取食臭椿不同部位對溝眶象和臭椿溝眶象成蟲消化解毒酶的影響

馬天馳,溫俊寶

(北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點實驗室,北京 100083)

溝眶象Eucryptorrhynchusscrobiculatus和臭椿溝眶象E.brandti同屬鞘翅目象甲科溝眶象屬EucryptorrhynchusHeller(趙養(yǎng)昌和陳元清,1980)。過去十幾年,兩種象甲嚴重危害寧夏園林綠化及農(nóng)田防護林主要造林樹種臭椿。國內(nèi)目前主要是把溝眶象和臭椿溝眶象作為一種鉆蛀性害蟲來研究(胡婷和張蕊,2019;王謙,2019;張志偉等,2019)。在國外(主要是美國和歐洲),臭椿被認為是外來入侵種(Espenschied-Reillyetal.,2008; Terzietal.,2021),相關(guān)研究集中在把這兩種象甲作為天敵昆蟲來防治臭椿,而臭椿溝眶象是研究和利用的重點(Kowariketal.,2008;Herricketal.,2012)。

溝眶象幼蟲取食臭椿樹根,臭椿溝眶象幼蟲取食樹干木質(zhì)部和韌皮部;臭椿溝眶象成蟲主要取食臭椿主干,而溝眶象成蟲主要取食臭椿的葉柄、1年生枝以及臭椿的其他幼嫩部位(Jietal.,2017)。國內(nèi)外尚未對兩種象蟲共存于臭椿上的機制進行研究。

象甲成蟲大多有補充營養(yǎng)習(xí)性,通常被認為對成蟲產(chǎn)卵量和壽命有顯著影響(Saitoetal.,2005;高旭等,2009;張鋒,2013)。臭椿溝眶象成蟲和溝眶象成蟲在羽化后同樣要靠取食臭椿補充營養(yǎng)來達到性成熟。補充營養(yǎng)同樣會對溝眶象的產(chǎn)卵量和卵孵化率產(chǎn)生顯著影響,取食臭椿的溝眶象產(chǎn)卵量和卵的孵化率要顯著高于取食非寄主(清水、蜂蜜和蘋果)的溝眶象成蟲,而靠清水補充營養(yǎng)雌蟲產(chǎn)的卵不能正常孵化。因此,可以認為補充營養(yǎng)會對溝眶象雌性成蟲的生殖系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生顯著影響,營養(yǎng)來源關(guān)系到成蟲的產(chǎn)卵量和卵的發(fā)育(汪永俊等,1984;高旭等,2009;張艷,2015)。

前人采用臭椿不同部位(葉柄、1年生枝、2～3年生枝和主干)對溝眶象和臭椿溝眶象進行補充營養(yǎng),兩種象甲的卵巢發(fā)育程度和產(chǎn)卵量都有明顯差異。Guoetal.(2019)研究取食不同部位臭椿對臭椿溝眶象的卵巢發(fā)育程度和產(chǎn)卵影響,發(fā)現(xiàn)取食葉柄、1年生枝、2～3年生枝的臭椿溝眶象雌蟲缺少功能性卵巢,無法產(chǎn)卵,而取食主干的雌蟲會正常發(fā)育出功能性卵巢并成功產(chǎn)卵。溝眶象取食臭椿不同部位后,用葉柄飼養(yǎng)的卵巢發(fā)育程度最好,其次是主干,然后是1年生枝,而取食2～3年生枝的溝眶象不能完成卵巢發(fā)育,且無法產(chǎn)卵(郭文娟,未發(fā)表)。

植物的揮發(fā)物、物理性質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物和營養(yǎng)物質(zhì)等外部因素,昆蟲腸道微生物種類和數(shù)量,以及昆蟲消化解毒酶活性等內(nèi)部因素都對昆蟲取食行為具有重要影響。用HPLC法和光譜法檢測臭椿不同部位的次生代謝物質(zhì)如黃酮類物質(zhì)、沒食子酸、β-谷甾醇和單寧,營養(yǎng)物質(zhì)如糖、蛋白質(zhì)、粗脂肪、纖維素以及一些金屬元素等,證實這些次生代謝物和營養(yǎng)物質(zhì)在臭椿不同部位的確存在差異。推測這些次生代謝物和營養(yǎng)物質(zhì)對溝眶象和臭椿溝眶象雌成蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育造成了不同的影響,而兩種象甲中后腸的消化解毒酶也可能因此發(fā)生變化。

