生物炭添加下枯草芽孢桿菌應(yīng)對鎘脅迫的分子機(jī)制

丁靜，陳偉光，陳宇婷，何岸飛，姜晶，盛光遙

（蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

鎘具有很高的毒性，不僅會(huì)破壞生物機(jī)能，影響生態(tài)系統(tǒng)的正常功能[1]，還會(huì)通過食物鏈在生物以及人體內(nèi)富集，給人類健康帶來巨大風(fēng)險(xiǎn)[2]，因此對鎘污染水體進(jìn)行修復(fù)至關(guān)重要。生物炭是由富碳生物質(zhì)（如農(nóng)副產(chǎn)品）在缺氧條件下通過熱加工（如熱解）而獲得的物質(zhì)[3]，其孔隙和表面官能團(tuán)可與鎘發(fā)生物理化學(xué)作用[4]，是一種新興、低成本的吸附劑。然而，生物炭對鎘的固定效果較差，在廢水長期處理過程中可能發(fā)生解吸，造成二次污染[5]?？莶菅挎邨U菌是一種廣泛分布于不同環(huán)境的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，是原位生態(tài)水體中的代表菌種[6]。它被認(rèn)為是一種良好的生物吸附劑，低成本及環(huán)境友好的特點(diǎn)更使其在鎘廢水修復(fù)領(lǐng)域具有不可替代的優(yōu)勢[7-9]。然而，利用微生物吸附劑處理含鎘廢水存在難以分離和回收、微生物活性在生長初期易受鎘毒性影響等缺點(diǎn)[10]，從而限制了微生物吸附劑的應(yīng)用。

有研究指出，生物炭是固定微生物的良好載體，不僅可以為微生物提供有利的生存環(huán)境，還能為微生物生長提供碳源、能源和礦物營養(yǎng)[11]。而微生物可以協(xié)助生物炭完成對污染物的長期固定，同時(shí)還可能將生物炭用作厭氧呼吸中的末端電子受體[12]。Yuan等[13]的研究也證實(shí)了生物炭可作為微生物的電子供體。因此，近年來有學(xué)者采用生物炭聯(lián)合枯草芽孢桿菌處理含鎘廢水[14-15]，該方法可以彌補(bǔ)單一生物炭和微生物處理時(shí)的缺陷，同時(shí)生物炭和枯草芽孢桿菌之間的相互作用可能會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)對含鎘廢水的處理效果。然而，這些研究主要關(guān)注體系中鎘的吸附去除效果，并結(jié)合一系列的外在表征手段，從化學(xué)層面探索鎘、枯草芽孢桿菌和生物炭之間的相互作用過程，缺乏從微生物角度闡述其詳細(xì)的內(nèi)在分子機(jī)制[16]。明確枯草芽孢桿菌在生物炭添加及重金屬脅迫環(huán)境下的生理響應(yīng)和分子作用機(jī)制，對優(yōu)化生物炭-枯草芽孢桿菌復(fù)合技術(shù)處理重金屬廢水至關(guān)重要。

微生物對外在環(huán)境的生理適應(yīng)主要在轉(zhuǎn)錄水平上協(xié)調(diào)[17]，因此研究微生物在不同環(huán)境條件下基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的變化，可以理解環(huán)境條件對微生物的內(nèi)在影響機(jī)制[18-20]。Yu 等[21]通過轉(zhuǎn)錄組分析系統(tǒng)研究了溶解氧對枯草芽孢桿菌遺傳調(diào)控和代謝的影響。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，低氧供應(yīng)對代謝有3 個(gè)主要影響：增強(qiáng)碳代謝（葡萄糖代謝、丙酮酸代謝和碳溢出）、抑制氮源降解（谷氨酸族氨基酸和黃嘌呤）和嘌呤合成。此外，參與能量、細(xì)胞類型分化、蛋白質(zhì)合成的基因表達(dá)也受氧氣供應(yīng)的影響。Oomes 等[22]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了鈣離子對枯草芽孢桿菌孢子形成的影響，結(jié)果顯示，孢子形成、鞭毛形成和生物膜基質(zhì)形成通路都受到了顯著影響，孢壁多糖生物合成基因以及生物膜形成相關(guān)基因的表達(dá)也被影響。此外，對于枯草芽孢桿菌暴露于多種營養(yǎng)和環(huán)境條件下平鋪陣列轉(zhuǎn)錄組的研究，為研究枯草芽孢桿菌與環(huán)境污染物的相互作用機(jī)制提供了強(qiáng)大的理論基礎(chǔ)[23]。

