁吸收進(jìn)入血液循環(huán),在肝臟中代謝調(diào)節(jié)膽固醇,促進(jìn)脂肪分解代謝。瘤胃液中另一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物——馬尿酸來源于飼糧中的蛋白質(zhì)降解,同時(shí)也是微生物代謝產(chǎn)物苯甲酸與甘氨酸反應(yīng)的產(chǎn)物[33]。瘤胃中苯甲酸的積累會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒副作用,在本試驗(yàn)中,馬尿酸不僅作為飼喂沉香葉的黑山羊瘤胃中的生物標(biāo)志物,還能夠清除苯甲酸可能產(chǎn)生的毒副作用。

飼喂沉香葉導(dǎo)致黑山羊血液和肌肉中的4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯含量均顯著提高[4],4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯屬于一類防腐劑,不常見于生物體。通過對(duì)沉香葉中的生物活性物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn),沉香葉中含有4-羥基苯甲酸(酚酸類)。4-羥基苯甲酸和甲醇可通過2個(gè)酶促反應(yīng)生成4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯[34]。沉香葉中的4-羥基苯甲酸經(jīng)瘤胃微生物代謝形成差異代謝物4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯,后經(jīng)瘤胃壁進(jìn)入黑山羊的血液循環(huán)并沉積在肌肉組織。

飼喂沉香葉導(dǎo)致黑山羊血液中29種差異代謝物含量顯著提高,5種差異代謝物含量顯著降低;肌肉中14種差異代謝物含量顯著提高,12種差異代謝物含量顯著降低[4]。在本試驗(yàn)中,飼喂沉香葉導(dǎo)致瘤胃液中26種差異代謝物含量顯著提高,54種差異代謝物含量顯著降低;相比血液和肌肉,沉香葉對(duì)黑山羊瘤胃微生物區(qū)系的影響更大。其中,瘤胃液中含量顯著提高的代謝物:對(duì)羥基苯乙醇、十六烷二酸和4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯,在血液中也呈現(xiàn)顯著提高。瘤胃液中含量顯著提高的代謝物:香草酸和4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯,在肌肉中也呈現(xiàn)顯著提高。由此可見,4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯是瘤胃、血液和肌肉中共同提高的差異代謝物,可能來源于沉香葉中的活性物物質(zhì)4-羥基苯甲酸。

4 結(jié) 論

① 飼喂沉香葉有提高育肥黑山羊瘤胃普雷沃氏菌屬1相對(duì)豐度的趨勢(shì),并提高了未定級(jí)_f_F082的相對(duì)豐度,降低了韋榮球菌科的相對(duì)豐度,有利于飼糧中營(yíng)養(yǎng)成分的消化利用。

② 飼喂沉香葉后,育肥黑山羊瘤胃中的擬桿菌門相對(duì)豐度由65.07%提高至75.86%,并提高了育肥黑山羊瘤胃中厭氧弧菌屬的相對(duì)豐度,降低了毛螺菌科XPB1014群的相對(duì)豐度。

③ 黑山羊瘤胃液中的?；蛆Z去氧膽酸、馬尿酸和4-對(duì)羥基苯甲酸甲酯能夠作為飼喂沉香葉后的潛在生物標(biāo)志物。