舞毒蛾谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)楊樹(shù)次生物質(zhì)協(xié)同溴氰蟲(chóng)酰胺的脅迫響應(yīng)

范程程,李明俊,許力山,齊 琪,孫麗麗,曹傳旺*

(1. 東北林業(yè)大學(xué)森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營(yíng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 15004;2. 內(nèi)蒙古赤峰市寧城縣坤頭河林場(chǎng),寧城 024228)

昆蟲(chóng)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)在異源化合物的解毒中起重要作用,并與殺蟲(chóng)劑抗性有關(guān)(Huangetal., 2011)。GSTs主要催化親電化合物與還原性谷胱甘肽(GSH)的巰基結(jié)合,對(duì)底物進(jìn)行親核代謝,使合成產(chǎn)物更易溶于水和排泄(Habigetal., 1974)。植物通過(guò)產(chǎn)生對(duì)昆蟲(chóng)有害或有毒的次生物質(zhì)來(lái)抵御植食性昆蟲(chóng),同時(shí)對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶具有誘導(dǎo)作用(Howe and Herde, 2015),昆蟲(chóng)為了降低植物次生物質(zhì)帶來(lái)的不利影響,也進(jìn)化出多種適應(yīng)性機(jī)制,例如體內(nèi)作用靶標(biāo)發(fā)生變化,各種代謝酶誘導(dǎo)表達(dá)等(陳澄宇等, 2015)。綠盲蝽Apolyguslucorum、斜紋夜蛾Spodopteralitura、麥紅吸漿蟲(chóng)Sitodiplosismosellena等昆蟲(chóng)取食不同的植物次生物質(zhì)后,能夠誘導(dǎo)GST基因表達(dá)上調(diào)(黃敏燕等, 2018;朱香鎮(zhèn)等, 2018;陳銳等, 2020)。

溴氰蟲(chóng)酰胺(Cyantraniliprole)是新型鄰二苯甲酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑,具有高效低毒、殺蟲(chóng)范圍廣、安全、不易產(chǎn)生交互抗性等特性(胡譯文等, 2016;李增鑫, 2021)。亞致死劑量溴氰蟲(chóng)酰胺處理甜菜夜蛾Spodopteraexigua、灰飛虱Laodelphaxstriatellus、小地老虎Agrotisypsilon,昆蟲(chóng)體內(nèi)GST活力表現(xiàn)為明顯的誘導(dǎo)作用,表明GST參與昆蟲(chóng)解毒并起到關(guān)鍵作用(余慧靈, 2018;何發(fā)林等, 2019;張凱倫等, 2020)。

昆蟲(chóng)響應(yīng)次生物質(zhì)與化學(xué)殺蟲(chóng)劑的共脅迫毒理研究已有相關(guān)報(bào)道。董向麗等(1998)研究表明蕓香苷與甲基對(duì)硫磷聯(lián)合處理可以大幅度提高棉鈴蟲(chóng)HelicoverpaarmigeraGST的活性。蕓香苷、槲皮素和2-十三烷酮可誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)GST活性升高,槲皮素處理組對(duì)甲基對(duì)硫磷的敏感性降低近50%,蕓香苷和2-十三烷酮處理組對(duì)甲基對(duì)硫磷的敏感性略有降低(高希武, 1997)。植物化感物質(zhì)可以誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)GST活性,可以利用其寄主的植物化感物質(zhì)來(lái)闡述其對(duì)滅多威和毒死蜱的防御(Zhuetal., 2017)。韭菜遲眼蕈蚊Bradysiaodoriphaga在大蒜和腐殖質(zhì)飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)GST活性高于在韭菜和平菇上飼養(yǎng)的幼蟲(chóng),所以在大蒜和腐殖質(zhì)上飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)抗脅迫能力增強(qiáng)(Chenetal., 2018)。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于楊樹(shù)次生物質(zhì)參與舞毒蛾響應(yīng)殺蟲(chóng)劑代謝機(jī)制研究甚少,因此,本文通過(guò)在飼料中分別添加寄主楊樹(shù)次生物質(zhì)(黃酮、槲皮素、蘆丁)以及溴氰蟲(chóng)酰胺,測(cè)定舞毒蛾幼蟲(chóng)存活率、GST活性及其基因的表達(dá)量,從基因和蛋白水平評(píng)價(jià)楊樹(shù)次生物質(zhì)對(duì)舞毒蛾響應(yīng)溴氰蟲(chóng)酰胺敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

