麥蛾柔繭蜂幼蟲唾液腺的顯微與超微形態(tài)觀察

高星雨,俞凱麗,方 琦,汪 芳,姚洪渭,葉恭銀

(浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所,水稻生物學(xué)國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲害分子生物學(xué)重點實驗室,杭州 310058)

昆蟲唾液腺作為一類典型的多細胞外分泌腺,由外胚層細胞內(nèi)陷形成,是昆蟲消化系統(tǒng)的重要組成部分,也是重要的生物學(xué)和遺傳學(xué)研究材料(黃志君等,2007)。昆蟲唾液腺合成并分泌唾液。唾液作為昆蟲與植物、昆蟲與動物之間的媒介物質(zhì),具有諸如消化食物(Eberhardetal.,2007;Harpeletal.,2015)、規(guī)避動植物宿主防御(Baxteretal.,2014)、調(diào)控個體系統(tǒng)性生長(Lietal.,2022)和協(xié)助傳播病毒(Sunetal.,2020)等重要功能。目前關(guān)于昆蟲唾液的研究主要以植食性昆蟲和吸血性昆蟲為主,而有關(guān)寄生蜂唾液腺及其唾液的研究則相對較少,僅限于粘蟲稀網(wǎng)姬小蜂Euplectrusseparate(Nakamatsu and Tanaka,2003)、川硬皮腫腿蜂Sclerodermasichuanensis(蔣學(xué)建等,2005)和蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum(任朝都,2021)等。

麥蛾柔繭蜂HabrobraconhebetorSay屬膜翅目Hymenoptera繭蜂科Braconidae,營外寄生。該蜂寄主范圍廣,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與倉儲中鱗翅目害蟲的重要優(yōu)勢天敵,已成功用于多種害蟲的生物防控(黃信飛,1986;阿克旦等,2006;Baetal.,2013;郭超等,2021)。麥蛾柔繭蜂寄生后,孵化的幼蟲在寄主害蟲體表通過取食寄主血淋巴獲得營養(yǎng),其中唾液在食物消化和寄主免疫調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要作用(金虹霞,2020)。但是,有關(guān)該蜂唾液腺形態(tài)結(jié)構(gòu)尚不清楚。為此,本文對麥蛾柔繭蜂唾液腺顯微與超微形態(tài)進行觀察,旨在為深入研究麥蛾柔繭蜂的唾液組分及其功能、以及該蜂與其寄主間互作機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

麥蛾柔繭蜂系在人工氣候室內(nèi)長期續(xù)代飼養(yǎng)的實驗室種群。飼養(yǎng)條件為溫度28±1℃,相對濕度75%±5%,光周期為L∶D=14 h∶10 h。寄主印度谷螟Plodiainterpunctella的飼養(yǎng)方法參照Phillips and Strand(1994)。

麥蛾柔繭蜂羽化成蟲供以20%蜂蜜水飼喂2～3 d,同時雌雄混合充分交配。寄生時,挑取健康的4～5齡印度谷螟幼蟲于透氣有蓋飼養(yǎng)盒中,按1∶10(寄生蜂:寄主)比例接入交配后的麥蛾柔繭蜂雌蜂。寄生48 h后,將雌蜂取出,并繼續(xù)飼養(yǎng)被寄生的印度谷螟幼蟲。再于10～11 d后麥蛾柔繭蜂開始化蛹,收集蜂蛹于指形管中,待其羽化。

1.2 形態(tài)觀察與測量

寄生48 h以后,參照Pezzini等(2017)的區(qū)分齡期法分別取1～4齡幼蜂各15頭,解剖各齡幼蜂,取其唾液腺,并采用VHX-2000超景深三維顯微系統(tǒng)(美國基恩士公司)拍照,并測量唾液腺管道長度(從前端至末端分段累計測量)、幼蟲體長和體寬。

