小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33與其相關信息化學物質的分子對接

付淑慧,張 鶴,趙婉清,梁志剛

(忻州師范學院生物系,山西忻州034000)

小菜蛾PlutellaxylostellaL.,屬鱗翅目Lepidoptera菜蛾科Plutellidae,是一種世界性的農業(yè)害蟲。該蟲專一性取食白菜、油菜、甘藍、蘿卜、芥菜、花椰菜等十字花科蔬菜,嚴重時可使蔬菜減產90%以上,甚至絕收(Furlongetal., 2013; Lietal., 2016a)。多年來,小菜蛾的防治以化學防治為主,大量化學農藥的使用導致小菜蛾發(fā)展為抗藥性最嚴重的害蟲之一。利用信息化學物質如寄主植物揮發(fā)物和性信息素監(jiān)測和誘捕害蟲,因其綠色高效而備受關注。目前,已明確寄主植物揮發(fā)物在小菜蛾的行為活動中發(fā)揮著重要的作用。如異硫氰酸酯類物質(Isothiocyanates,ITCs)是十字花科植物的特異性揮發(fā)物,可以顯著影響小菜蛾的電生理反應、行為活動和產卵選擇,是小菜蛾識別和定位十字花科植物的重要嗅覺信號(Renwicketal., 2006; Sunetal., 2009; Liuetal., 2020)。因此,基于信息化學物質探索和研究高效、無毒、無污染防治小菜蛾的新方法和新途徑具有重要的科學意義和應用前景。

氣味結合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是昆蟲識別外界氣味揮發(fā)物的第一步生化反應,在昆蟲定位寄主植物、尋找配偶、選擇合適產卵場所和躲避天敵等活動中發(fā)揮著重要的作用(Leal, 2013; Pelosietal., 2014; Rihanietal., 2021)。越來越多的研究表明,OBPs的沉默會導致昆蟲對信息化學物質的電生理反應和行為反應下降(Chenetal., 2021; Liuetal., 2021)。研究OBPs和氣味揮發(fā)物之間的關系,一方面可以闡明二者之間的結合機制,另一方面可以通過OBPs的結構特征設計調節(jié)昆蟲行為的活性揮發(fā)物。常用的研究方法為熒光競爭結合技術,通過原核表達、蛋白質純化以及結合試驗,從而明確蛋白質與氣味揮發(fā)物二者的結合能力(彭竹等, 2020; 郭莉等, 2021)。然而,該過程繁瑣,蛋白質存在變性的可能,且待測氣味物質數量眾多。

目前,從小菜蛾的基因組和轉錄組中鑒定到39個OBPs,這些基因的表達模式與性別、組織、發(fā)育階段、交配狀態(tài)和生存環(huán)境中有無寄主植物密切相關,其中,PxylOBP33在雌、雄蟲觸角中特異性表達,可能參與了小菜蛾識別信息化學物質的過程(Caietal., 2021)。為了探究PxylOBP33的功能,本研究擬對其進行同源建模,通過分子對接,模擬PxylOBP33與寄主植物揮發(fā)物、小菜蛾性信息素及其類似物的結合方式,初步解析PxylOBP33與信息化學物質的結合機制,以期明確PxylOBP33的潛在結合物質。

1 材料與方法

1.1 材料

序列來源:基于Caietal.(2021)文獻報道,獲得PxylOBP33氨基酸序列,NCBI中登錄號為KAG7302154.1。

供試信息化學物質:選取小菜蛾的4種性信息素及其5種結構類似物和45種十字花科植物揮發(fā)物,共54種揮發(fā)物,用于PxylOBP33分子對接。其中,十字花科植物揮發(fā)物包括36種一般性氣味揮發(fā)物和9種異硫氰酸酯類物質。