舞毒蛾卵塊采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市寧城縣坤頭河林場(chǎng),人工飼料購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與自然保護(hù)研究所。將舞毒蛾卵塊包裹于紗布中后浸泡于10%～15%甲醛溶液40 min,自來(lái)水沖洗10 min并晾干水分,幼蟲(chóng)孵化后置于人工氣候箱內(nèi)(25℃、光周期14 L∶10 D、相對(duì)濕度70%)進(jìn)行飼養(yǎng),挑取健康、大小一致的舞毒蛾2齡幼蟲(chóng)作為供試?yán)ハx(chóng)。

1.2 主要試劑

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司。SYBR Green Real-time PCR Master mix熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Toyobo公司;RNeasy Mini購(gòu)自Qiagen公司;Taq聚合酶及PCR相關(guān)試劑、Prime ScriptTMRT reagent Kit cDNA合成試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。黃酮(Flavone)原藥(99.0%)購(gòu)自Amresco公司,槲皮素(Quercetin)原藥(97.0%)購(gòu)自Scientific Instrument公司,蘆丁(Rutin)原藥(95.0%)購(gòu)自上海九鼎化學(xué)科技有限公司,溴氰蟲(chóng)酰胺原藥(97.0%)購(gòu)自DuPont公司。

1.3 舞毒蛾致毒處理

黃酮、槲皮素和蘆丁含量的選擇參考楊樹(shù)葉片次生物質(zhì)含量及相關(guān)脅迫濃度,3種次生物質(zhì)的含量分別為黃酮0.8%(w/w)、槲皮素0.02%(w/w)和蘆丁0.5%(w/w)。根據(jù)毒力測(cè)定結(jié)果(表1),將溴氰蟲(chóng)酰胺處理舞毒蛾2齡幼蟲(chóng)48 h亞致死濃度LC30(4.06 mg/L)作為處理濃度。黃酮(8.8 g/L)、槲皮素(0.22 g/L)、蘆丁(5.5 g/L)經(jīng)換算后分別與溴氰蟲(chóng)酰胺(4.06 mg/L)混合作為聯(lián)合處理1、聯(lián)合處理2和聯(lián)合處理3。將不同藥劑溶于二甲基亞砜(DMSO)后混入人工飼料作為處理組,對(duì)照組為加入等量DMSO的人工飼料。

表1 溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)舞毒蛾2齡幼蟲(chóng)48 h毒力

選擇健康、活潑、大小一致舞毒蛾2齡幼蟲(chóng)饑餓24 h后,分別接入含溶劑DMSO、黃酮、槲皮素、蘆丁、溴氰蟲(chóng)酰胺、聯(lián)合處理1、聯(lián)合處理2、聯(lián)合處理3的飼料中,每個(gè)處理20頭幼蟲(chóng),重復(fù)4次,處理后于6 h、12 h、24 h、48 h隨機(jī)挑取活潑的舞毒蛾2齡幼蟲(chóng),經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃冰箱,用于后續(xù)檢測(cè)GST活性及其基因表達(dá)量。

1.4 舞毒蛾GST活性測(cè)定

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測(cè)定按照GST活性檢測(cè)試劑盒(Solarbio)說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行,活性單位為μmol/min/mg protein。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用Bradford(1976)的考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

采用RNeasy Mini動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取對(duì)照和不同處理的舞毒蛾樣品總RNA。采用Prime ScriptTMRT reagent Kit cDNA合成試劑盒將各處理組0.5 μg Total RNA分別合成cDNA,作為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR模板。選擇課題組前期從舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得的經(jīng)次生物質(zhì)處理后可引起基因誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的GST基因(LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1)作為候選基因(王振越, 2020),檢測(cè)GST基因表達(dá)量。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR使用SYBR Green Real-time PCR Master mix試劑盒,內(nèi)參為Actin和EF1α基因,引物序列見(jiàn)表2。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為2×SYBR premix Ex Taq酶10 μL、Primer mix (10 μmol/L) 1 μL、cDNA 2 μL,使用DEPC水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s,94℃變性12 s,60℃退火45 s,72℃延伸45 s,81℃讀板1 s,45個(gè)循環(huán),每個(gè)樣品重復(fù)3次。