使用解毒酶系進行解毒代謝是昆蟲應(yīng)對寄主植物防御的一種重要方式(Feltonetal.,2008)。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、羧酸酯酶(CarE)是和細胞色素P450(CytP450)是昆蟲體內(nèi)三大解毒酶(宋維虎,2020),此前對溝眶象和臭椿溝眶象的研究沒有涉及過這3種解毒酶。因此選擇這3種解毒酶為研究目標。

另一方面,營養(yǎng)物質(zhì)吸收受損的生理成本通常與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝速率的改變相關(guān),從而導(dǎo)致食物轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)的效率降低,如豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的中腸消化酶活性和苜蓿MedicagoSativa抗性品種有關(guān),苜蓿品種的抗性越強則豌豆蚜蟲消化酶活性越弱(達麗婷等, 2015)。昆蟲體內(nèi)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物有關(guān)的主要消化酶有纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶。前期已經(jīng)對溝眶象相關(guān)纖維素酶做了研究(雍惠莉等,2007;楊貴軍等,2008;陳雅媛,2016;任媛,2017),因此選擇蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶為3種主要的消化酶。

本研究選取臭椿4種不同部位(葉柄、1年生枝、2～3年生枝、主干)飼喂溝眶象和臭椿溝眶象成蟲,并利用ELISA試劑盒測定兩種象甲的3種解毒酶(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶和細胞色素P450)和3種消化酶(胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)的活性,以探究取食臭椿不同部位對溝眶象和臭椿溝眶象成蟲消化解毒酶的影響。

1 材料和方法

1.1 供試材料

臭椿溝眶象成蟲的獲得:2021年4月在寧夏靈武市梧桐樹村(116°17′50.81″N,38°9′1.37″E)砍伐3棵約20年生受害臭椿,其中1棵沒有發(fā)芽,2棵頂部有1年生新枝條;同期,在寧夏吳忠市巴浪湖(116°12′47.98″N,37°54′36.65″E)砍伐 3棵 30～40年生受害臭椿,其中2棵沒有發(fā)芽,只有1棵頂部有當(dāng)年新枝條;所有6棵受害臭椿上均有新鮮蟲糞和流膠。將臭椿樹鋸成60～80 cm長的木段方便運輸和培養(yǎng),通過物流運回學(xué)校(116°20′49.63″N,40°0′34.01″E),在室內(nèi)遮陽遮雨,自然溫度濕度條件下用網(wǎng)罩罩住,每天檢查 1次,收集當(dāng)天羽化的臭椿溝眶象成蟲,采用陳沖等(2013)的方法來區(qū)分臭椿溝眶象雌雄蟲。

溝眶象成蟲的獲得:2021年5月24日在寧夏吳忠巴浪湖(116°12′47.98″N,37°54′36.65″E)采集了羽化不久的溝眶象成蟲,雌雄各48頭。

臭椿枝條的獲得:每周從寧夏吳忠野外農(nóng)田防護林中選擇有臭椿溝眶象取食且未施用農(nóng)藥的臭椿,采集新鮮足量的不同部位(葉柄、1年生枝、2～3年生枝條、主干),快遞寄回北京,放在冰箱中4℃冷藏,每2 d更換1次。臭椿不同部位的選擇基于Zhangetal.(2017)的方法。

臭椿溝眶象成蟲的飼養(yǎng):臭椿溝眶象開始羽化后,當(dāng)天羽化的雌/雄成蟲每4頭為1組,每4組分別放在有蓋并打孔透氣的塑料盒中用新鮮的臭椿不同部位(葉柄、1年生枝、2～3年生枝條、主干)進行飼養(yǎng)處理,每個處理6個生物學(xué)重復(fù)。臭椿溝眶象先飼養(yǎng)24 h,再饑餓處理24 h后解剖,如來不及解剖則先在超低溫冰箱80 TSX(Thermo Fisher,America) 中-80℃冰凍。飼養(yǎng)光周期14 L∶10 D,溫度25±1℃,相對濕度60%±5%。

溝眶象成蟲的飼養(yǎng):由于溝眶象在土中羽化,難以獲得剛羽化成蟲,而挖土采集老齡幼蟲或蛹的難度太大,故盡量采集羽化出土不久的成蟲進行試驗。一般成蟲背部紅色鱗片范圍越大,溝眶象成蟲越接近剛羽化。試驗用溝眶象成蟲羽化后時間約0～5 d,雌/雄成蟲每2頭為1組,快遞寄回北京林業(yè)大學(xué)森保研究室后每4組分別用新鮮臭椿不同部位(葉柄、1年生枝、2～3年生枝條、主干)在有蓋并打孔透氣的塑料盒中進行飼養(yǎng)處理。每個處理6個生物學(xué)重復(fù)。溝眶象先飼養(yǎng)24 h,再饑餓處理24 h后解剖,如果來不及解剖則在超低溫冰箱中-80℃冰凍后解剖。飼養(yǎng)光周期為14 L∶10 D,溫度25±1℃,相對濕度60%±5%。

