我國入侵害蟲西部喙緣蝽的溯源分析

黃志成,劉騰騰

(山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,昆蟲系統(tǒng)分類學(xué)和進(jìn)化生態(tài)學(xué)實驗室,濟(jì)南 250358)

溯源分析在入侵害蟲研究中扮演著重要的角色。通過對入侵害蟲種群的來源、傳播途徑和時間等方面進(jìn)行分析,可以更好地理解入侵害蟲的來源和傳播途徑,并為制定更有效的防控策略提供參考?，F(xiàn)代溯源分析方法主要有DNA條形碼技術(shù)(Hebertetal., 2003)、SNP分型技術(shù)(Luikartetal., 2003)、微衛(wèi)星分析技術(shù)(Selkoe and Toonen, 2006)等。DNA條形碼技術(shù)是一種基于特定的遺傳標(biāo)記鑒定生物種類的方法,這種技術(shù)可以通過擴(kuò)增和測序特定基因區(qū)域來確定樣本的物種身份,并與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較以確定其來源。在入侵害蟲的溯源分析中,DNA條形碼技術(shù)可以用于識別潛在的新物種或已知的害蟲種類,以確定害蟲來源,同時可以確定不同地區(qū)的害蟲種群之間的遺傳差異(Meusnieretal., 2008)。近年來,DNA參考條形碼數(shù)據(jù)庫正在不斷豐富完善。微衛(wèi)星分析技術(shù)是一種基于微衛(wèi)星序列多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù),適用于做入侵物種的起源和擴(kuò)散的研究,但需要多次PCR擴(kuò)增和電泳分離、測序等步驟(Estoupetal., 2002)。SNP分型技術(shù)是利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)的分布在基因組中的不同位置來區(qū)分不同個體的方法,可用于追蹤和鑒定生物入侵的源頭和擴(kuò)散,但生成的數(shù)據(jù)量較小(Luikartetal., 2003)。后面兩種方法都受限于參考數(shù)據(jù)庫不完善,不便于大尺度協(xié)作分析。在溯源分析中可以結(jié)合多種技術(shù)手段,以獲取更加準(zhǔn)確、全面的信息。

西部喙緣蝽LeptoglossusoccidentalisHeidemann, 1910屬于緣蝽科Coreidae喙緣蝽屬LeptoglossusGuerin Méneville, 1831,原產(chǎn)于北美洲西部,是針葉樹的主要種實害蟲。西部喙緣蝽的寄主植物主要屬于松科Pinaceae,在歐洲主要危害石松Pinuspinea(Feduccietal., 2009)、海岸松P.pinaster(Sousa and Naves, 2011)、歐洲赤松P.sylvestris(Lesieuretal., 2014)、地中海松P.halepensis(Kment and Baňarˇ, 2008)、歐洲黑松P.nigra(Tescari, 2004)等。在北美洲主要危害歐洲赤松P.sylvestris(Schaffner, 1967)、紅松P.resinosa(Katovich and Kulman, 1987)、花旗松Pseudotsugamenziesii(Schowalter and Sexton, 1990)等。在韓國主要危害赤松Pinusdensiflora、北美喬松P.strobus、黑松P.thunbergii和側(cè)柏Platycladusorientalis(Kimetal., 2020),韓國還報道以冬青衛(wèi)矛Euonymusjaponics為食(Kimetal., 2020)。

西部喙緣蝽1～5齡若蟲的平均體長分別為3.07、4.76、8.77、13.56和15.53 mm(Leeetal., 2023)。成蟲和若蟲都以松科植物未成熟和成熟的種子為食,也以枝梢汁液為食,以雌成蟲的危害最大,可以使發(fā)育早期的種子和球果敗育,成熟種子的營養(yǎng)儲備降低,進(jìn)而可能導(dǎo)致種子發(fā)芽不良、苗木活力降低(Koerber, 1963; Blatt, 1997),在北美洲和歐洲,西部喙緣蝽對松子的破壞可達(dá)70%～95%(Kimetal., 2020)。西部喙緣蝽還可攜帶病原真菌Sphaeropsissapinea(Fr.) [=Diplodiapinea(Desm.)]的孢子,導(dǎo)致松樹針葉和莖皮壞死,幼苗枯萎(Musolinetal., 2022)。