表2 目的基因RT-qPCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,運(yùn)用SPSS 17.0軟件,采用Duncan方法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行繪圖。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR數(shù)據(jù)經(jīng)儀器自帶的Opticon Monitor 3軟件處理。舞毒蛾GST基因表達(dá)量用2-△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析(Pfaffl, 2001)。

Abott公式用于評(píng)估聯(lián)合藥劑對(duì)受試對(duì)象的聯(lián)合毒性(Gisi, 1996;Gatidou and Thomaidis, 2007),期望抑制率Cexp及復(fù)合脅迫表征值RI分別用下式表示:

Cexp= A+B-AB /100%;RI=OI / Cexp

式中A、B分別表示單一組分脅迫抑制率;OI為聯(lián)合脅迫抑制率;RI用于判斷兩種組分對(duì)受試對(duì)象的聯(lián)合毒性;RI<1表現(xiàn)為毒性拮抗,RI=1表現(xiàn)為毒性簡(jiǎn)單相加,RI>1表現(xiàn)為毒性協(xié)同(Chesworthetal., 2004)。

2 結(jié)果與分析

2.1 次生物質(zhì)與溴氰蟲(chóng)酰胺聯(lián)合作用對(duì)舞毒蛾存活率的影響

舞毒蛾2齡幼蟲(chóng)在不同脅迫處理下48 h存活率不同(表3)。處理48 h后,對(duì)照組(DMSO)、槲皮素、蘆丁處理組幼蟲(chóng)存活率為100%,黃酮處理組存活率為93.33%。溴氰蟲(chóng)酰胺處理組幼蟲(chóng)存活率為66.67%,顯著低于對(duì)照(DMSO)和次生物質(zhì)單劑處理組(P<0.05)。在48 h,3個(gè)聯(lián)合處理組幼蟲(chóng)存活率與溴氰蟲(chóng)酰胺處理組差異不顯著。存活率依次為53.33%、60.00%和53.33%。聯(lián)合處理1、聯(lián)合處理2和聯(lián)合處理3聯(lián)合脅迫表征值分別為1.24、1.20和1.40,聯(lián)合毒性均表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表3 次生物質(zhì)和溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)存活率的影響

2.2 次生物質(zhì)與溴氰蟲(chóng)酰胺聯(lián)合作用對(duì)GST活性的影響

除了6 h之外,不同植物次生物質(zhì)單獨(dú)處理后的酶活性均有誘導(dǎo)增加作用。與黃酮和蘆丁處理組相比,槲皮素處理組在24 h和48 h對(duì)GST酶的誘導(dǎo)作用更強(qiáng),分別為2.65 μmol/min/mg protein和2.43 μmol/min/mg protein。溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)GST活性誘導(dǎo)效果顯著高于單一次生物質(zhì)作用,24 h誘導(dǎo)效果最大,為2.79 μmol/min/mg protein,為對(duì)照組的2.36倍。除聯(lián)合處理1在6 h、12 h的GST誘導(dǎo)活性分別低于溴氰蟲(chóng)酰胺處理6 h、12 h活性外,各聯(lián)合處理組的GST誘導(dǎo)活性均高于溴氰蟲(chóng)酰胺處理組。聯(lián)合處理2在24 h和48 h誘導(dǎo)活性分別為3.65 μmol/min/mg protein和 3.24 μmol/min/mg protein,分別為對(duì)照組的3.09倍和3.12倍,顯著高于聯(lián)合處理組1和聯(lián)合處理3。溴氰蟲(chóng)酰胺和聯(lián)合處理脅迫對(duì)GST的誘導(dǎo)趨勢(shì)均表現(xiàn)為先升高后降低,且在24 h達(dá)到峰值(圖1)。

圖1 次生物質(zhì)和溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)舞毒蛾2齡幼蟲(chóng)GST活性影響