1.2 試驗方法

1.2.1酶活液的制取

溝眶象和臭椿溝眶象解剖時,對超凈工作臺進行紫外滅菌0.5 h,所有材料和儀器預(yù)先進行滅菌。分別用70%乙醇浸泡2 min,再用磷酸鹽緩沖鹽水PBS清洗兩種象甲(Axelssonetal.,2017)。在超凈工作臺上先剪掉溝眶象和臭椿溝眶象所有足,用手分離其鞘翅,用眼科手術(shù)剪剪去其后翅,再在其背面胸腹連接處橫著剪開,沿著其背部斷口中縫剪至其肛門,在顯微鏡下觀察,用3根昆蟲針分別固定其腹部靠近腹中線的位置和體壁裂口近胸端左右側(cè),使其體壁完全展開,并固定在冰盒上的蠟板上,在體式顯微鏡Olympus 311477(Tokyo)下取出腹部的中后腸加入1.5 mL離心管中,在電子天平上稱取中后腸重量并放置在PBS(cytiva,America)緩沖液中,其中中后腸質(zhì)量∶PBS體積=1∶9質(zhì)體比,再使用手持電動組織研磨槍OSE-Y40(TIANGEN,Beijing)勻漿后,在低溫離心機Fresco 21(Thermo Fisher,America)中4℃低溫離心16 000 r/min,取出上清液,將大管中溶液再分裝5個1 mL離心管(生物學(xué)重復(fù)5次),和剩下的大管一起放在-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

解剖后樣品標記如下。EbFT:取食主干的臭椿溝眶象雌蟲;EbMT:取食主干的臭椿溝眶象雄蟲;EbFB:取食2～3年生枝條的臭椿溝眶象雌蟲;EbMB:取食2～3年生枝條的臭椿溝眶象雄蟲;EbFA:取食1年生枝條的臭椿溝眶象雌蟲;EbMA:取食1年生枝條的臭椿溝眶象雄蟲;EbFP:取食葉柄的臭椿溝眶象雌蟲;EbMP:取食葉柄的臭椿溝眶象雄蟲;EsFT:取食主干的溝眶象雌蟲;EsFT:取食主干的溝眶象雄蟲;EsFB:取食2～3年生枝條的溝眶象雌蟲;EsMB:取食2～3年生枝條的溝眶象雄蟲;EsFA:取食1年生枝條的溝眶象雌蟲;EsMA:取食1年生枝條的溝眶象雄蟲;EsFP:取食葉柄的溝眶象雌蟲;EsMP:取食葉柄的溝眶象雄蟲。

1.2.2酶活性測定

使用酶聯(lián)生物的6種酶的ELISA試劑盒(昆蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)ELISA試劑盒ml062705、昆蟲羧酸酯酶(CES)ELISA試劑盒ml036265、昆蟲細胞色素P450(CYP450)ELISA試劑盒ml036261、昆蟲胰蛋白酶(trypsin)ELISA試劑盒ml036260、昆蟲淀粉酶(AMY)ELISA試劑盒ml062684、昆蟲脂肪酶(Lipase)ELISA試劑盒ml062686)進行酶活性測定。

按試劑盒說明書加樣和檢測,具體操作如下:①加樣:設(shè)置標準品孔、樣本孔和空白孔,標準品孔中加6種不同濃度的標準品,各設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù),技術(shù)重復(fù)3次。在待測樣品孔中加樣品稀釋液40 μL與待測樣品10 μL,空白孔之加入稀釋液。分別在標準品孔和樣本孔各自加入酶標試劑100 μL。②恒溫培育:使用封板膜封好后置37℃恒溫培育1 h,并將20倍洗滌液用雙蒸水稀釋后待用。③清洗酶標板:揭掉封板膜,棄去所有液體,待甩干后往每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,重復(fù)洗滌5次,拍干酶標板。④顯色反應(yīng):每個孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL并震蕩混勻,使用錫紙包住酶標板后,在37℃恒溫條件下避光顯色,15 min后加入反應(yīng)終止液50 μL。⑤上機檢測:在酶標儀SpectraMax 190(Molecular Devices,America)上測定酶活性,使用空白孔調(diào)零,在450 nm波長下測定酶標板的吸光度(OD值)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS v26檢查3個技術(shù)重復(fù)中所測定OD值是否存在可疑數(shù)值,剔除可疑值。使用標準物的濃度與OD值在Orgin 2021b軟件中計算出標準回歸曲線,再將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度。

