當歸芍藥散對血管性癡呆大鼠炎癥因子及神經(jīng)細胞凋亡的影響

姜 林,李 彬,臧運華,于 淼,王 群,周喜燕

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟南 250355;2.青島大學(xué)附屬海慈醫(yī)院,山東 青島 266033)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是一種神經(jīng)認知障礙,是由于流向大腦的血流減少或缺乏而導(dǎo)致記憶、認知功能惡化,是年齡相關(guān)性認知障礙的第二大常見病因,占所有癡呆病例20%,僅次于阿爾茨海默病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,每年新發(fā)癡呆患者35萬以上,預(yù)計6年后將增加1倍[2]。血管性癡呆目前發(fā)病機制尚不明確且沒有特效治療方法,因此探索VaD發(fā)病機制對防治VaD具有重要意義。

當歸芍藥散出自張仲景所著《金匱要略》,由當歸、白芍、川芎、白術(shù)、澤瀉、茯苓組成,具有養(yǎng)血和血、活血化瘀功效,原文為治療妊娠、產(chǎn)后腹痛。20世紀80年代日本學(xué)者水島宣昭首次應(yīng)用當歸芍藥散治療癡呆,發(fā)現(xiàn)能明顯減輕患者攝食、運動、智能障礙等[3]?，F(xiàn)代研究指出,當歸芍藥散具有抗炎、抗氧化活性,能抑制腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)功能,改善中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,減少海馬細胞凋亡,緩解認知功能障礙[4]。因此,本研究以血管性癡呆大鼠為研究對象,基于炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細胞凋亡探討當歸芍藥散對血管性癡呆的治療作用,為疾病恢復(fù)提供新方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:純種SPF級SD雄性大鼠30只,平均體重(200±20)g,由青島市實驗動物中心提供。在安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng),平均室溫(23±1)℃,相對濕度60%,光線自動控制,明(7:00～19:00)、暗(19:00～7:00)交替,統(tǒng)一用顆粒型普通大鼠飼料喂養(yǎng),自由飲用涼開水。自由攝食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 實驗藥物:當歸芍藥散由當歸、白芍、川芎、茯苓、澤瀉、白術(shù)組成,所有藥品均購自青島市中醫(yī)院中藥房,藥品均為道地藥材。尼莫地平片(規(guī)格20 mg/片,批號H20003010)。

1.1.3 實驗試劑:二甲苯、無水乙醇、碳酸鋰、冰醋酸、30%H2O2(批號10023418、10009218、20022818、10000218、10011218,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);蘇木素(批號G1004,Servicebio公司);Bax兔抗(1∶1000,批號PAB46088);Bcl-2兔抗(1∶1000,批號A00040-1,博士德公司);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6) ELISA試劑盒(批號QYH-12018);蛋白質(zhì)Marker(批號P12103,Helix公司);PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑(批號IPVH00010、WBKLS0500)。

1.1.4 實驗儀器:正置顯微鏡、石蠟切片機(型號DM1000、RM2235,徠卡纖維系統(tǒng)有限公司);移液器(型號P100、P200,吉爾森P型移液器公司);恒溫烘箱(型號DHG-9023A,上海一恒科學(xué)儀器有限公司);攤片烤片機、自動組織脫水機(型號TKD-TK、TKD-TSF,湖北康強醫(yī)療器械有限公司);生物組織包埋機-冷凍機(型號TB-718L,泰維科技公司);電泳儀(型號mini protean 3 cell);水迷宮(型號zs-Morris);水浴鍋(型號HI1210);全自動化學(xué)發(fā)光儀(型號Tanon-5200);UPT優(yōu)普特實驗室超純水器(型號ULUPURE)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組,各組6只。采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法建立血管性癡呆模型大鼠[5]。大鼠造模前禁食12 h,用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,仰臥固定于手術(shù)板上備皮消毒,分離雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎,縫合切口。假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎頸總動脈,只做皮膚切口和組織分離處理后縫合皮膚。手術(shù)后所有大鼠均應(yīng)用青霉素10萬單位肌注3 d預(yù)防感染。

1.2.2 給藥方法:當歸9 g,白芍48 g,川芎、澤瀉各24 g,茯苓、白術(shù)各12 g,超純水浸泡1 h后,煮沸,收集藥液,再用6倍體積超純水煮沸,收集藥液,混合2次藥液,60 ℃濃縮,分裝置于-20 ℃冰箱保存,使用前加熱稀釋至所需濃度。各治療組于造模完成1周后開始灌胃給藥,當歸芍藥散低劑量組灌胃當歸芍藥湯1.8 g/kg;當歸芍藥散高劑量組灌胃當歸芍藥湯7.2 g/kg;尼莫地平組灌胃尼莫地平片20 mg/kg;假手術(shù)組、模型組灌胃等體積蒸餾水。各組大鼠均1次/d給藥,持續(xù)4周。