西部喙緣蝽在原產(chǎn)地美國加利福尼亞州1年1代,在墨西哥每年最多可以發(fā)育3代(Aukema, 2007)。在韓國西部喙緣蝽1年1代,成蟲在5月中下旬出蟄,交配后在寄主針葉上產(chǎn)一排約5～15枚卵,10～15 d后若蟲孵化;到6月中下旬,1齡若蟲附著并吸食針葉;2齡若蟲轉(zhuǎn)移至球果上以種子為食,成蟲活躍到10月中旬左右,從10月下旬開始越冬(Kimetal., 2020)。受聚集信息素的影響,西部喙緣蝽常在松散的樹皮下越冬(Dennys, 1927),也可以在建筑物內(nèi)集群越冬(Spencer, 1942; Schaffner, 1967)。Kitajimaetal.(2022)發(fā)現(xiàn)早春時節(jié)西部喙緣蝽傾向于吸食針葉樹的雄球花,以獲取更多的熱量。

西部喙緣蝽的自然分布范圍覆蓋北美西部,廣泛分布在不列顛哥倫比亞省(British Columbia)到墨西哥、太平洋海岸到科羅拉多州(Colorado)的地區(qū)(Koerber, 1963)。自二十世紀(jì)下半葉以來,西部喙緣蝽從北美西海岸向東擴(kuò)展(Hoebeke and Wheeler, 1982;McPherson, 1990),并在2008年到達(dá)北美東部的新斯科舍省(Nova Scotia)(Scudder, 2008)。20世紀(jì)90年代末,西部喙緣蝽被引入意大利北部(Tescarietal., 2001),在隨后的10年里,歐洲多國陸續(xù)報道了此種害蟲。西部喙緣蝽在亞洲也在逐漸擴(kuò)散,已經(jīng)入侵到中亞(Barclay and Nikolaeva, 2018)和東亞地區(qū),日本(Ishikawa and Kikuhara, 2009)和韓國(Ahn, 2013)都有分布報告。Zhu(2010)報道我國首次在天津口岸截獲西部喙緣蝽,此后我國海關(guān)多次發(fā)現(xiàn)并截獲該蟲(徐梅, 2014),但并未確認(rèn)該蟲已在我國定殖。馬如玉等(2023)在威海和青島的黑松上發(fā)現(xiàn)西部喙緣蝽,為我國境內(nèi)首次報道。除原產(chǎn)地外,西部喙緣蝽現(xiàn)在已經(jīng)廣布于歐洲(Farinhaetal., 2021)、亞洲、北非(Benetal., 2013; Gapon, 2015)、南非(Heyden and Faúndez, 2020)和南美洲(Faúndez and Rocca, 2017; Kun and Masciocchi, 2019; Heyden and Faúndez, 2020)。各國首次記錄時間見表1。

表1 西部喙緣蝽入侵的國家和首次報道文獻(xiàn)

最近,山東煙臺多地發(fā)現(xiàn)西部喙緣蝽的成蟲和若蟲,表明該種已經(jīng)在國內(nèi)定殖。目前國內(nèi)對西部喙緣蝽的入侵來源、生物學(xué)特性等缺乏了解,這一狀況不利入侵檢疫、種群監(jiān)測以及防治工作的開展。本研究以野外采集的西部喙緣蝽標(biāo)本為研究材料,以COI基因為標(biāo)記基因,利用系統(tǒng)發(fā)育和單倍型對其入侵來源進(jìn)行了分析討論,為更好地制定規(guī)制措施,開展防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