1.3 透射電鏡觀察

1.3.1樣品制備

將解剖的唾液腺浸沒于2.5%戊二醛溶液中進行固定,4℃過夜,后移除戊二醛,加入5%瓊脂糖溶液,待冷卻凝固后切去多余瓊脂塊。用0.1M pH7.0磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min。加入1%四氧化鋨溶液浸沒樣品,再次固定1～2 h,后移除溶液,用0.1M pH7.0磷酸緩沖液漂洗樣品3次,每次15 min。樣品依次經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%梯度濃度的乙醇溶液和純丙酮進行脫水處理,每個濃度處理樣品20 min后,再依次用Spurr包埋劑與丙酮的混合溶液I(1∶1,v/v)和混合溶液II(31,v/v)分別處理樣品1 h和3 h,后用純包埋劑處理,室溫過夜,進行滲透。將滲透處理后的樣品進行包埋,70℃過夜。

1.3.2結(jié)構(gòu)觀察

樣品在LEICA EM UC7型冷凍超薄切片機(德國徠卡公司)中切片,獲得厚度70～90 nm的切片,切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色5～10 min,在Hitachi H-7650型透射電鏡(日本日立公司)80 kV條件下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

麥蛾柔繭蜂幼蟲各齡蟲體大小以及唾液腺管長等測量重復(fù)6次以上。形態(tài)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Tang and Zhang,2013),兩個平均數(shù)之間比較的差異顯著性分析采用t測驗,多個平均數(shù)之間比較的差異顯著性分析采用單因素方差分析和LSD檢驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1 唾液腺形態(tài)

麥蛾柔繭蜂幼蟲的唾液腺為一對管狀腺體,色透明至乳白色,呈彎曲折疊狀(圖1)。唾液腺從口腔沿中腸兩側(cè)向后延伸,包埋于大量脂肪體中。根據(jù)唾液腺的形態(tài),可分成三部分:(1)與口腔連接的前部;(2)成環(huán)狀的中部;(3)延伸至蟲體尾部的后部。前部腺體管長相對較短,一對腺體在腺管頂端匯合后開口于幼蜂口腔內(nèi);中部腺體管道彎曲折疊形成不規(guī)則環(huán)狀,腺管外附著較多脂肪體;后部末端閉合成盲管,較尖。

圖1 麥蛾柔繭蜂4齡幼蟲唾液腺的顯微形態(tài)

2.2 唾液腺生長發(fā)育

麥蛾柔繭蜂唾液腺均隨幼蟲的生長發(fā)育呈線性增長,且不同齡期單側(cè)唾液腺的管道長度之間呈極顯著差異(F=85.06, df=3,32,P<0.01)(圖2)。單側(cè)唾液腺管道均極顯著長于相同齡期幼蟲的體長和體寬(1齡:F=398.89, df=2,12,P<0.01;2齡:F=124.56, df=2,27,P<0.01;3齡:F=330.96, df=2,27,P<0.01;4齡:F=391.63, df=2,30,P<0.01)。相對于麥蛾柔繭蜂幼蟲體長變化,單側(cè)腺管長度的變化較為平緩,但不同齡期的比值差異仍達極顯著(F=45.56, df=3,32,P<0.01);相對于幼蟲體寬變化,單側(cè)腺管長度比值隨幼蟲生長呈下降趨勢,后隨齡期增長而比值變化趨于平緩,且不同齡期間的差異達極顯著(F=117.63, df=3,32,P<0.01)。這表明該幼蟲唾液腺的增長速率在幼蟲高齡階段已明顯低于蟲體的增長速率。

圖2 麥蛾柔繭蜂不同齡期幼蟲唾液腺大小的變化

2.3 唾液腺超微結(jié)構(gòu)