1.2.3 Morris水迷宮測評實驗:大鼠灌胃第4周,各組大鼠隨機選取3只進行Morris水迷宮實驗。定位航行實驗測量大鼠學(xué)習(xí)能力,將水池分為4個象限,將各組大鼠按象限順序依次面向池壁放入水中,記錄90 s內(nèi)成功爬上平臺所需要時間,設(shè)定大鼠找到平臺并滯留5 s及以上為成功,即逃避潛伏期。當大鼠超過90 s仍未找到平臺時,則引導(dǎo)其至平臺位置,并使其在平臺上停留20 s后放回籠中,此類大鼠逃避潛伏期記90 s。每只大鼠每天訓(xùn)練4次,早晚各2次,每次不同象限測定時間間隔為1 h,連續(xù)4 d。第5天進行測試,取4個象限逃避潛伏期時間的均值作為學(xué)習(xí)成績檢測指標。定位航行測試完成后第2天,撤除實驗平臺,測試大鼠90 s進入穿越平臺的次數(shù)?？臻g探索實驗測量大鼠記憶能力。

1.2.4 標本采集及檢測:術(shù)后30 d,提取Morris水迷宮后3只大鼠,1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉,腹主動脈取血,3000 r/min離心10 min,取上層血清,于-20 ℃中保存?zhèn)溆?。開顱,取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織,用4%多聚甲醛固定備用。

1.2.5 腦組織病理:取出海馬組織,石蠟包埋,做冠狀切片,片厚3 μm,置于Eppendorf管中,-80 ℃保存。按照試劑盒使用說明進行HE染色。光鏡下采用 Leica Application Suite圖像采集樣本相關(guān)位置,觀察海馬各區(qū)組織細胞學(xué)改變,評價神經(jīng)元損傷程度及范圍。

1.2.6 Western blotting檢測海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達:取出海馬組織,提取總蛋白,BCA法進行蛋白濃度定量,對各組大鼠海馬組織上述蛋白水平進行檢測,以GAPDH為內(nèi)參,進行蛋白條帶灰度值數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 免疫組化法檢測海馬組織Bc1-2、Bax蛋白表達:取出腦組織,切片用SP法染色,嚴格按照試劑盒說明進行。目標蛋白為棕黃色或棕褐色顆粒,光鏡下每張片子隨機選取3個視野,采用Image J軟件進行平均光密度分析反映免疫組化的蛋白表達強度。

1.2.8 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β含量:取出血清,按照ELISA試劑盒說明書操作,在多功能酶標儀450 nm波長處讀取數(shù)值并進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮測評比較 見表1。模型組較假手術(shù)組大鼠逃避潛伏期時間延長;當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組較模型組逃避潛伏期縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。當歸芍藥散低劑量組與模型組逃避潛伏期比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠穿越平臺次數(shù)少于假手術(shù)組,當歸芍藥散低劑量、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組穿越平臺次數(shù)多于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮測評實驗比較

2.2 各組大鼠腦組織病理形態(tài)比較 見圖1。假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)細胞形態(tài)完整,排列緊密;模型組大鼠海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)疏散、排列紊亂、胞核固縮、邊界不清等病理學(xué)變化;當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組大鼠海馬神經(jīng)元改變均減輕,且當歸芍藥散高劑量組細胞層變厚,結(jié)構(gòu)清晰,細胞核固縮減輕最明顯。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)比較(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達比較 見表2(圖2)。模型組較假手術(shù)組海馬組織Bcl-2蛋白表達下降,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組海馬組織Bcl-2蛋白表達高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組較假手術(shù)組Bax蛋白表達增多,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組Bax蛋白表達均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:當歸芍藥散低劑量組;D:當歸芍藥散高劑量組;E:尼莫地平組

表2 各組大鼠海馬組織Bc1-2、Bax蛋白表達比較

2.4 各組大鼠免疫組化海馬組織Bc1-2、Bax表達比較 見表3(圖3)。模型組海馬組織Bcl-2平均光密度低于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。當歸芍藥散高劑量組海馬組織Bcl-2平均光密度高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。當歸芍藥散低劑量組、尼莫地平組海馬組織Bcl-2平均光密度與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組Bax平均光密度值高于模型組,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組Bax平均光密度值低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表3 各組大鼠海馬組織Bc1-2、Bax光密度值比較(au)

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比較 見表4。模型組血清TNF-α含量高于假手術(shù)組,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組TNF-α含量低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組血清IL-1β高于假手術(shù)組,當歸芍藥散低劑量組、當歸芍藥散高劑量組、尼莫地平組IL-1β含量低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量比較(pg/ml)

