黑水虻幼蟲抗菌肽HI-3對結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞凋亡影響及其機(jī)制研究

馮 群,徐晨露,崔會程,孫虹霞,夏 嬙*

(1. 遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū),廣東珠海 519041;2. 遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院,貴州遵義 563000)

黑水虻HermetiaillucensL. (Black soldier fly)是近年來備受關(guān)注的資源昆蟲,主要用于有機(jī)廢棄物的無害化處理(Priyambadaetal., 2021)、禽畜和水產(chǎn)飼料添加劑的使用(Daszkiewiczetal., 2022; Shangetal., 2022)以及抗菌肽的研究與開發(fā),尤其在抗菌肽的研發(fā)領(lǐng)域成為新的關(guān)注點(diǎn)(Zhangetal., 2022)。研究表明,黑水虻抗菌肽具有良好的抑菌活性,可以有效抑制大腸桿菌、耐甲氧西林的葡萄球菌、銅綠假單胞菌及肺炎克雷伯菌等的生長(Leeetal., 2020; van Molletal., 2022),在未來醫(yī)藥研發(fā)方面具有重要潛能。然而,關(guān)于黑水虻抗菌肽的研究還多停留在抑菌方面,其抗癌作用及機(jī)制的研究還較少。

結(jié)腸癌是全球五大惡性腫瘤之一,2020年發(fā)病率占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的10%,死亡率占所有惡性腫瘤死亡病例的9.4%(Caoetal., 2021),且具有多藥耐藥性現(xiàn)象(Raúletal., 2021),嚴(yán)重威脅人類的生命安全。如何提高結(jié)腸癌藥物靶向性及緩解耐藥性已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

課題組前期研究表明,黑水虻幼蟲抗菌肽HI-3對豚鼠正常紅細(xì)胞及HEK293正常細(xì)胞無顯著影響,但可以顯著抑制HCT-8細(xì)胞的增殖(馮群等,2022),其抑制增殖與谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路抑制顯著相關(guān)(高嘉敏等,2021),但與凋亡是否相關(guān)及其具體機(jī)制尚不清楚。

本研究在課題組前期研究基礎(chǔ)上,利用流式細(xì)胞儀、熒光定量PCR和蛋白芯片技術(shù)探究抗菌肽HI-3對HCT-8細(xì)胞凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)影響,旨在揭示黑水虻抗菌肽HI-3對HCT-8細(xì)胞凋亡影響的可能機(jī)制,為結(jié)腸癌治療研究提供新的可選擇藥物及作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

抗菌肽HI-3由課題組通過誘導(dǎo)黑水虻幼蟲后提取,并利用RP-HPLC技術(shù)分離純化所得,分子量為5.98 kDa,純度大于95%;結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-8)標(biāo)準(zhǔn)株購于中國科學(xué)院上海ATCC細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1凋亡率檢測

將HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司,杭州)和1%氨芐青霉素和鏈霉素雙抗(Gibco,美國)的RPM1640(Gibco,美國)培養(yǎng)基中,培養(yǎng)環(huán)境濕度95%、溫度37℃、CO2為5%。培養(yǎng)24 h后將其分為4組,前3組分別加入100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的抗菌肽HI-3溶液,加樣量均為600 μL;第4組則加入等量常規(guī)培養(yǎng)基作為陰性對照組,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,吸出原培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞,胰蛋白酶(杭州基諾公司,杭州)消化細(xì)胞,179 g離心5 min,棄上清。再加入1 mL PBS重懸細(xì)胞,179 g繼續(xù)離心5 min,最后制成濃度為5～10×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,向各組分別加入5 μL AnnexinV-FITC和PI(日本同仁化學(xué)研究所,日本)混勻,于室溫避光反應(yīng)15 min,上流式細(xì)胞儀(Partec,德國)檢測。

1.2.2線粒體膜電位測定

細(xì)胞接種及加藥方式同1.2.1。干預(yù)48 h后,離心收集各濃度的HCT-8細(xì)胞,去上清,重懸各處理組細(xì)胞,向每管加入0.5 mL JC-1染色工作液(碧云天生物技術(shù)有限公司,上海),混勻后采用錫箔紙包裹避光,放回培養(yǎng)箱(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司,上海)孵育30 min,用預(yù)冷的1×染色緩沖液洗滌細(xì)胞3次,再利用200 μL 1×染色緩沖液重懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測膜電位。