1.2 方法

1.2.1PxylOBP33的同源建模

使用SignalP 5.0(https://services.health tech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預測PxylOBP33的信號肽位置,以刪除信號肽的氨基酸序列為目標序列,在Swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org/)中搜尋同源建模的蛋白質模板。蛋白質模板綜合考慮全球模型質量估算值(global model quality estimation,GMQE)、定性模型能量分析值(qualitative model energy analysis,QMEAN)以及模板與PxylOBP33的氨基酸序列一致性大于30%等條件。使用Clustal X在線軟件(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)比較PxylOBP33和蛋白質模板氨基酸序列的一致性,并通過ESPript 3.0網站(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)對比對結果進行處理。蛋白質三維結構的顯示和分析使用PyMOL軟件。

1.2.2同源建模所得模型評價

為保證建模蛋白質的質量,使用SAVES 6.0軟件(https://saves.mbi.ucla.edu/)中的ProCheck、Verify-3D和ERRAT三種程序對已構建的PxylOBP33三維模型進行評價。ProCheck程序是通過分析蛋白質氨基酸殘基中二面角φ和ψ是否分布在合理范圍內來評價蛋白質結構的立體化學質量,評價結果以拉式構象圖(Ramachandran plot)呈現(xiàn)。拉氏構象圖分為4個區(qū)域:最佳合理區(qū)、較合適區(qū)、勉強接受區(qū)和不合理區(qū)。若90%以上的氨基酸位于最佳合理區(qū),則蛋白質模型可靠。Verify-3D程序通過確定蛋白質三維結構與一級結構之間的相溶性來評價結構與序列之間的匹配度,如果蛋白質三維結構與一級結構對應關系的得分大于0.2時,則認為該蛋白質模型合格。ERRAT程序能夠統(tǒng)計碳、氮、氧3種類型原子之間形成的非共價鍵數目,其誤差值在置信區(qū)間內的氨基酸數量占總氨基酸數量的比例為ERRAT值,若ERRAT值大于50%,即表示模型中非鍵合相互作用合理。

1.2.3分子對接

配體分子的準備:根據配體分子的CAS號或名稱從PubChem網站(https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/)下載其三維結構,利用Open-babel 3.0軟件將配體的SDF格式轉換為PDB格式后,通過AutoDock Tool 1.5.6軟件使配體分子具有原子電荷以及力場,并儲存為PDBQT格式。

蛋白質分子的準備:通過AutoDock Tool 1.5.6軟件對已構建的PxylOBP33蛋白質添加氫鍵,合并蛋白質分子中的非極性氫,識別受體各原子類型,同時賦予原子電荷以及力場,最后儲存為PDBQT格式文件。

分子對接:使用AutoDock Tool 1.5.6軟件進行半柔性對接,在grid模塊中設置受體與配體的結合搜尋空間Grid Box,坐標為x=-1.668,y=5.22,z=-11.518,網格參數為90點×90點×100點,格點間距為0.375 ?,每組輸出10個對接結果,包括自由結合能和模型構象等信息。自由結合能低于-5.0 kJ/mol且位點構象合理的物質,即為PxylOBP33的潛在結合物質,最后使用Discovery Studio 4.5軟件分析該物質與PxylOBP33的對接結果。

2 結果與分析

2.1 PxylOBP33同源建模結果

PxylOBP33編碼143個氨基酸,N端含有22個氨基酸長度的信號肽。去除PxylOBP33信號肽,通過Swiss-model搜索其同源蛋白質,結果顯示岡比亞按蚊AnophelesgambiaeAgamOBP20(ID:3V2L)與PxylOBP33的氨基酸覆蓋率為80%,同源性為35.29%,GMQE值為0.78,QMEAN值為-0.56,均符合同源建模的要求,故以AgamOBP20為模板構建小菜蛾PxylOBP33的三維結構。