本研究所用3頭西部喙緣蝽成蟲(2♀,1♂)、1頭3齡若蟲(♂)標(biāo)本于2022年采集于煙臺市沿海防護(hù)林和煙臺市牟平區(qū)昆崳鎮(zhèn)單耳山村。采集后浸泡于無水乙醇中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 形態(tài)觀察

使用佳能Canon 80D單反相機(jī)、100 mm微距鏡頭在野外拍攝生態(tài)照片,制作成干制標(biāo)本后使用萊卡Leica S9E體視顯微鏡觀察研究形態(tài)特征。綜合山東若蟲標(biāo)本和韓國種群的若蟲資料(Leeetal., 2023),對各齡若蟲做了描述。

1.3 總DNA提取

采用北京諾貝萊生物科技有限公司生產(chǎn)的快速DNA提取試劑盒,提取純化昆蟲組織的DNA,參照試劑盒的說明書進(jìn)行操作,使用Buffer SL和蛋白酶K溶液對取下的腹部和前足組織進(jìn)行56℃裂解,然后使用Buffer VL孵育并混合無水乙醇將樣品過柱處理,經(jīng)過WB1和WB2漂洗離心進(jìn)一步純化后,使用Buffer EB將樣品上柱,然后通過12 000 rpm的離心操作將其洗脫得到純化后的DNA模板,保存在-20℃的低溫環(huán)境中備用。

1.4 COI基因擴(kuò)增、序列測定和分子鑒定

使用通用引物L(fēng)CO1490/HCO2198進(jìn)行DNA擴(kuò)增(Folmeretal., 1994),反應(yīng)擴(kuò)增體系為25.0 μL,其中2×UrTaq Master Mix 12.5 μL,10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL、模板DNA 2.0 μL,dd H2O 8.5 μL,反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2 min,95℃ 20s,53℃ 20 s,72℃ 1 min,35個循環(huán);72℃延伸2 min,COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為685 bp。產(chǎn)物4℃保存,1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測確證后,送擎科生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫、BOLD數(shù)據(jù)庫(Ratnasingham and Hebert, 2007)中進(jìn)行比對,鑒定煙臺標(biāo)本所屬物種,并與青島西部喙緣蝽序列做同種驗證。

1.5 序列和單倍型分析

測序結(jié)果保存在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中,登錄號為OQ457541～OQ457544,下載GenBank數(shù)據(jù)庫中西部喙緣蝽COI基因的所有公共序列,通過MEGA 11軟件(Tamuraetal., 2021)中的MUSCLE功能進(jìn)行對齊,去除前后冗余堿基,得到566 bp數(shù)據(jù)集,使用Sequence Data Explorer功能分析堿基突變位點。

使用軟件DNAsp V6(Rozasetal., 2017)計算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity, Pi)和單倍型多樣性(Haplotype diversity, Hd)。在MEGA 11(Tamuraetal., 2021)中以喙緣蝽屬的Leptoglossusclypealis(登錄號KY818713)為外群,采用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,使用ChiPlot(https://www.chiplot.online)作圖。使用NETWORK 10.2.0.0軟件(Bandeltetal., 1999)繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征和危害

成蟲體長約17～20 mm,寬約5～7 mm(測量3頭成蟲標(biāo)本)(圖1)。體紅褐色,長橢圓形,密被半直立剛毛。頭長約3 mm,向前延伸,兩眼遠(yuǎn)離前胸背板前緣,單眼紅色;頭頂黑色,中間有 1道紅色條紋;喙較長,至第4腹節(jié);觸角第1節(jié)、第4節(jié)黑色。前胸背板肩角鈍圓,前胸背板前緣有兩塊對稱分布的白色斑塊,上面有數(shù)個黑色斑點;小盾片整體深褐色,與前胸背板相接處黑色;前翅革質(zhì)部與膜質(zhì)相交處的翅脈為對稱橫向分布的白色的“h”形結(jié)構(gòu)(圖2);膜片深褐色。前兩對足腿節(jié)內(nèi)側(cè)有鋸齒,每排2～4個,后足腿節(jié)外側(cè)黑色,內(nèi)側(cè)有兩排鋸齒,每排6～8個;后足脛節(jié)擴(kuò)張成兩側(cè)幾乎對稱的葉狀,擴(kuò)張部分有白色斑點對稱分布,除靠近關(guān)節(jié)處外整體為黑色。頭、胸部腹面均勻分布黑色斑點,腹部的黑色斑點密集分布在腹中線兩側(cè),數(shù)量向后逐漸遞減。

