林則徐戒煙方對地西泮自然戒斷小鼠的治療作用及初步機制研究

焦 玥 李 鵬 劉艷驕 趙小亮 劉 洋 李 濤 王志國 王丹巧

(1 中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心,北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎研究重點實驗室,北京,100700; 2 北京市海淀區(qū)玉淵潭社區(qū)衛(wèi)生服務中心,北京,100363; 3 中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院心理睡眠科,北京,100032)

林則徐戒煙方(以下簡稱戒煙方),也稱為林文忠公戒煙方,來源于福州林則徐紀念館,是林則徐和名醫(yī)何其偉合作研制,以解清末鴉片泛濫之毒。道光十八年林則徐任湖廣總督時,即將該方上奏朝廷[3]。該方主方名“忌酸丸”,輔佐方名“補正丸”?！逗V奏稿》卷四中記載該方在湖廣地區(qū)“凡省城、漢鎮(zhèn)藥店,所配戒煙之藥,無家不有,無日不售”,并“有耆民婦女在路旁叩頭稱謝,據(jù)云其夫男久患煙癮,今幸服藥斷絕,身體漸強”。中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院劉艷驕教授[4]借鑒林則徐戒除鴉片的思路,采用戒煙方作為安眠藥物中藥替代治療的主要方劑,并提出安眠藥物依賴性失眠的中醫(yī)病因是“毒邪滯留,內(nèi)生燥火”,病機為“毒邪上腦”,全方以西洋參、當歸、黃芪等扶正,黃連、天麻、柴胡、沉香等解毒,共奏“溫補脾腎,益氣升陽,滋陰平肝,治藥毒癮”之效,在臨床上收到良好的治療效果,形成規(guī)范化診療流程[5],但戒煙方的作用機制尚無研究。由于長期濫用藥物會使大腦產(chǎn)生適應性改變,主要表現(xiàn)為腦內(nèi)多巴胺(DA)、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)等與獎賞系統(tǒng)有關的神經(jīng)遞質(zhì)改變,神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放,突觸可塑性改變等。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路與藥物成癮引起的神經(jīng)適應性和獎賞效應直接相關[6]。因此,本研究模擬臨床停藥過程,采用小鼠規(guī)律灌胃地西泮28 d后停止給藥的自然戒斷方法,觀察戒煙方對小鼠在戒斷3 d后發(fā)生的行為學變化、紋狀體內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)的改變以及對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、mTOR活性的影響,探討戒煙方治療地西泮自然戒斷的治療作用及其相關機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性KM小鼠40只,體質(zhì)量20 g左右。購于北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0008。所有動物飼養(yǎng)于獨立通氣籠具(461 mm×274 mm×229 mm),實驗室環(huán)境溫度為22 ℃左右,濕度為50%左右,提前喂養(yǎng)1周適應飼養(yǎng)環(huán)境,自由飲水和食用商業(yè)飼料。動物實驗倫理審批號:ERCCACMS21-2303-05。