PxylOBP33與AgamOBP20的氨基酸比對結果顯示(圖1),二者具有較好的一致性,均含有6個半胱氨酸殘基,形成3對二硫鍵,屬于典型的昆蟲OBPs。PxylOBP33與AgamOBP20的三維結構比對結果顯示(圖2-A,C),這兩種蛋白質的主要結構區(qū)域基本重合,均方根誤差(Root mean squared error,RMSD)值為0.079。PxylOBP33為球狀蛋白質(圖2-B),由6個α螺旋組成,分別為α1(Arg3-Asn21)、α2(Glu25-Lys33)、α3(Arg40-Met52)、α4(Tyr63-Met73)、α5(Pro76-Lys88)和α6(Leu99-Asp112),存在3對二硫鍵:Cys17-Cys48,Cys44-Cys100和Cys89-Cys109,分別連接α1和α3、α3和α6以及α5和α6。

圖1 小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33與蛋白質模板AgamOBP20的序列比對

圖2 小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33的三維模型

2.2 PxylOBP33三維結構模型的質量評價

通過ProCheck程序分析PxylOBP33三維模型的立體化學質量,拉式構象圖顯示(圖3)PxylOBP33中91.8%的氨基酸殘基落在最佳合理區(qū),8.2%的氨基酸殘基落在較合適區(qū),無氨基酸落在勉強接受區(qū)和不合理區(qū),符合拉式構象圖中氨基酸位于最佳合理區(qū)的數量大于90%的標準。因此,PxylOBP33三維模型的立體化學質量良好。

圖3 小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33模型的拉氏構象圖

通過Verify-3D程序評價PxylOBP33三維結構模型和一級結構之間的關系,構象中100%的氨基酸評分大于0.2(圖4),表明PxylOBP33三維模型的氨基酸殘基是合理的。

圖4 小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33模型的Verify-3D得分結果

通過ERRAT程序評價目標構象中不同原子之間非鍵相互作用的整體性能。PxylOBP33三維結構模型的ERRAT值為97.3214%(圖5),遠大于一般要求50%,表明建模蛋白質的非共價鍵相互作用整體上是合理的。綜合以上評價結果,PxylOBP33三維結構模型合理,可用于分子對接。

圖5 ERRAT計算的小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33模型殘基誤差值

2.3 分子對接

2.3.1PxylOBP33與一般性植物揮發(fā)物的對接結果

分子對接顯示PxylOBP33與36種一般性植物揮發(fā)物的自由結合能在-6.29～-3.56 kJ/mol之間(表1)。自由結合能數值越小代表蛋白質與配體的結合能力越強,本研究以自由結合能低于-5.0 kJ/mol且位點構象合理的物質為PxylOBP33潛在結合物質,因此共18種一般性揮發(fā)物與PxylOBP33有結合能力,包括2種醛(苯甲醛和苯乙醛)、2種酮(苯乙酮和甲基庚烯酮)、5種酯(順-3-己烯異戊酸酯、乙酸苯甲酯、水楊酸甲酯、順-3-丙酸己烯酯和順-3-己烯醇乙酸酯)和9種萜烯類物質(D-檸檬烯、α-松油烯、羅勒烯、桉樹腦、里那醇、莰烯、α-蒎烯、月桂烯和香葉醇)。其中,D-檸檬烯與PxylOBP33結合能力最強,自由結合能為-6.29 kJ/mol。D-檸檬烯為環(huán)狀小分子物質,與PxylOBP33結合時,位于PxylOBP33的結合腔內,二者主要通過疏水作用和范德華力結合(圖6)。D-檸檬烯與PxylOBP33的氨基酸Pro81(4.38 ?)、Ala85(3.58 ?)、Met110(4.62 ?)、Phe120(5.20 ?)和Phe118(4.33、5.16、5.45 ?)形成疏水作用力,與氨基酸Tyr50、Thr82、Val113、Asp114、Asn117和Val119形成范德華力。除疏水作用和范德華力兩種分子間作用力外,PxylOBP33與12種配體可以形成氫鍵,維持蛋白質-配體之間的穩(wěn)定。如PxylOBP33的Thr82、Val119與順-3-己烯異戊酸酯,Tyr50、Phe118與乙酸苯甲酯,Val119與苯乙酮,Val119與里那醇,Tyr50、Val119與水楊酸甲酯之間存在氫鍵,其中Tyr50和Val119是PxylOBP33與這些配體物質形成氫鍵的重要氨基酸。