2.3 次生物質(zhì)與溴氰蟲(chóng)酰胺聯(lián)合作用對(duì)GST基因表達(dá)的影響

不同脅迫處理對(duì)舞毒蛾2齡幼蟲(chóng)GST基因LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1表達(dá)的影響如圖2所示。不同脅迫處理均使LdGSTe2基因表達(dá)水平上調(diào)。蘆丁處理6～24 h,LdGSTe2表達(dá)量顯著高于其它次生物質(zhì)處理組,且在6 h基因表達(dá)量上升至最大值,是對(duì)照組的24.08倍。3組聯(lián)合處理6 hLdGSTe2基因表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組,分別為對(duì)照組的3.15倍、37.98倍和6.48倍,高于溴氰蟲(chóng)酰胺單劑的基因表達(dá)量,其中聯(lián)合處理2的誘導(dǎo)作用顯著高于其它處理組。

圖2 次生物質(zhì)和溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)GST基因表達(dá)量影響

圖2 次生物質(zhì)和溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)舞毒蛾幼蟲(chóng)GST基因表達(dá)量影響

次生物質(zhì)和溴氰蟲(chóng)酰胺脅迫均使LdGSTs1基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。黃酮組處理48 h后,LdGSTs1基因表達(dá)量顯著高于槲皮素處理組和蘆丁組的基因表達(dá)量,為對(duì)照的10.88倍。溴氰蟲(chóng)酰胺處理組LdGSTs1表達(dá)量為對(duì)照組基因表達(dá)量的1.02～3.71倍,且除6 h和24 h外,溴氰蟲(chóng)酰胺在12 h和48 h基因表達(dá)量顯著低于蘆丁和槲皮素處理組基因表達(dá)量。3種聯(lián)合處理6 h、12 h和48 hLdGSTs1表達(dá)水平顯著上調(diào),聯(lián)合處理1處理48 hLdGSTs1基因表達(dá)水平顯著升高,為對(duì)照組基因表達(dá)量的11.21倍。聯(lián)合處理2處理12 h,LdGSTs1表達(dá)量為對(duì)照組的5.22倍。聯(lián)合處理3處理6 h,LdGSTs1表達(dá)量上升至最大值,為對(duì)照組基因表達(dá)量的10.88倍。

黃酮處理48 hLdGSTs2基因表達(dá)量顯著升高,為對(duì)照組基因表達(dá)量的33.02倍,但在其它時(shí)間點(diǎn)LdGSTs2的相對(duì)表達(dá)量則較對(duì)照組顯著降低。槲皮素處理24 h,LdGSTs2的表達(dá)水平顯著降低,為對(duì)照的27.09%。溴氰蟲(chóng)酰胺處理6 h,LdGSTs2的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照,為對(duì)照的24.06倍,同時(shí)6～24 h的基因相對(duì)表達(dá)量均高于次生物質(zhì)處理組。3種聯(lián)合處理6 h,LdGSTs2相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào),聯(lián)合處理3的基因表達(dá)量最大,為對(duì)照的33.02倍,但12～48 h聯(lián)合處理1和聯(lián)合處理2LdGSTs2相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組。