1.1.2 藥物 地西泮片(山東信誼有限公司,國藥準字H37023039),戒煙方藥物組成:西洋參15 g、麩炒白術10 g、生黃芪10 g、柴胡15 g、當歸6 g、關黃柏12 g、木香6 g、陳皮6 g、升麻5 g、天麻6 g、甘草6 g、沉香6 g。中藥購自北京同仁堂有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 DA(批號:BCBC7614V)、3,4二羥基苯乙酸(DOPAC,批號:0001364209)、5-羥色胺(5-HT,批號:091M1128V)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA,批號:046K1520)、氯化鉀(批號:080M0091V)、乙二胺四乙酸二鈉(批號:080M0013V)均為Sigma公司(美國)產(chǎn)品。辛烷磺酸鈉(批號:7876976)、磷酸二氫鈉(批號:2461229)、磷酸(批號:4103512)、四氫呋喃(批號:R141892)、甲醇(批號:R142188)、乙腈(批號:R142091)均為Dikma公司產(chǎn)品(北京迪科馬科技有限公司)。Glu(批號:060M01711V)、甘氨酸(Gly,批號:1394031V)、牛磺酸(Tau,批號:71K0130)、GABA(批號:124H0364)、鄰苯二甲醛(批號:BCBL2514V)、乙酸鈉(批號:5043R28V)均購于Alfa Aesar(China)Chemicals公司(美國)。BDNF抗體(批號:GR3319825-22)、mTOR抗體(批號:GR3356299-18)購自Abcom公司(英國),p-mTOR抗體(批號:28273-1-AP)購自Proteintech公司。電動組織研磨器(GINGKO公司,型號:G12402031),多管渦旋震蕩儀(TARGAIN,北京錦踏科技有限公司),Rotanta 460R離心機(Andreas Hettich GmbH&Co.KG,德國)。高效液相-電化學檢測系統(tǒng):Sykam高效液相色譜儀,包括S2100溶劑輸送系統(tǒng),S5200自動進樣器和Clarity色譜工作站[Sykam(賽卡姆)公司,德國]。Antec Decade Ⅱ SDC電化學檢測器,VT-03玻璃碳工作電極(直徑3 mm),原位銀/氯化銀參比電極,25 μm電極墊片,柱前連有ADF濾波器(0.05 Hz)和脈沖阻尼器(Antec Leyden BV公司,荷蘭)。Waters X Select@HSS T3色譜柱(2.5 μm,2.1 mm×50 mm)(Waters公司,美國)。高效液相-熒光檢測系統(tǒng)包括:Aglient 1260 InfinityⅡ高效液相色譜系統(tǒng),包括自動進樣器、四元泵、柱溫箱、熒光檢測器和Openlab軟件。Aglient Eclipse AAA色譜柱(5 μm,4.6 mm×150 mm),以上均為Agilent科技有限公司產(chǎn)品(美國)。穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(型號:Powerpac HQ),垂直電泳槽(型號:MP3)、半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀(型號:Trans-Blot SD)均為Bio-Rad公司產(chǎn)品(美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只小鼠稱量體質(zhì)量后按照隨機數(shù)字表法分為5組:正常對照組、模型組、戒煙方低劑量組、戒煙方中劑量組、戒煙方高劑量組。正常對照組小鼠灌胃蒸餾水28 d。其余各組小鼠連續(xù)灌胃地西泮(2 mg/kg)28 d。

1.2.2 干預方法

1.2.2.1 林則徐戒煙方的制備方法 按照臨床每人每日用量折算小鼠每日使用的等效劑量。戒煙方藥材(西洋參另煎兌入)浸泡2 h后大火燒開,小火煎煮后提取2次。所有藥汁混合后濃縮,移入旋蒸儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至所需31.0 g/kg。分裝,-80 ℃保存。

1.2.2.2 給藥方法 造模后停藥3 d。在此期間,模型組和正常對照組灌胃蒸餾水;戒煙方低劑量組(7.8 g/kg)、戒煙方中劑量組(15.5 g/kg)、戒煙方高劑量組(31.0 g/kg)灌胃相應劑量的中藥。

1.2.3 檢測指標與方法

記錄每組小鼠每天總的飲食、飲水量。3 d后記錄每只小鼠體質(zhì)量,進行行為學檢測。小鼠脫頸處死后剝離腦組織取紋狀體,精密稱取紋狀體質(zhì)量,-80 ℃保存。

1.2.3.1 行為學分析 應用曠場實驗分析小鼠的行為學變化。將小鼠放入50 cm×50 cm的曠場中。底部平均分為25個正方形格子。將與曠場箱壁相連的方格或者區(qū)域稱為周圍格,不與反應箱壁連接的區(qū)域稱為中央格。每次將小鼠放正中格子中,觀察記錄5 min內(nèi)小鼠穿過中央格和外周格的數(shù)量。穿過格子以小鼠半身以上進入格子記為1個。記錄小鼠直立和梳理的次數(shù)。直立以小鼠前肢全部離開地面記為1次。梳理以小鼠完成整套梳理毛發(fā)過程記為1次。每只小鼠記錄完畢后噴灑乙醇揮干以減少對隨后記錄動物的干擾。