表1 小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33與一般性揮發(fā)物的分子對接

圖6 小菜蛾PxylOBP33與D-檸檬烯的分子對接圖

2.3.2PxylOBP33與十字花科植物特異性揮發(fā)物的對接結果

通過分子對接檢測了PxylOBP33與十字花科植物特異性揮發(fā)物——異硫氰酸酯類物質的結合能力。在9種異硫氰酸酯類物質中,PxylOBP33與4種物質具有結合能力,分別為異硫氰酸苯乙酯(-6.27 kJ/mol)、異硫氰酸苯酯(-6.15 kJ/mol)、對甲氧異硫氰酸苯酯(-5.81 kJ/mol)和異硫氰酸芐酯(-5.67 kJ/mol)(表2)。這4種物質主要通過疏水作用、范德華力以及π-硫靜電作用與PxylOBP33結合。其中,異硫氰酸苯乙酯與PxylOBP33的結合能力最強,二者通過氫鍵、疏水作用、范德華力以及π-硫靜電作用這些分子間作用力結合(圖7)。PxylOBP33的氨基酸Val119與異硫氰酸苯乙酯形成氫鍵,鍵長2.95 ?,氨基酸Pro81(4.46?)、Ala85(4.67?)、Met110(5.12?)與異硫氰酸苯乙酯存在疏水作用,Val13、Asp14、Tyr50、Phe74、Thr82、Asn117、Phe118、Pro121是范德華力的位點,Phe120(4.73 ?)是π-硫靜電作用的關鍵位點。由于異硫氰酸酯類物質是一類含硫的化學物質,π-硫靜電作用可能是PxylOBP33與該類物質結合區(qū)別于其他物質的分子間作用力。

表2 小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33與十字花科特異性揮發(fā)物的分子對接

圖7 小菜蛾PxylOBP33與異硫氰酸苯乙酯的分子對接圖

2.3.3PxylOBP33與性信息素成分及其類似物的對接結果

小菜蛾PxylOBP33與4種性信息素成分及其5種類似物的自由結合能在-6.96～-5.69 kJ/mol之間(表3),均有較強的結合能力。小菜蛾主要性信息素成分之一的順-11-十六碳烯乙酸酯(Z11-16∶Ac)與PxylOBP33的結合能力最強,自由結合能為-6.96 kJ/mol。Z11-16∶Ac與PxylOBP33結合時,位于PxylOBP33的結合空腔內,主要通過疏水作用和范德華力結合,疏水作用的氨基酸位點為Leu6(4.48 ?)、Pro121(4.42 ?),范德華力的作用位點為Gly10、Met13、Tyr50、Ser52、Leu55、Val70、Met73、Phe74、Pro81、Thr82、Ala85、Met110、Val113、Asp114、Asn117、Phe118、Val119、Phe120(圖8)。另一小菜蛾主要性信息素順-11-十六碳烯醛(Z11-16∶Ald)與PxylOBP33的自由結合能為-6.04 kJ/mol,通過疏水作用和范德華力結合。其余性信息素及其類似物除具有疏水作用和范德華力外,還通過氫鍵與PxylOBP33結合。