麥蛾柔繭蜂幼蟲唾液腺呈中空管道結(jié)構(gòu),管道由單層細胞構(gòu)成(圖3-A),且其細胞核形狀多呈不規(guī)則狀,核內(nèi)物質(zhì)不規(guī)則分散,染色質(zhì)濃密(圖3-B)。根據(jù)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu),可大致為兩類細胞:I型細胞和II型細胞。I型細胞富含線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和囊泡(圖3-C,D),微絨毛長而致密(圖3-C),不僅有較多糖原分布,而且在囊泡中存在運輸?shù)姆置陬w粒(圖3-E),部分I型細胞中能觀察到脂滴(3-F)。

圖3 麥蛾柔繭蜂幼蟲唾液腺I型細胞的超微結(jié)構(gòu)

II型細胞呈單層(圖4-A),微絨毛短而疏(圖4-B),胞內(nèi)雖含大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細胞器(圖4-C),亦可見有糖原分布(圖4-D),但少見有囊泡分布。

圖4 麥蛾柔繭蜂幼蟲唾液腺II型細胞的超微結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

昆蟲唾液腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能因種類不同而極具多樣性(黃志君等,2007)。麥蛾柔繭蜂幼蟲的唾液腺呈管腔狀,單側(cè)腺體在中部先分支、后合并成一不規(guī)則環(huán)狀,端部尖且呈單盲管狀。這與現(xiàn)有報道的其他昆蟲唾液腺如半翅目捕食性蝽Brontocoristabidus由導(dǎo)管連接前后肺葉狀主腺和管狀副腺組成(Carvalhoetal.,2021)、雙翅目吸血蠓由葡萄腺泡狀主腺和突起狀副腺組成(甯媛,2021)、鱗翅目蛺蝶簡單管狀腺體(Eberhard and Krenn,2003)和膜翅目意大利工蜂Apismellifera由扁平梨狀頭腺和管狀胸腺組成(Sch?nitzer and Seifert,1990;Poiani and Cruz-Landim,2009)等形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯不同,且與已報道的寄生蜂唾液腺如粘蟲稀網(wǎng)姬小蜂幼蟲的長梭狀(Nakamatsu and Tanaka,2003)、川硬皮腫腿蜂幼蟲的管狀和成蟲的袋狀(蔣學(xué)建等,2005)以及蝶蛹金小蜂幼蟲的長柄葫蘆狀(任朝都,2021)等形態(tài)差異較大,推測可能與所屬類群以及生活習(xí)性等差異較大有關(guān)。麥蛾柔繭蜂幼蟲唾液腺的位置分布和腺管被脂肪體包裹等特征卻與韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga(宋建等,2004;高歡歡等,2015)和家蠶Bombyxmori(Zhangetal., 2006)的較為相似。

麥蛾柔繭蜂幼蟲唾液腺管壁由單層細胞構(gòu)成。唾液腺細胞似有兩類細胞組成,其差異在于胞內(nèi)是否含有大量囊泡。I型細胞具有大量囊泡,與粘蟲稀網(wǎng)姬小蜂(Nakamatsu and Tanaka,2003)唾液腺中觀察到的具有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和囊泡的細胞相似,推測I型細胞主要參與胞內(nèi)物質(zhì)合成與分泌有關(guān)。此外,還觀察到了囊泡運輸分泌顆?，F(xiàn)象。麥蛾柔繭蜂唾液腺胞內(nèi)分泌顆粒密度較小,與蝶蛹金小蜂(任朝都,2021)和錐形禾草鏟頭沫蟬Cloviaconifera(鐘海英,2011)等唾液腺胞內(nèi)電子密度較大的分泌顆粒存在明顯差異。這可能和不同昆蟲種類唾液腺的分泌物質(zhì)不同有關(guān)。麥蛾柔繭蜂唾液腺中的II型細胞明顯缺少胞內(nèi)囊泡,而且微絨毛短而稀疏,推測主要參與細胞增殖與滋養(yǎng)。有關(guān)麥蛾柔繭蜂唾液腺的結(jié)構(gòu)和唾液合成與分泌功能的相互適應(yīng)機制、唾液的組成及其與寄主間的互作機制有待今后進一步深入研究。