所有酶的酶活性單位統(tǒng)一為U/L,數(shù)值用平均值 ± 標準差表示,不同小寫字母表示其所在組的酶活性存在顯著性差異。使用Orgin 2021b中的Paired comparison Plot v3.60 app作圖,并采用單因子方差分析(ANOVA)以明確取食臭椿不同部位(葉柄、1年生枝、2～3年生枝、主干)對溝眶象和臭椿溝眶象成蟲3種解毒酶(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶和細胞色素P450)和3種消化酶(胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶)活性的影響,處理間差異顯著性分析采用Turkey檢驗(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 取食臭椿不同部位對兩種象甲成蟲細胞色素P450活性的影響

臭椿溝眶象雌蟲取食2～3年生枝條CytP450 酶活性最低,其次是取食主干,取食1年生枝組和葉柄組最高且無顯著性差異;雄蟲取食1年生枝CytP450 酶活性最低,其次是取食葉柄,取食主干較高,取食2～3年生枝條最高,1年生枝組和葉柄組,主干組和2～3年生枝組之間差異不顯著。溝眶象雌蟲取食4種不同部位后CytP450酶活性無顯著性差異;雄蟲取食葉柄CytP450酶活性最低,其次是取食主干組和2～3年生枝組,取食1年生枝組最高(圖1)。

圖1 兩種象甲細胞色素P450酶活性

2.2 取食臭椿不同部位對兩種象甲成蟲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性的影響

臭椿溝眶象雌蟲取食4種不同部位后GST酶活性無顯著性差異;雄蟲取食主干、1年生枝和2～3年生枝間GST酶活性較低,兩者間差異不顯著,取食葉柄最高。溝眶象取食葉柄雌蟲GST酶活性最低,其次是取食2～3年,取食主干和1年生枝最高,但無顯著差異;雄蟲取食葉柄GST酶活性最低,其次是取食主干和2～3年生枝,取食1年生枝最高(圖2)。

圖2 兩種象甲谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性

2.3 取食臭椿不同部位對兩種象甲成蟲羧酸酯酶活性的影響

臭椿溝眶象雌蟲取食主干和2～3年生枝CarE酶活性顯著低于取食1年生枝和葉柄;雄蟲取食2～3年生枝CarE酶活性最低,取食其它3個部位較高且無顯著差異。溝眶象雌蟲取食葉柄CarE酶活性最低,其次是取食主干,取食2～3年生枝和1年生枝組最高且無顯著差異;雄蟲取食葉柄CarE酶活性最低,其次是取食主干和2～3年生枝,取食1年生枝最高(圖3)。

圖3 兩種象甲羧酸酯酶活性

2.4 取食臭椿不同部位對兩種象甲成蟲脂肪酶活性的影響

臭椿溝眶象雌蟲取食1年生枝和主干LIP酶活性較低且無顯著性差異,取食葉柄其次,取食主干最高;雄蟲取食主干LIP酶活性最低,取食2～3年生枝其次,取食1年生枝和葉柄最高且無顯著性差異。溝眶象雌蟲取食葉柄LIP酶活性最低,取食2～3年生枝組較低,取食主干較高,取食1年生枝最高;雄蟲取食葉柄和主干LIP酶活性最低且無顯著差異,取食2～3年生枝較高,取食1年生枝最高(圖4)。

圖4 兩種象甲脂肪酶活性

2.5 取食臭椿不同部位對兩種象甲成蟲淀粉酶活性的影響

臭椿溝眶象雌蟲取食主干和2～3年生枝AMY酶活性較低且差異不顯著,取食1年生枝和葉柄較高且無顯著性差異;雄蟲1年生枝AMY酶活性最低,其次取食主干,取食2～3年生枝和葉柄最高且無顯著性差異。溝眶象雌蟲取食葉柄、主干和2～3年生枝AMY酶活性最低且無顯著差異,取食1年生枝較高;雄蟲取食葉柄和主干AMY酶活性最低且差異不顯著,取食2～3年生枝和1年生枝最高,但兩者差異不顯著(圖5)。

圖5 兩種象甲淀粉酶活性

2.6 取食臭椿不同部位對兩種象甲成蟲胰蛋白酶活性的影響

臭椿溝眶象雌蟲取食主干和2～3年生枝TRP酶活性較低,無顯著性差異;而取食1年生枝和葉柄較高,無明顯地差異;雄蟲取食1年生枝TRP酶活性最低,取食其他3個部位較高。溝眶象雌蟲取食主干TRP酶活性最低,其次是取食2～3年生枝,而取食葉柄相對較高,取食1年生枝最高;雄蟲取食4種不同部位后TRP酶活性無顯著性差異(圖6)。