表3 小菜蛾氣味結合蛋白PxylOBP33與性信息素及其類似物的分子對接

圖8 小菜蛾PxylOBP33與順-11-十六碳烯乙酸酯的分子對接圖

3 結論與討論

昆蟲依賴靈敏的嗅覺系統(tǒng)識別外界的信息化學物質,進而覓食、求偶、交配、繁殖和避險等。在識別氣味分子的過程中,OBPs作為嗅覺反應的第一步,首先與氣味物質進行識別、結合和轉運。在成蟲觸角中表達的OBPs能夠結合各類信息化學物質。本研究選取了在觸角中高表達的小菜蛾PxylOBP33,通過同源建模和分子對接,明確其結合物質和結合能力,從而獲得了該蛋白質的潛在結合物質。

由于小菜蛾是十字花科蔬菜的專食性害蟲,因此本研究選取小菜蛾嗜食寄主植物白菜、甘藍、油菜、蘿卜的氣味揮發(fā)物與PxylOBP33進行分子對接。結果發(fā)現(xiàn),PxylOBP33能與22種寄主植物揮發(fā)物結合,包括2種醛、2種酮、9種酯和9種萜烯類物質(表1和表2)。這與OBPs可以結合多種具有不同化學基團的氣味物質的結果相吻合(李廣偉等, 2017; Yuetal., 2018; 孫小潔等, 2020)?；瘜W物質本身的性質會影響OBPs的結合能力。在一定范圍內,氣味揮發(fā)物碳原子數目的增加會導致OBPs與配體分子的結合能力減弱(Jiangetal., 2009; Dengetal., 2012),也有研究認為蛋白質結合能力的強弱與配體碳原子的數目無顯著關系(Lietal., 2016b)。本試驗中,PxylOBP33結合的化學物質,除異硫氰酸苯酯(C7)和苯甲醛(C7)含有7個碳原子外,其余物質碳原子數目在8個以上。雖然PxylOBP33的結合能力并不隨著配體碳原子數目的增加而增加,但該蛋白質與碳原子數目多的配體結合能力強,這可能與碳原子數目多的配體形成作用方式的構象所占空間大有關。此外,有研究顯示配體的形狀也會影響OBPs的結合能力。云斑天牛BatocerahorsfieldiBhorOBPm2與鏈狀配體的結合能力強于環(huán)狀配體(Zhengetal., 2016),而有的研究認為OBPs對環(huán)狀配體的結合能力強于鏈狀配體(郭莉等, 2021)。小菜蛾PxylOBP33能與17種鏈狀配體結合,同時,與14種環(huán)狀配體有較強的結合能力,該蛋白質結合能力不受配體形狀的影響。

OBPs與配體物質有效結合依賴蛋白質的氨基酸和配體形成的相互作用力。PxylOBP33與配體之間通過疏水作用、范德華力和氫鍵等結合,符合OBPs這種轉運蛋白的特性,即通過蛋白質構象的改變,結合和釋放配體分子,所以多以非共價相互作用力與配體分子結合,便于后續(xù)配體分子的釋放。異色瓢蟲Harmoniaaxyridis4種OBPs(Quetal., 2022)、花椒窄吉丁AgriluszanthoxylumiAzanOBP3(郭莉等, 2021)、花絨寄甲DastarcushelophoroidesDhelOBP21(Lietal., 2015)等與配體的結合也存在氫鍵、疏水作用和范德華力。然而,PxylOBP33與異硫氰酸酯類物質除上述三種作用力外,還存在π-硫鍵,該鍵本質上是一種靜電作用力,這可能是這類物質與PxylOBP33結合的特殊方式,可在設計引誘劑或趨避劑時,考慮該作用方式。