圖1 西部喙緣蝽成蟲形態(tài)

圖2 西部喙緣蝽關(guān)鍵識別特征

若蟲全身紅褐色,其中5齡若蟲體色較灰暗。1齡、2齡若蟲的腹部較窄,與胸部等寬,從3齡若蟲開始腹部寬度大于胸部;3齡若蟲各腹節(jié)分界明顯,4齡若蟲腹部較3齡若蟲飽滿,顏色鮮艷;若蟲第4～6腹節(jié)之間有顯著的黑色臭腺孔,成蟲消失。西部喙緣蝽在山東主要危害黑松和赤松,7月至8月中旬可見成蟲和若蟲在松樹的嫩梢和1年生球果上吸食為害(圖3),導(dǎo)致嫩梢枯萎發(fā)黃、長勢減弱,球果發(fā)黃、變形、開裂。

圖3 西部喙緣蝽在赤松球果上

2.2 分子鑒定

采集的4頭標(biāo)本的COI基因經(jīng)DNAsp V6軟件處理后確定屬于同一單倍型,在NCBI數(shù)據(jù)庫和BOLD數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果顯示,這些標(biāo)本的COI基因序列與西部喙緣蝽高度相似(NCBI:99.64%～100%,BOLD:99.23%～100%),證實屬于同一物種。

2.3 單倍型分析

通過單倍型分析發(fā)現(xiàn),全球存在10種不同的單倍型,可大致分為5個地理種群(北美西部、北美東部、歐洲、韓國、中國山東)(表2,圖4)。山東煙臺的序列OQ457541～OQ457544無新的突變位點,與單倍型H_2一致;山東青島的OM883865屬于H_8,OM883918和OM883922分別為新發(fā)現(xiàn)的單倍型H_9和H_10(表2),H_9與H_8之間只有1個突變位點,H_10和H_4之間有2個突變位點(表3)。

圖4 西部喙緣蝽COI基因不同單倍型的世界分布

表2 西部喙緣蝽COI基因不同單倍型序列的GenBank登錄號和地理分布

在13個位點檢測到堿基變異,其中以C/T顛換和A/G顛換為主(表3),這些變異大多屬于同義突變,這種變異可能使得基因更穩(wěn)定(朱彥彬等, 2012)。所有單倍型均有明顯的A+T偏向性,A+T的平均含量為63.7%,G+C的平均含量為36.2%,此為昆蟲線粒體基因序列組成的一種共有特性(Nei and Kumar, 2000)。

H_3、H_5和H_6的采集地都位于加拿大不列顛哥倫比亞省(British Columbia),屬于北美西部喙緣蝽原生分布范圍(表2,圖4)。結(jié)合西部喙緣蝽的傳播過程,可以推測H_3、H_5和H_6屬于起源于北美西部原生地的初始單倍型。在煙臺種群發(fā)現(xiàn)之前,H_2分布于北美(加拿大、美國)、歐洲(德國、匈牙利)和韓國(表2,圖4),煙臺種群可能是從以上地區(qū)傳播而來。H_2在北美的采集地為安大略省(Ontario);H_4已入侵至韓國,在北美的采集地位于新斯科舍省(Nova Scotia)、安大略省(Ontario)和緬因州(Maine)(表2,圖4),以上表明H_2和H_4的傳播源頭都在北美東部。