1.2.3.2 高效液相-電化學方法檢測小鼠紋狀體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量 將紋狀體加入適量冷生理鹽水用手持式勻漿器在冰上進行勻漿,取定量勻漿液加入3倍體積的1%甲酸-乙腈,震蕩3 min后離心(離心半徑97 mm),20 000×g,4 ℃,離心5 min。取上清液加入等體積1%高氯酸后重復上述步驟,以同樣條件再次離心取上清液。樣本適量稀釋后即進行檢測,避免反復凍融。流動相為水∶甲醇=90∶10(含0.74 mmol/L辛烷磺酸鈉、80 mmol/L二水合磷酸二氫鈉、0.027 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉和2 mmol/L氯化鉀),磷酸調(diào)pH=3.0,0.2 mL/min等度洗脫,柱溫35 ℃。所得數(shù)據(jù)根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織質(zhì)量進行濃度校正。檢測DA、DOPAC、HVA、5-HT、5-HIAA的含量。

1.2.3.3 高效液相-熒光法檢測小鼠紋狀體中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的含量 將紋狀體加入適量冷生理鹽水用手持式勻漿器在冰上進行勻漿。取定量勻漿液加入3倍乙腈,震蕩3 min后離心(離心半徑97 mm),20 000 g,4 ℃,離心5 min。取上清液以同樣條件再次離心。樣本適量稀釋后即進行檢測,避免反復凍融。流動相、衍生液配制等參見文獻[7]。二元梯度洗脫,流速0.8 mL/min;激發(fā)波長340 nm,發(fā)射波長455 nm。所得數(shù)據(jù)根據(jù)稀釋倍數(shù)和組織質(zhì)量進行校正。檢測Glu、GABA、Tau、Gly含量。

1.2.3.4 Western blotting方法檢測紋狀體中BDNF及mTOR和p-mTOR蛋白表達 將紋狀體組織放入預冷的研缽中加入液氮進行快速研磨提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。Western blotting操作流程包括電泳、蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移和膜封閉、抗原抗體反應及顯影,用IPP軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析?？贵w稀釋倍數(shù)1∶1 000。

2 結果

2.1 地西泮停藥3 d小鼠體質(zhì)量、飲食、飲水量變化 小鼠灌胃28 d后,正常對照組與其余各組灌胃地西泮小鼠的平均體質(zhì)量沒有差異。戒斷3 d后,每只小鼠的體質(zhì)量按每日體質(zhì)量減去戒斷前體質(zhì)量得到的差值進行統(tǒng)計。與正常對照組比較,3 d后各組小鼠與戒斷前體質(zhì)量增值明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),戒煙方低、中、高劑量組體質(zhì)量增值與模型組比較有升高趨勢。連續(xù)觀察各組小鼠在這3 d內(nèi)的平均飲食量和飲水量可以看到,模型組小鼠在第1天出現(xiàn)飲食量下降、飲水量增多的表現(xiàn),在隨后2 d內(nèi)逐漸恢復。戒煙方低、中、高劑量組對于飲食量降低有一定的改善作用。見圖1,表1。

圖1 戒斷3 d后各組小鼠的體質(zhì)量增值(n=8)

2.2 各組小鼠行為學結果 戒斷3 d后進行曠場實驗,記錄小鼠穿過周圍格次數(shù)以及穿過中央格次數(shù)。與正常對照組比較,模型組小鼠穿過中央格(P<0.05)和周圍格數(shù)量均減少,小鼠表現(xiàn)出探索欲望下降,運動減少。戒斷3 d中給予戒煙方治療,對于周圍格運動的降低沒有明顯改善,但戒煙方高劑量組小鼠穿過中央格的數(shù)量顯著增加(P<0.05),說明戒煙方對于小鼠探索興趣和運動有一定的提升作用。戒煙方低、中、高劑量組對于小鼠直立次數(shù)的減少有增高趨勢,對于小鼠自我梳理次數(shù)減少沒有影響。見圖2。