3 討 論

血管性癡呆在中醫(yī)學(xué)歸為“癡呆”“呆病”范疇?！杜R證指南醫(yī)案》中記載“中風初起,神呆遺尿,老人厥中顯然?！薄峨s病源流犀燭·中風》中記載“中風后善忘”[3],可見古代就出現(xiàn)了血管性癡呆的病癥,臨床表現(xiàn)為記憶力減退、呆傻愚笨等。關(guān)于癡呆的病因病機,主要是脾氣虧虛為本,痰瘀阻絡(luò)為標,以虛和瘀為主要病理因素,導(dǎo)致髓海不足,腦神失養(yǎng)[6]。當歸芍藥散中,芍藥養(yǎng)血調(diào)經(jīng),柔肝止痛,歸肝、脾經(jīng),為君藥;川芎行氣止痛,歸肝、膽、心包經(jīng),為臣藥;澤瀉滲利濕濁,歸腎、膀胱經(jīng),與川芎二者共為臣藥;當歸補血活血,歸肝、心、脾經(jīng),助川芎行氣化瘀、助芍藥養(yǎng)血柔肝;茯苓、白術(shù)健脾燥濕,與當歸同為佐藥;和酒服用,可助血行,酒為使藥。氣血兼顧,養(yǎng)血行滯,痰瘀同治,寓攻于補[7]。李世英等[8]發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散可調(diào)節(jié)腦海馬神經(jīng)肽CGRP、ET-1、SS含量,改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Itoh等[9]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散改善了中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠大腦Ach水平降低,是治療癡呆的有用方劑。Huang等[10]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散通過改善APP/PS1小鼠氧化應(yīng)激和炎癥,改善認知缺陷。Lu[11]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散能夠改善大鼠學(xué)習(xí)缺失,此作用與提高體內(nèi)超氧化物歧化酶有關(guān)。鄭素霞等[12]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散通過調(diào)節(jié)大腦海馬自由基代謝,改善血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力。

神經(jīng)炎癥是癡呆神經(jīng)變性的一個重要過程,涉及淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)元損傷、纏結(jié)形成和死亡的惡性循環(huán)。有證據(jù)表明,Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與高水平促炎細胞因子有關(guān),包括TNF-α、IL-6、IL-1β[13]。當腦損傷發(fā)生后,炎癥因子聚集,激活A(yù)PP切割酶β分泌酶來促進Aβ產(chǎn)生,誘導(dǎo)促炎細胞因子增加,加重炎癥損傷,促進神經(jīng)細胞凋亡[14]。此外,炎癥反應(yīng)還可通過級聯(lián)反應(yīng),破壞血腦屏障,加重認知功能損傷[15]。潘艷芳等[16]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散可抑制小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6表達,緩解小鼠認知功能障礙。宋禎彥等[17]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散組大鼠炎癥因子IL-1β和IL-18 mRNA表達顯著降低,可抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng),保護神經(jīng)。姚麗偉[18]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散活性成分可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞M1/M2表型穩(wěn)態(tài),減輕炎癥反應(yīng),阻滯細胞自噬,抑制細胞凋亡。

神經(jīng)細胞凋亡指在某些生理和病理因素共同作用下激活細胞膜信號傳導(dǎo)系統(tǒng),促使相關(guān)凋亡調(diào)控因子啟動,造成神經(jīng)細胞死亡。神經(jīng)細胞對血管性癡呆凋亡途徑主要包括線粒體、Caspase家族、死亡受體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等介導(dǎo)。內(nèi)在凋亡途徑主要依靠Bcl-2家族蛋白對線粒體外膜通透性調(diào)節(jié)。線粒體介導(dǎo)的凋亡通路主要與Bcl-2、Bax有關(guān),Bcl-2是抑制細胞凋亡的調(diào)控蛋白,Bax是促進細胞凋亡的調(diào)控蛋白。線粒體途徑在細胞內(nèi)觸發(fā),激活Bax在線粒體外膜中形成孔,釋放細胞色素C,降解細胞蛋白。正常情況下,Bcl-2和Bax保持平衡[19]。

海馬是機體學(xué)習(xí)及記憶的高級神經(jīng)中樞,當海馬神經(jīng)元處于應(yīng)激狀態(tài),凋亡途徑被激活,誘導(dǎo)Bcl-2等凋亡蛋白,促使海馬神經(jīng)細胞死亡,機體學(xué)習(xí)及記憶功能受損,產(chǎn)生認知功能減退[20]。李澤等[21]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散組大鼠可增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達,其機制是通過Bcl-2信號通路,改善Aβ誘導(dǎo)的膽堿能神經(jīng)元凋亡。楊苗等[22]研究發(fā)現(xiàn),當歸芍藥散組大鼠神經(jīng)元凋亡率顯著降低,Bcl-2/Bax比值升高,促進線粒體自噬,改善線粒體功能,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,因此抑制神經(jīng)細胞凋亡可以起到預(yù)防VaD作用。

本實驗表明,模型組大鼠較假手術(shù)組大鼠病理學(xué)形態(tài)紊亂,Bax、TNF-α、IL-1β含量明顯增加,Bcl-2含量明顯減少,逃避潛伏期時間延長,穿越平臺次數(shù)減少,說明在VaD發(fā)病時,機體炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細胞凋亡被激活。當歸芍藥散各劑量組、尼莫地平組較模型組病理學(xué)形態(tài)呈不同程度改善,Bax、TNF-α、IL-1β含量減少,Bcl-2含量增加,逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺次數(shù)明顯增加,其中當歸芍藥散高劑量組改善最顯著,說明高劑量當歸芍藥散可明顯降低血管性癡呆大鼠炎癥因子神經(jīng)細胞凋亡。