1.2.3鈣離子濃度及ROS檢測

細(xì)胞接種及加藥方式同1.2.1。干預(yù)48 h后,離心收集各濃度組HCT-8細(xì)胞,去上清,每管細(xì)胞加入鈣離子濃度檢測熒光探針Fluo-3 AM工作液(碧云天生物技術(shù)有限公司,上海),具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。然后離心去除殘留的染液,并用完全培養(yǎng)基洗滌各處理組細(xì)胞3次,分別取200 μL PBS至每管細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液,上流式細(xì)胞儀檢測鈣離子濃度?；钚匝?Reactive oxyqen species,ROS)的檢測按試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,上海)進(jìn)行。

1.2.4凋亡蛋白酶Caspase活力檢測

HCT-8細(xì)胞接種及加藥方式同1.2.1。干預(yù)48 h后,吸出原培養(yǎng)液,PBS洗滌細(xì)胞。并加入裂解液于冰上裂解20 min,刮取細(xì)胞裂解產(chǎn)物至預(yù)冷的離心管中,4℃、18001 g離心15 min,收集上清液并根據(jù)BCA試劑盒(南京建成生物工程研究所,南京)說明書測定樣品蛋白濃度。取樣品與Caspase-3、Caspase-9試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,上海)中的工作液并按照試劑盒說明書混合(Caspase-3催化底物為Ac-DEVD-ρNA;Caspase-9催化底物為Ac-LEHD-ρNA),于37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜,采用酶標(biāo)儀(Thermo,美國)于波長405 nm處測定A值,根據(jù)ρNA標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算出各酶的活力。

1.2.5凋亡相關(guān)基因檢測

將處于對數(shù)生長期的HCT-8細(xì)胞培養(yǎng)24 h,實(shí)驗(yàn)組加入1 mL濃度為200 μg/mL的抗菌肽HI-3溶液,陰性對照組加入等量培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h,PBS洗滌細(xì)胞,利用RNA提取試劑盒(寶日生物技術(shù)有限公司,北京)提取細(xì)胞總RNA、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行RT-RCR(Agilent,美國)擴(kuò)增反應(yīng)。所有引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,具體如表1。

表1 引物序列

反應(yīng)體系:總體積25 μL。其中,2×SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL,上下游引物各0.5 μL, Rox Reference Dye II 0.5 μL,cDNA模板2 μL, ddH2O 9.0 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s、變性5 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增得Ct值,并采用2-△△Ct計(jì)算各的基因相對表達(dá)量。

1.2.6凋亡相關(guān)蛋白檢測

該實(shí)驗(yàn)委托廣州駟拓柏騰生物科技有限公司完成。

調(diào)節(jié)處于對數(shù)生長期的HCT-8細(xì)胞濃度為8×105個(gè)/mL,取2 mL細(xì)胞懸液接種至加有4 mL常規(guī)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(100 mm)中,培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陽性對照組及陰性對照組。其中實(shí)驗(yàn)組加入2.5 mL濃度為200 μg/mL的抗菌肽HI-3,陽性對照組加入25 μg/mL的5-FU(Sigma,德國),陰性對照組加入等量常規(guī)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取10 μL蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)加至990 μL 1×細(xì)胞裂解緩沖液混勻。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次,向每個(gè)培養(yǎng)皿加入200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液,收集細(xì)胞至新的EP管于冰上放置,每隔8 min旋轉(zhuǎn)30 s混勻,共計(jì)30 min。4℃ 18001 g離心10 min,取上清。取出玻片芯片,干燥后向每個(gè)芯片(廣州瑞博奧生物科技有限公司,廣州)孔加入100 μL 1×封閉液,平放于搖床孵育1 h,吸出封閉液,分別取100 μL樣品加至芯片各點(diǎn)樣孔,確保陣列和樣品相對應(yīng),4℃振蕩孵育過夜,芯片洗板機(jī)(Thermo,美國)清洗玻片5次,利用熒光劑-鏈霉親和素標(biāo)記P21、Caspase-3、P53、XIAP、Bax、Bcl-2、Fas、FasL抗體,利用MaPix Microarray Scanner(MoLecu Lar Devices,美國)熒光檢測信號進(jìn)行檢測,激發(fā)頻率為532 nm,分辨率為10 μm。在IncuCyte ZOOM Plate Map Editor(Essen BioScience,美國)上導(dǎo)出芯片結(jié)果,并用自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽HI-3對細(xì)胞凋亡率的影響