圖2 戒煙方對地西泮自然戒斷小鼠行為學影響(n=8)

2.3 戒煙方各組對于地西泮自然戒斷后小鼠紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 與正常對照組比較,模型組中DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA顯著降低(P<0.05或P<0.01),戒煙方對于DA的降低具有升高作用,戒煙方高劑量組顯著提高DA水平(P<0.05)。模型組5-HT也明顯降低(P<0.05),戒煙方高劑量組顯著提高了5-HT的含量(P<0.05),5-HT的代謝產(chǎn)物5-HIAA含量略有降低。以上結果說明,地西泮自然戒斷狀態(tài)下模型小鼠腦紋狀體中DA、5-HT及其部分代謝產(chǎn)物發(fā)生明顯變化,戒煙方對于DA、5-HT的下降有升高作用,而且沒有增加代謝產(chǎn)物含量,說明對腦內(nèi)起到直接作用的DA和5-HT沒有快速降解,可以維持較高的腦內(nèi)濃度。見表2。

2.4 戒煙方對于地西泮自然戒斷后小鼠紋狀體內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響 與正常對照組比較,模型組紋狀體中興奮性Glu水平降低,抑制性GABA水平升高趨勢,導致Glu/GABA比值明顯下降(P<0.05),戒煙方高劑量組可以明顯抑制Glu/GABA的下降(P<0.01)。模型組Tau水平明顯下降(P<0.05),戒煙方有升高Tau趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。戒煙方對于紋狀體中Gly水平?jīng)]有明顯影響。以上結果說明,地西泮自然戒斷狀態(tài)下模型小鼠腦內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡,戒煙方對于Glu/GABA失衡具有明顯的調(diào)節(jié)作用。見表3。

表3 戒煙方對于地西泮自然戒斷小鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

2.5 戒煙方對地西泮自然戒斷小鼠紋狀體p-mTOR、mTOR和BDNF蛋白表達的影響 與正常對照組比較,模型組p-mTOR/mTOR和BDNF表達明顯降低(P<0.05或P<0.01),戒煙方有提高p-mTOR/mTOR的作用(P<0.05)和增加BDNF表達的趨勢。見圖3。

3 討論

BZDs藥物主要通過作用于γ-氨基丁酸A型(GABAA)受體復合物的苯二氮類(BZD)受體起到鎮(zhèn)靜、安眠作用,但由于受體的非選擇性,長期使用容易造成藥物依賴,撤藥癥狀明顯。長期服用產(chǎn)生耐受性后,可在同品種之間存在交叉耐受和交叉依賴。目前,尚沒有藥物被推薦或批準用于治療BZDs藥物依賴或促進長期使用后的戒斷,主要以逐漸減量及對癥給藥為主,但藥物使用的結果差異很大,這使BZDs依賴已經(jīng)成為困擾健康狀況的公共衛(wèi)生問題和社會問題[8]。

中醫(yī)學認為藥物依賴多為“毒邪入腦”。所用中藥多為多靶點無成癮性藥物,在治療藥物依賴方面具有較大優(yōu)勢。林則徐戒煙方由西洋參、生黃芪、當歸、柴胡、麩炒白術、關黃柏、木香、陳皮、升麻、天麻、沉香和甘草組成。方中西洋參、黃芪、當歸、甘草是歷代戒煙方中的常用藥物。現(xiàn)代藥理研究認為中藥主要以靶標腦部DA能和Glu能系統(tǒng),通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、影響突觸可塑性等功能調(diào)節(jié)腦內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài),起到“解毒”作用[9]。在我們的前期研究中,觀察地西泮給藥戒斷后紋狀體、下丘腦、皮層、中腦和海馬中的多種神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生改變。已知紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路信號的傳入及整合中心,接受來自皮層、下丘腦、中腦的信號傳入,經(jīng)過局部環(huán)路再傳出到蒼白球或者黑質(zhì)網(wǎng)狀部,參與藥物成癮的從初始暴露到復吸的所有階段[10]。