因此，本實(shí)驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序，研究枯草芽孢桿菌在不同體系（正常、鎘脅迫、生物炭、生物炭-鎘脅迫）中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)理，討論生物炭添加對枯草芽孢桿菌抵抗鎘脅迫壓力及鎘去除能力的影響機(jī)制。研究結(jié)果可為未來生物炭-微生物聯(lián)用處理重金屬廢水提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 生物炭制備

生物炭原料為玉米秸稈，產(chǎn)自江蘇東海。將收集的玉米秸稈用粉碎機(jī)打碎（2～5 cm）后裝入砂鍋，用錫紙包裹，置于馬弗爐中，在500 ℃條件下高溫?zé)峤? h。待自然降溫6 h 后取出，在研缽中研磨，過100 目篩。洗凈烘干，最后冷凍干燥24 h后收集備用。

1.2 細(xì)菌來源及培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)采用的枯草芽孢桿菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC 編號(hào)1.4255）。培養(yǎng)基包括氯化鈉5 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1，pH 7.0。在30 ℃、170 r·min-1下培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)體系搭建

實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常培養(yǎng)（BS）、生物炭添加（BS_C）、鎘脅迫（BS_Cd）、生物炭-鎘脅迫（BS_C_Cd）4 組體系。將對數(shù)期保藏的枯草芽孢桿菌按7%（V/V）的比例先后兩次接種于新鮮培養(yǎng)基中，依次完成活化（2 h）和擴(kuò)大培養(yǎng)（8 h）。考慮到枯草芽孢桿菌在生物炭添加和鎘脅迫環(huán)境中適宜的暴露時(shí)間并不一致，并且在BS_C_Cd體系中，需要將枯草芽孢桿菌和生物炭混合培養(yǎng)一段時(shí)間后再進(jìn)入鎘脅迫環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了兩組培養(yǎng)體系。將擴(kuò)大培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌等量（200 mL）分裝到兩組無菌錐形瓶中，選擇一組為BS體系，在另一組中加入生物炭（0.2 g），形成BS_C 體系。兩組體系均設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并將其置于30 ℃和170 r·min-1的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3.5 h后，對兩組體系進(jìn)行取樣，用于轉(zhuǎn)錄組測序。取樣結(jié)束后，迅速在兩組體系中加入滅菌后的CdCl2溶液，控制每組體系中的鎘濃度為50 mg·L-1，形成BS_Cd 體系和BS_C_Cd 體系，反應(yīng)時(shí)間控制為20 min，用于分析鎘脅迫對枯草芽孢桿菌的即時(shí)壓力效應(yīng)。在此期間，分別在0、10、20 min 時(shí)對兩組體系進(jìn)行鎘濃度測定。反應(yīng)結(jié)束時(shí)（20 min），取樣用于轉(zhuǎn)錄組測序。

1.4 鎘濃度測定

采用原子吸收光譜儀PinAAcle900T（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）測定溶液中的鎘濃度。標(biāo)準(zhǔn)鎘溶液（1000 μg·mL-1）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。樣品測定前使用0.45μm 濾膜過濾，并加入定量硝酸（1%）稀釋，以控制濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，同時(shí)也抑制溶液中的鎘水解。

1.5 樣品收集及RNA分離純化

BS 體系和BS_Cd 體系：樣品采集后，利用離心機(jī)在4 000 r·min-1下離心3 min 收集菌體，用液氮快速冷凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

BS_C體系和BS_C_Cd體系：樣品采集后，分兩次離心收集菌體。第一次以2 500 r·min-1的較低轉(zhuǎn)速離心，除去樣品中的生物炭。第二次以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心收集菌體，用液氮快速冷凍，放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行樣品總RNA 提取，通過瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 完整性及是否存在DNA 污染，利用NanoPhotometer spectrophotometer（Implen，Munich，德國）檢測RNA的純度，通過Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent，Palo Alto，CA，美國）精確檢測RNA 的完整性。