不同濃度(100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL)的抗菌肽HI-3均能誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡,并隨著抗菌肽HI-3處理濃度的增加,HCT-8細(xì)胞凋亡率也逐漸增加,與陰性對照組相比差異顯著(P<0.01);當(dāng)抗菌肽HI-3濃度為400 μg/mL時(shí),HCT-8細(xì)胞的凋亡率達(dá)22.32%±2.09%,與陰性對照(0 μg/mL) 1.15%±0.27%以及各濃度處理組間相比均差異顯著(P<0.05;圖1)。

圖1 不同濃度的抗菌肽HI-3對HCT-8細(xì)胞凋亡率的影響

2.2 抗菌肽HI-3對細(xì)胞膜電位的影響

不同濃度的抗菌肽HI-3作用后,HCT-8細(xì)胞線粒體膜電位的變化與陰性對照組相比(圖2-A),抗菌肽HI-3處理組HCT-8細(xì)胞中JC-1單體(Q4區(qū))增加,且具有濃度依賴性(圖2-B,C,D),即表明HCT-8細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位隨抗菌肽HI-3處理濃度的增加呈下降趨勢,其結(jié)果依次為:11.57%±1.04%、20.36%±0.35%、29.24%±1.05%,與陰性對照組4.48%±0.27%相比差異極其顯著(P<0.01),且各處理濃度間存在顯著差異(P<0.05;圖3)。

圖2 不同濃度的抗菌肽HI-3 對HCT-8細(xì)胞線粒體膜的影響

圖3 不同濃度的HI-3對HCT-8細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.3 抗菌肽HI-3對細(xì)胞鈣離子濃度的影響

HCT-8細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化顯示,各濃度抗菌肽HI-3處理組HCT-8細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平均熒光強(qiáng)度均較對照組高,且隨著處理濃度的增加,出現(xiàn)鈣離子峰右移,即熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖4)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,200 μg/mL及以上處理濃度下,HCT-8細(xì)胞內(nèi)鈣離子平均熒光值與對照組相比均具有顯著差異(P<0.01;圖5),說明抗菌肽HI-3能夠選擇性的影響HCT-8細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

圖4 抗菌肽HI-3處理后 HCT-8 細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度變化

圖5 抗菌肽HI-3對HCT-8細(xì)胞內(nèi)鈣離子平均熒光值的影響

2.4 抗菌肽HI-3對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

不同濃度抗菌肽HI-3對HCT-8細(xì)胞內(nèi)ROS的影響顯示(圖6-B),HCT-8細(xì)胞內(nèi)的ROS的熒光強(qiáng)度隨著抗菌肽HI-3處理濃度的增加而增強(qiáng),各處理組HCT-8細(xì)胞內(nèi)ROS的平均熒光強(qiáng)度分別為:865.06±22.91、1119.65±326.41、1350.38±338.19,與陰性對照組475.13±17.51 ROS水平相比較差異顯著(P<0.05;圖6-B),但各處理濃度間比較差異不顯著(P>0.05;圖7),表明黑水虻抗菌肽HI-3能促進(jìn)HCT-8細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放,但不具備濃度依賴性。

圖6 抗菌肽HI-3對HCT-8細(xì)胞ROS的影響

2.6 抗菌肽HI-3對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

200 μg/mL抗菌肽HI-3作用對HCT-8細(xì)胞凋亡分子的基因表達(dá)所示(圖8):P53、XIAP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2、Bax、P21、Fas和FasL的2-△△Ct分別是0.44、0.13、1.27、4.9、1.59、0.59,0.57、0.17、1.09、0.56。與陰性對照組相比較并通過-△△Ct值判斷基因下調(diào)情況,結(jié)果顯示,P53、XIAP、Bax、Bcl-2、P21、和FasL的基因表達(dá)下調(diào),而Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Fas的基因表達(dá)上調(diào)。

圖8 抗菌肽HI-3對HCT-8細(xì)胞凋亡因子基因表達(dá)的影響

2.7 抗菌肽HI-3對細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)的影響

200 μg/mL抗菌肽HI-3作用后,HCT-8細(xì)胞的蛋白芯片檢測結(jié)果表明,抗菌肽HI-3能影響HCT-8細(xì)胞凋亡因子相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖9;圖10),與陰性對照組相比抗菌肽HI-3能上調(diào)HCT-8細(xì)胞凋亡因子P21和Caspase-3的蛋白表達(dá)(圖9-B);下調(diào)因子Bax、Bcl-2、Fas、FasL、P53和XIAP的蛋白表達(dá)(圖10-B);但因子Caspase-8的蛋白表達(dá)在處理前后均無變化。