圖6 兩種象甲胰蛋白酶活性

3 結(jié)論與討論

臭椿溝眶象雌蟲取食主干后,解毒酶中CytP450酶活性較低,GST酶活性變化不顯著,CarE酶活性最低,消化酶中LIP、AMY和TRP均為酶活性最低;而溝眶象雌蟲取食2～3年生枝后,解毒酶中CytP450酶活性變化不顯著,GST酶活性較低,CarE酶活性最高,消化酶中LIP和TRP酶活性較高,AMY活性最低。

考慮到Guoetal.(2019)的結(jié)論是只有取食主干的臭椿溝眶象雌成蟲能正常產(chǎn)卵,以及只有取食2～3年生枝的溝眶象雌成蟲不能正常產(chǎn)卵。如果兩種象甲雌成蟲取食臭椿不同部位(主干、2～3年生枝、1年生枝和葉柄)后的不能正常產(chǎn)卵和本研究中某一種消化酶或者解毒酶有關(guān)的話,則臭椿溝眶象取食主干組的雌成蟲該種消化酶活性應(yīng)該顯著較高,或者該種解毒酶活性較低;而溝眶象取食2～3年生枝組的雌成蟲該種消化酶活性應(yīng)該顯著較低,或該種解毒酶活性應(yīng)該顯著較高。因此臭椿溝眶象雌成蟲只有取食主干能順利產(chǎn)卵和取食主干CarE酶活性較低有關(guān),溝眶象雌成蟲只有取食2～3年生枝不能產(chǎn)卵和CarE酶活性較高以及AMY酶活性較低有關(guān)。

營養(yǎng)是影響昆蟲雌蟲交配和生殖的重要因素,成蟲的補充營養(yǎng)行為會對雌蟲的潛在生殖能力和實際的生殖能力起著重要作用(王竑晟,2003)。因為寄主植物的生長量以及營養(yǎng)質(zhì)量能夠影響昆蟲的內(nèi)分泌和生長,從而導(dǎo)致昆蟲個體遺傳差異以及昆蟲種群間遺傳分化(Geisert and Meinke, 2013)。由此可見,寄主不同部位的營養(yǎng)若存在差異,對于取食該寄主不同部位的昆蟲,例如溝眶象和臭椿溝眶象這兩個近緣種,可能使這兩種象甲雌成蟲補充營養(yǎng)后的生殖能力產(chǎn)生差異。

植物為了抵御植食性昆蟲的取食,通過形態(tài)學(xué)以及化學(xué)分子調(diào)控等多種方式,對植食性昆蟲產(chǎn)生防御機制(王亞軍等,2017)。植物次生代謝物是通常不被昆蟲作為營養(yǎng)物質(zhì)利用,而一般起到植物防御昆蟲取食的作用,影響昆蟲對寄主的選擇、利用和攝食(姜虹,2017;李明等,2017)。植物次生代謝物同樣會影響昆蟲的生長發(fā)育,如植物提取物槲皮素處理瓜實蠅Bactroceracucurbitae的卵和幼蟲后,會抑制其卵的孵化以及幼蟲的生長發(fā)育 (Sharma and Sohal, 2013)。昆蟲使用化學(xué)感器識別和感受植物次生代謝物,在昆蟲對寄主的選擇中發(fā)揮了重要的作用(Pickettsetal., 1992;戴建青等,2010)。雖然沒有直接證據(jù)表明同一寄主植物不同部位次生代謝物對昆蟲成蟲的生長發(fā)育會產(chǎn)生影響,但是有研究表明寄主植物的次生代謝物確實能對昆蟲成蟲的生長發(fā)育造成影響,臭椿不同位置的次生代謝物差異也可能是兩種象甲野外取食分布差異的原因。

酶活性的變化能在短時間之內(nèi)反應(yīng)寄主昆蟲體內(nèi)的情況,通過對酶活性的分析有利于了解不同取食對寄主昆蟲產(chǎn)生的影響。本研究也證明,即使是同一種植物,取食的部位不同仍然會對昆蟲的消化解毒酶產(chǎn)生顯著性的影響。

本研究明確了寄主植物不同部位對這兩種象甲成蟲中后腸消化解毒酶活性的影響,分析了兩種象甲剛羽化雌成蟲補充營養(yǎng)造成生殖系統(tǒng)發(fā)育差異的原因,對后續(xù)這兩種象甲消化解毒酶相關(guān)研究有一定參考價值。