次生物質(zhì)脅迫下LdGSTz1相對(duì)表達(dá)量上調(diào),其中槲皮素處理組LdGSTz1基因表達(dá)量高于其它次生物質(zhì)處理組,且在48 h基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高值,為對(duì)照的11.20倍。溴氰蟲(chóng)酰胺處理24 h后,LdGSTz1的基因表達(dá)量為對(duì)照的2.96倍,但在12 h 和48 h的基因表達(dá)量均低于次生物質(zhì)處理組。3種聯(lián)合處理組LdGSTz1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。聯(lián)合處理1處理12 h基因表達(dá)量達(dá)到峰值,為對(duì)照的3.77倍,但在12～48 h的基因表達(dá)水平逐漸降低。聯(lián)合處理2在12 h的基因表達(dá)量最低,為對(duì)照的1.62倍,但隨時(shí)間延長(zhǎng)基因表達(dá)逐漸升高。聯(lián)合處理3組的基因表達(dá)水平表現(xiàn)為先升高后降低。在6～24 h的基因表達(dá)量由對(duì)照的1.64倍上升至對(duì)照的4.44倍,但在48 h降低至對(duì)照的1.83倍。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的升高可以加快對(duì)外源有毒物質(zhì)的代謝過(guò)程,增強(qiáng)昆蟲(chóng)對(duì)逆境的適應(yīng)性(李時(shí)榮等, 2018;樊艷平等, 2020)。氯氟氰菊酯、氟蟲(chóng)腈和硫丹3種殺蟲(chóng)劑處理馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsadecemlineata后,LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTo5和LdGSTt1均顯著過(guò)量表達(dá)(Hanetal., 2016)。甲氧蟲(chóng)酰肼處理棉鈴蟲(chóng)48 h后GSTs1相對(duì)表達(dá)量顯著升高,而GSTe2表達(dá)量先降低后升高,表明GSTs1和GSTe2通過(guò)表達(dá)量的變化影響GST酶活力進(jìn)而形成對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性(徐希寶等, 2014);水楊酸和蘆丁飼喂舞毒蛾后,可使LdGSTe4和LdGSTo1顯著誘導(dǎo)表達(dá),將該基因沉默后會(huì)導(dǎo)致幼蟲(chóng)對(duì)水楊酸和蘆丁的適應(yīng)性降低(Maetal., 2021)。舞毒蛾LdGSTe2、LdGSTs1、LdGSTs2和LdGSTz1基因在對(duì)次生物質(zhì)的脅迫響應(yīng)中表達(dá)量顯著升高,將舞毒蛾相關(guān)GST基因沉默后,導(dǎo)致幼蟲(chóng)對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力減弱,證實(shí)昆蟲(chóng)對(duì)不良環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制與GST基因的表達(dá)密切相關(guān)(王振越,2020)。次生物質(zhì)和溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)舞毒蛾GST主要表現(xiàn)為顯著誘導(dǎo)效應(yīng),其中聯(lián)合處理脅迫下的GST酶活性主要表現(xiàn)為高于溴氰蟲(chóng)酰胺處理,但與各聯(lián)合處理所對(duì)應(yīng)的次生物質(zhì)單劑相比顯著上升,且呈現(xiàn)不同的時(shí)間-活力趨勢(shì)變化。

害蟲(chóng)取食不同寄主植物后,對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性可分為3類(lèi):敏感性下降、無(wú)明顯變化以及升高(姚洪渭等, 2002)。本研究綜合評(píng)價(jià)3種楊樹(shù)次生物質(zhì)黃酮、槲皮素、蘆丁影響舞毒蛾對(duì)溴氰蟲(chóng)酰胺敏感性,次生物質(zhì)與溴氰蟲(chóng)酰胺聯(lián)合毒性效果均為協(xié)同作用。舞毒蛾在次生物質(zhì)的誘導(dǎo)下,GST解毒活性升高,基因表達(dá)水平增加,證明GST相關(guān)基因參與了舞毒蛾對(duì)植物次生物質(zhì)的解毒代謝過(guò)程(Maetal., 2021),舞毒蛾抗藥性增強(qiáng),敏感性下降,受到化學(xué)藥劑脅迫后,舞毒蛾死亡率上升,這是因?yàn)榧闹髦参镏械拇紊镔|(zhì)誘導(dǎo)激活或抑制昆蟲(chóng)體內(nèi)與殺蟲(chóng)劑代謝相關(guān)的解毒酶系,導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)藥劑敏感性發(fā)生變化(Nenaetal., 2018)。次生物質(zhì)飼喂水稻、小麥、狗尾巴草誘導(dǎo)的中華稻蝗Oxyachinensis體內(nèi)GST活性的變化是導(dǎo)致其對(duì)馬拉硫磷敏感性差異的原因之一(張睿, 2008)。飼喂蕓香苷后,提高了棉鈴蟲(chóng)對(duì)甲基對(duì)硫磷和滅多威的耐藥性,棉鈴蟲(chóng)取食槲皮素提高了其F2代對(duì)滅多威的毒力;取食2-十三烷酮后,提高了棉鈴蟲(chóng)對(duì)溴氰菊酯的耐藥性(董向麗等, 1998)。斜紋夜蛾幼蟲(chóng)飼喂大豆和菜花后對(duì)丙烯磷有較高的GST誘導(dǎo)活性(Karuppaiahetal., 2016)。因此,在制定舞毒蛾的防治策略時(shí),應(yīng)考慮不同寄主植物對(duì)舞毒蛾解毒酶的誘導(dǎo)和毒性改變的重要性,這為植物與昆蟲(chóng)互作提供更加豐富的理論依據(jù),并指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐中殺蟲(chóng)劑的合理使用。