1.6 轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序及分析

從提取的總RNA 中去除rRNA，獲得mRNA。隨后加入碎片化緩沖液，將得到的mRNA隨機(jī)打斷成短片段，按照鏈特異性方式建庫[24]。文庫構(gòu)建完成后，使用Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer（ThermoFisher，Waltham，MA，美國）對其進(jìn)行初步定量，然后稀釋文庫至1.5 ng·μL-1。隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer（Agilent，Palo Alto，CA，美國）對文庫中的插入片段大小進(jìn)行檢測。插入片段大小符合預(yù)期后，利用qRTPCR對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫有效濃度高于2 nmol·L-1），并進(jìn)行Illumina測序。

測序完成后，對獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行原始數(shù)據(jù)過濾，去除帶接頭的序列、含N（N 表示無法確定堿基信息）序列和低質(zhì)量序列（Qphred≤20 的堿基數(shù)占整個(gè)序列長度50%以上），并進(jìn)行測序錯(cuò)誤率和C 含量分布檢查，最終獲得用于后續(xù)分析使用的高質(zhì)量序列。用Bowtie2軟件對過濾后的序列進(jìn)行基因組定位分析[25]。用Rockhopper軟件將測序結(jié)果根據(jù)參考基因組進(jìn)行組裝，并與已注釋的基因模型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域[26]。通過Blastx與Nr庫比對，對新預(yù)測的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域進(jìn)行注釋。采用ClusterProfiler軟件對差異基因集進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，找出與差異基因顯著性相關(guān)的生物學(xué)功能或通路[27]。

2 結(jié)果與討論

2.1 含鎘體系中的鎘去除情況

圖1 顯示，兩個(gè)含鎘體系（BS_Cd 和BS_C_Cd）均在0～10 min 階段即表現(xiàn)出明顯的鎘吸附，之后在10～20 min 階段吸附放緩。BS_C_Cd 體系中生物炭和細(xì)菌對鎘的復(fù)合吸附量遠(yuǎn)大于BS_Cd 體系中單一細(xì)菌的吸附量，這可能會(huì)在一定程度上緩解體系中枯草芽孢桿菌的鎘脅迫毒性。因此本實(shí)驗(yàn)將鎘脅迫的反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為20 min，盡量讓枯草芽孢桿菌在鎘脅迫環(huán)境中具有一定的暴露時(shí)間，同時(shí)控制兩個(gè)體系中的鎘濃度差，從而獲得較科學(xué)的鎘脅迫/生物炭添加對枯草芽孢桿菌生理代謝的影響機(jī)制。