本研究中,小鼠在長期給予地西泮后戒斷3 d,發(fā)現(xiàn)明顯影響小鼠飲食飲水,造成其體質(zhì)量增長低于正常小鼠;行為學檢測發(fā)現(xiàn)穿過中央格數(shù)量減少,直立探索次數(shù)降低,說明小鼠的探索及運動的欲望降低,出現(xiàn)類似焦慮、抑郁樣情緒變化,而戒煙方明顯改善了小鼠的一般狀態(tài)及運動和探索興趣,從整體上說明藥物的有效性。

本研究中,慢性給藥戒斷小鼠紋狀體DA、5-HT及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA等模型組明顯降低。已知腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)的改變是藥物依賴的標志性特征,而5-HT與情緒改變密切相關。有研究表明,BZDs藥物引起的焦慮患者血液中DA、5-HT明顯降低。不同劑量的地西泮,短期和長期處理斑馬魚后可以引起5-HT、DA等多種神經(jīng)遞質(zhì)濃度隨時間發(fā)生改變,早期明顯升高,長期則引起部分神經(jīng)遞質(zhì)顯著下降,說明神經(jīng)遞質(zhì)在不同病理階段處于動態(tài)變化的過程[11]。戒煙方對于地西泮長期給藥引起的DA、5-HT降低有明顯的升高,而對于代謝產(chǎn)物的影響不明顯,說明戒煙方可能對于腦內(nèi)DA、5-HT的生成有促進,或是對于其降解可能有抑制作用,從而使腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)恢復且維持在較高水平,進而緩解藥物戒斷引起的不良反應。

BZDs通過結合和增強GABA受體發(fā)揮作用,本研究中,雖然沒有觀察長期給藥后GABA的改變,但是在戒斷3 d后,GABA含量仍然高于正常對照組,同時抑制性氨基酸Gly具有同樣趨勢變化,興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu則相對正常對照組降低,Glu/GABA降低顯著,說明戒斷3 d后小鼠紋狀體中仍然以抑制性變化占據(jù)優(yōu)勢,尤其是戒煙方高劑量組改善了紋狀體的抑制狀態(tài),與行為學表現(xiàn)相符。已知Tau有明確的抗焦慮和抗抑郁作用,可以明顯提升急性或者慢性不可預知溫和應激(CUMS)致抑郁小鼠腦組織中DA、5-HT含量,降低單胺氧化酶活性,升高腦內(nèi)BDNF含量[12]。Tau在模型小鼠腦中明顯降低。戒煙方則升高紋狀體中Tau含量,有益于改善小鼠的抑郁狀態(tài)。以上結果表明,戒煙方改善小鼠的運動和探索能力與調(diào)節(jié)紋狀體內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)失衡有關。

長期灌胃地西泮的小鼠紋狀體出現(xiàn)BDNF表達降低、p-mTOR/mTOR降低的現(xiàn)象。甲基苯丙胺成癮者戒斷階段外周血中BDNF隨戒斷時間而逐漸降低,如果伴有抑郁癥狀則BDNF下降更多,而抑郁會明顯增加甲基苯丙胺復吸的概率[13]。

戒煙方在清末戒煙運動中發(fā)揮了重要作用,如今古方新用,在臨床治療安眠藥物依賴也取得了良好的治療效果。本研究中,我們以小鼠地西泮長期給藥后戒斷模擬安眠藥依賴,發(fā)現(xiàn)其改善小鼠行為的作用機制與調(diào)節(jié)腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)密切相關,由于受組織樣本量所限未進行神經(jīng)遞質(zhì)代謝酶等相關檢測,此部分工作進行將會繼續(xù)開展,以期更好地揭示戒煙方對于藥物依賴治療作用機制,為戒煙方臨床治療和藥理機制提供新的依據(jù)。

利益沖突聲明:無。