H_1的采集地新斯科舍省(Nova Scotia)雖處于北美東部(表2,圖4),但經(jīng)過與初始單倍型(H_3,H_5,H_6)比對后發(fā)現(xiàn),突變位點有3～5個(表3),親緣關(guān)系較遠(yuǎn),猜測北美西部還有初始單倍型尚未被發(fā)現(xiàn)。

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖能夠更加清晰地展示不同單倍型之間的遺傳距離及其分布情況。在單倍型網(wǎng)絡(luò)中,H_3、H_6～H_10與H_4聯(lián)系密切;H_2已入侵至全球多個地區(qū),表明H_2和H_4在西部喙緣蝽的入侵過程中發(fā)揮了較大的作用;H_1可能還存在1個初始單倍型(mv1)。除山東煙臺外,在其它入侵地(北美東部、歐洲、韓國、中國青島)均有新的單倍型產(chǎn)生(圖5),表明西部喙緣蝽可能會通過基因突變以適應(yīng)新的生境。

圖5 西部喙緣蝽COI基因單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)能夠衡量一個群體線粒體DNA(mtDNA)變異程度,Hd和Pi值越大,群體的遺傳多樣性則越高(Smithetal., 2006)。中國種群的核苷酸多樣性Pi為0.00423,在所有地區(qū)中最高;單倍型多樣性Hd為0.714,在各地區(qū)中處于較高水平(表4)。這表明西部喙緣蝽中國種群具有較高的遺傳多樣性,其傳播來源可能涵蓋數(shù)個地區(qū)。

表4 西部喙緣蝽不同地理種群COI基因單倍型多樣性、核苷酸多樣性分析

2.4 遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育分析

在系統(tǒng)發(fā)育樹中,H_2與H_5共同組成一個進(jìn)化分支,它們之間的遺傳距離為0.18%,這表明它們的親緣關(guān)系比較接近。H_4與H_3、H_6在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同一個進(jìn)化分支,它們之間的遺傳距離同為0.18%(圖6),表明H_3,H_6和H_4之間的親緣關(guān)系非常接近。

圖6 使用ML法對西部喙緣蝽COI基因不同單倍型序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

H_8現(xiàn)分布于青島和韓國。H_9與H_8構(gòu)成了系統(tǒng)發(fā)育樹中的一個分支,遺傳距離為0.18%,親緣關(guān)系非常接近。H_10與H_4的遺傳距離最近,為0.36%(圖6)。以上結(jié)果表明,青島種群與韓國種群具有較高的遺傳相似性。

山東煙臺兩個采集點的單倍型均為H_2(登錄號OQ457541～OQ457544),和青島的單倍型H_8(登錄號OM883865)、H_9(登錄號OM883918)和H_10(登錄號OM883922)之間的遺傳距離較遠(yuǎn)為0.54%～0.72%,在系統(tǒng)發(fā)育樹中分別處于不同的進(jìn)化分支(圖6),表明兩地的西部喙緣蝽可能來自不同的地區(qū)。以上分析表明,我國西部喙緣蝽種群可能來源于多次獨立入侵事件,同時在國內(nèi)發(fā)生了小范圍的擴(kuò)散遷移。

3 結(jié)論與討論

通過本次分析,發(fā)現(xiàn)西部喙緣蝽在新入侵地(包括北美東部、歐洲、韓國和中國)的COI基因會進(jìn)化出新的單倍型。這些單倍型主要是由同義突變引起的,這些突變有助于使基因更加穩(wěn)定,以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境。西部喙緣蝽在2010年前后入侵東亞地區(qū),我國于2010年在天津海關(guān)首次截獲西部喙緣蝽,推測西部喙緣蝽入侵膠東半島最長時間不超過12年,入侵時間較短,且采樣范圍較小,僅限于昆崳山周邊地區(qū),這可能是致使采集自煙臺的樣本中并未發(fā)現(xiàn)任何突變位點的原因。此外,西部喙緣蝽擁有較強(qiáng)的飛行能力(Farinhaetal., 2023),能夠依靠寄主植物在入侵區(qū)域內(nèi)傳播(Lesieuretal., 2019),個體之間可以頻繁進(jìn)行基因交流,這也可能是導(dǎo)致未能發(fā)現(xiàn)新單倍型的原因之一。