圖9 抗菌肽HI-3上調(diào)HCT-8細(xì)胞凋亡分子的蛋白表達(dá)

圖10 抗菌肽HI-3下調(diào)HCT-8細(xì)胞凋亡分子的蛋白表達(dá)

3 結(jié)論與討論

隨著人民生活水平的提高,結(jié)腸癌發(fā)病率在逐年上升,且大部分結(jié)腸癌患者確診時(shí)已發(fā)生局部轉(zhuǎn)移,目前單獨(dú)的手術(shù)治療已無法清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。既往研究認(rèn)為,人類惡性腫瘤不僅是細(xì)胞增殖失控的疾病,而且是細(xì)胞死亡異常的疾病(Snaketal., 2018),所以細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生發(fā)展息息關(guān)聯(lián)。Hickman(1992)首次提出以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作為腫瘤治療手段,如今已成為大部分腫瘤治療的主要方法。細(xì)胞凋亡受多條通路的調(diào)節(jié),包括內(nèi)源性線粒體細(xì)胞色素(Cytochrome, Cyt)-C釋放通路、外源性死亡受體轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)途徑,其中Caspase-9是內(nèi)源性線粒體途徑的執(zhí)行者,而 Caspase-8 是外源性凋亡途徑的執(zhí)行者。研究表明,羅非魚抗菌肽TP3通過誘導(dǎo)線粒體過度產(chǎn)生ROS,從而激活Caspase-3/9,進(jìn)而誘導(dǎo)人骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡(Yuanetal., 2020);抗菌肽PaDef依賴Caspase-8/9誘導(dǎo)急性淋巴白血病細(xì)胞凋亡,其凋亡也與ROS增加和線粒體膜電位喪失有關(guān)(Paolaetal., 2022)。本研究結(jié)果表明,隨著抗菌肽HI-3處理濃度的增加,HCT-8細(xì)胞凋亡率增加、線粒體膜電位下降、鈣離子及ROS含量增加,這與Vakifahmetoglu等(2017)研究結(jié)果相一致,即隨著線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放,導(dǎo)致線粒體膜電位下降,鈣離子內(nèi)流和ROS釋放。當(dāng)抗菌肽HI-3處理濃度為200 μg/mL時(shí),Caspase-9的酶活力最強(qiáng),且基因及蛋白表達(dá)均上調(diào);同時(shí),此濃度下凋亡執(zhí)行分子Caspase-3的酶活力、基因和蛋白表達(dá)一致。由于未檢測Cyt-c,所以無法確定是否通過Cyt-c依賴的線粒體凋亡途徑。但是結(jié)合細(xì)胞內(nèi)ROS的增加和XIAP的表達(dá)下調(diào),提示抗菌肽HI-3可能是通過線粒體-ROS途徑誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞凋亡,這與衍生肽B11引起線粒體功能障礙誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的報(bào)道相一致(Liuetal., 2018)。

另外,細(xì)胞漿內(nèi)高游離鈣可引起胞漿內(nèi)的磷脂酸和內(nèi)切核酸酶等活化,從而參與凋亡早期的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡的執(zhí)行階段,其中更重要的是在凋亡的早期階段。本研究HI-3處理后HCT-8細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增大,綜合下游分子Caspase-3的表達(dá),推測抗菌肽HI-3還可能通過鈣離子信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這與Chu等(2007)報(bào)道蜂毒素使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高,導(dǎo)致細(xì)胞裂解,從而引起人骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡的結(jié)果一致。此外,本研究中Fas、Caspase-8的基因表達(dá)上調(diào),FasL表達(dá)下調(diào),結(jié)果與Chen等(2014)研究α-螺旋短肽G(IIKK)3I-NH2誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡結(jié)果較一致。然而,蛋白芯片結(jié)果顯示Fas/FasL蛋白表達(dá)下調(diào),Caspase-8蛋白未表達(dá),因此,針對HI-3是否經(jīng)過Fas/FasL-Caspase-8死亡受體通路誘導(dǎo)凋亡,還需進(jìn)一步研究。綜上所述,黑水虻幼蟲抗菌肽HI-3可能通過線粒體和鈣離子信號途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞發(fā)生凋亡,在一定程度上為黑水虻抗菌肽用于抗癌治療方面奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但關(guān)于其具體的作用機(jī)制值得后續(xù)深入探究。