本研究中,與PxylOBP33具有結合潛力的物質都是十字花科植物的主要成分,均能引起小菜蛾觸角電生理反應或/和行為反應(Reddy and Guerrero, 2000; 韓寶瑜等, 2001)。順-3-己烯醇乙酸酯、苯甲醛和苯乙醛是甘藍、白菜和青菜3種十字花科蔬菜共有的揮發(fā)物(戴建青等, 2011),順-3-己烯醇乙酸酯和苯甲醛能引起小菜蛾趨向行為反應(田厚軍等, 2018),且順-3-己烯醇乙酸酯對小菜蛾具有很強的引誘活性(王香萍等, 2005)。苯乙醛是開花植物釋放的一種芳香型化合物,是許多鱗翅目昆蟲的優(yōu)質食物指示劑(Knauer and Schiestl, 2015; Guoetal., 2021)。而小菜蛾對α-松油烯、D-檸檬烯和里那醇在行為上有拒避以及產卵忌避反應(Zhangetal., 2004)。異硫氰酸酯類物質是十字花科植物的特異性揮發(fā)物,是小菜蛾尋找寄主植物和定位產卵場所的重要化學信號。本研究中,PxylOBP33與異硫氰酸苯乙酯、異硫氰酸苯酯、對甲氧異硫氰酸苯酯和異硫氰酸芐酯有較好的結合能力。已有研究表明,這4種物質都能刺激小菜蛾產卵,其中異硫氰酸苯乙酯對小菜蛾的觸角電位反應最強烈,能顯著刺激小菜蛾雌蟲產卵(Liuetal., 2020)。PxylOBP33與上述多種寄主植物揮發(fā)物的結合潛力暗示其在小菜蛾寄主定位中發(fā)揮著作用。

OBPs除能與寄主植物揮發(fā)物結合外,還能有效地結合性信息素。本研究發(fā)現(xiàn)PxylOBP33具有與小菜蛾性信息素及其類似物等9種物質結合的潛力,其中與小菜蛾主要性信息素成分之一的Z11-16∶Ac結合能力最強,推測PxylOBP33可能參與小菜蛾雄蟲感知性信息的過程。前期研究表明,小菜蛾PxylOBP33在未交配雄蟲觸角表達量最高(Caietal., 2021),這也進一步解釋和說明了PxylOBP33可能在小菜蛾尋找配偶的過程中發(fā)揮重要作用。已有報道,小菜蛾性信息素結合蛋白PxylPBP1-3對小菜蛾性信息素及其類似物有很強的結合能力(Sunetal., 2013),PxylOBP33與PxylPBP1-3分布于進化樹的一個分枝中,但進化關系較遠(Caietal., 2021),這可能與小菜蛾在長期進化中OBPs向不同方向進化有關。鱗翅目其它昆蟲的OBPs,如梨小食心蟲GrapholitamolestaGmolOBP7、桃蛀螟ConogethespunctiferalisCpunOBP4、茶尺蠖EctropisobliquaEoblOBP9和EoblOBP11既能與植物揮發(fā)物結合,又可以與性信息素結合(Chenetal., 2018; 郭洪剛等, 2021; 嚴玉婷等, 2021),說明在進化過程中一種OBP不只負責一種信息化學物質的識別,同一昆蟲中各OBPs協(xié)同互作,通過與寄主植物揮發(fā)物和昆蟲性信息素等物質特異性識別,共同調節(jié)昆蟲定位寄主和尋找配偶等行為(Britoetal., 2016)。

分子對接可以直觀地明確OBPs與配體之間的結合方式,從大量的配體物質中篩選出OBPs的配體;熒光競爭結合試驗也是一種常見的研究OBPs功能的方法,可以精準地判斷OBPs與化學物質的結合能力(郭冰等, 2019)。熒光競爭結合試驗可以彌補分子對接因軟件評測帶來的誤差,而分子對接可以彌補熒光競爭結合試驗中蛋白表達和純化周期長的缺點,兩種方法相輔相成。本研究中,通過分子對接發(fā)現(xiàn)PxylOBP33可與31種寄主植物揮發(fā)物和性信息素等物質結合,可能參與了小菜蛾定位寄主和尋找配偶等行為,為研究小菜蛾OBPs功能奠定了基礎。今后將繼續(xù)對篩選的物質進行熒光競爭結合試驗,以進一步確定不同信息化學物質與PxylOBP33之間的結合能力,為新型綠色高效引誘劑的配制提供參考依據。