北美地區(qū)擁有豐富的森林資源,是世界上主要的木材出口地區(qū)之一,其原木和鋸材的出口量居于世界前列(劉瑩, 2015)。結(jié)合以上分析,可以看出北美東部在西部喙緣蝽在向世界其他地區(qū)擴(kuò)散的過程中扮演了“橋頭堡”的角色(Lesieuretal., 2019)。

山東作為全國木材進(jìn)口大省,其進(jìn)口來源涵蓋5大洲的80多個國家和地區(qū),在2011-2016年期間,山東口岸截獲的有害生物來源國主要為新西蘭、烏克蘭、羅馬尼亞、俄羅斯和美國,其中從美國和俄羅斯進(jìn)口的木材中截獲的有害生物種類隨著檢疫力度的加強(qiáng)逐年增加(王凱等, 2017)。綜合單倍型分析結(jié)果和山東口岸截獲情況,推測煙臺種群的入侵源頭為北美東部地區(qū)。

Zhuetal.(2014)對西部喙緣蝽在全世界的潛在分布區(qū)進(jìn)行預(yù)測,研究顯示東亞地區(qū)高度適宜西部喙緣蝽生存,西部喙緣蝽的分布受其針葉植物寄主分布區(qū)和氣候的限制。趙力等(2015)曾對西部喙緣蝽和紅肩美姬緣蝽Jaderahaematoloma(Herrich-Sch?ffer, 1847)在中國的潛在分布區(qū)進(jìn)行模擬,該研究顯示基于美國西部種群構(gòu)建的模型,膠東半島對西部喙緣蝽的適生性較高,這一預(yù)測已被本研究證實。煙臺市和青島市地處膠東半島,瀕臨黃海、渤海,與韓國、美國、日本和歐盟貿(mào)易往來頻繁,且膠東半島分布有大面積的黑松、赤松,有利于西部喙緣蝽的入侵和定殖,山東內(nèi)陸山區(qū),如蒙山、泰山等也廣泛分布著松屬植物,為西部喙緣蝽向內(nèi)陸繼續(xù)擴(kuò)散提供了有利條件;紅肩美姬緣蝽的入侵和擴(kuò)散也應(yīng)引起重視,此蟲已在臺灣形成穩(wěn)定種群(Tsaietal., 2013),其寄主無患子科Sapindaceae植物在中國西南、東南、華南地區(qū)廣泛分布,為其入侵提供了便利條件,因此需要提高警惕并加強(qiáng)防控。

西部喙緣蝽主要危害種實,影響松林的自主更新,還能給松科植物帶來更多的病害,對針葉林經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境有一定的威脅。本研究推測了我國西部喙緣蝽種群的入侵來源。山東種群有兩個不同的入侵來源:煙臺種群可能來自北美東部,青島種群可能來自韓國。由于SNP分型技術(shù)和微衛(wèi)星技術(shù)受限于世界西部喙緣蝽基因數(shù)據(jù)庫的不足,本研究采用DNA條形碼技術(shù)對西部喙緣蝽進(jìn)行溯源分析。為了對西部喙緣蝽的入侵過程進(jìn)行更加明確地溯源分析,將來需要擴(kuò)大國外標(biāo)本的采集范圍,同時深入調(diào)查國內(nèi)入侵種群的分布現(xiàn)狀,提取國內(nèi)外不同種群的基因組信息,使用更加豐富的分子標(biāo)記進(jìn)行相互驗證。

致謝：感謝論文中使用的公共序列的作者和單位,感謝青島農(nóng)業(yè)大學(xué)王俊平提供西部喙緣蝽青島種群的公開序列。感謝當(dāng)?shù)亓謭?、保護(hù)區(qū)管理局提供的便利和協(xié)助。