圖1 BS_Cd和BS_C_Cd體系中的鎘去除情況Figure 1 Cadmium removal in BS_Cd and BS_C_Cd systems

2.2 枯草芽孢桿菌在不同體系中的基因表達(dá)差異

由于本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了兩組培養(yǎng)體系（每個(gè)體系又分為兩個(gè)階段），為了更好地認(rèn)識(shí)枯草芽孢桿菌受生物炭刺激活性后，其對鎘脅迫壓力的生理響應(yīng)，本研究對BS_C_Cd 和BS_Cd 的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行了對比分析。從圖2 中可以發(fā)現(xiàn)，生物炭和鎘的加入均會(huì)導(dǎo)致枯草芽孢桿菌基因表達(dá)差異。BS_CdvsBS 組共有1 932 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因967 個(gè)，下調(diào)基因965 個(gè)；BS_CvsBS 組有312 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因133 個(gè)，下調(diào)基因179 個(gè)；BS_C_CdvsBS_C組有1 722 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因834 個(gè)，下調(diào)基因888 個(gè)。除此之外，在對BS_C_Cd 和BS_Cd 樣品進(jìn)行對比分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其存在1 541 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因691 個(gè)，下調(diào)基因850 個(gè)，差異基因數(shù)目遠(yuǎn)高于BS_CvsBS 組，說明在鎘脅迫壓力下，生物炭對枯草芽孢桿菌生理代謝的影響要遠(yuǎn)大于正常生長條件。BS_C_CdvsBS_C 組差異基因數(shù)目少于BS_CdvsBS 組，這進(jìn)一步證明枯草芽孢桿菌受到生物炭的積極作用，緩解了外界鎘脅迫對其造成的壓力和影響。這可能是因?yàn)樯锾看植诘谋砻婵椎?、較大的比表面積和孔隙容量為枯草芽孢桿菌提供了良好的生存環(huán)境，幫助枯草芽孢桿菌在一定程度上規(guī)避了鎘毒性[28]。同時(shí)在生物炭-鎘脅迫體系中，生物炭的存在為枯草芽孢桿菌的生長提供了營養(yǎng)[29]。Tao 等[30]以棉稈為原料制備生物炭作為枯草芽孢桿菌的高效接種載體，也發(fā)現(xiàn)與未添加生物炭的體系相比，細(xì)菌在生物炭體系中生長較快，細(xì)菌的最高濃度也較高?；鹕綀D直觀展示了每個(gè)組合的差異基因分布情況（圖2b～圖2f）。相比BS_CvsBS 組，其余有鎘添加的實(shí)驗(yàn)組都表現(xiàn)出較高的基因表達(dá)差異及顯著性水平。這進(jìn)一步說明當(dāng)暴露在鎘脅迫壓力下時(shí)，枯草芽孢桿菌的生理代謝會(huì)受到明顯抑制。然而如前所述，可能由于生物炭能幫助枯草芽孢桿菌規(guī)避鎘毒性，并可為細(xì)菌生長提供營養(yǎng)，因此在細(xì)菌應(yīng)對鎘脅迫的生理響應(yīng)上產(chǎn)生明顯影響，從而導(dǎo)致其基因表達(dá)差異顯著。

圖2 各實(shí)驗(yàn)/對照組間的差異表達(dá)基因數(shù)量（a）及其差異表達(dá)基因火山圖分布（P＜0.05，|log2差異倍數(shù)|＞0）（b）～（f）Figure 2 Numbers of differentially expressed genes（a）and volcano plot of the differentially expressed genes in the experimental/control groups（P＜0.05，|log2 Fold Change|＞0）（b）～（f）

2.3 枯草芽孢桿菌在不同體系中的GO功能富集

2.3.1 鎘脅迫/生物炭添加前后枯草芽孢桿菌重要功能條目表達(dá)變化

GO 功能富集揭示了各實(shí)驗(yàn)/對照組重要功能條目相關(guān)基因的上/下調(diào)情況。BS_CdvsBS組的差異基因GO 功能富集分析結(jié)果如圖3（a）所示，BS_CdvsBS以BS_Cd 為實(shí)驗(yàn)組、BS 為對照組。圖3（a）顯示，在鎘脅迫下，上調(diào)的差異表達(dá)基因主要?dú)w類為蛋白質(zhì)復(fù)合物（Protein-containing complex）、離子轉(zhuǎn)運(yùn)（Ion transport）、細(xì)胞器（Organelle）、陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（Cation transmembrane transporter activity）、運(yùn)動(dòng)（Locomotion）。這表明在鎘壓力下，枯草芽孢桿菌通過調(diào)控陽離子運(yùn)輸和轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)來加快溶液中鎘的去除。此外，差異基因在蛋白質(zhì)復(fù)合物方面也出現(xiàn)了正向調(diào)控，特別是CotA基因表達(dá)上調(diào)。CotA 是枯草芽孢桿菌的芽孢外壁蛋白，可以保護(hù)細(xì)菌免受紫外線輻射和過氧化物的損害[31]，因此該生物功能的正向調(diào)控可能有助于細(xì)菌隔絕溶液中鎘的直接毒害。下調(diào)的差異基因主要?dú)w類為氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity）、肽酶活性（Peptidase activity，acting on L-amino acid peptides）、維生素生物合成過程（Vitamin biosynthetic process）。整體來看，GO 富集分析在細(xì)胞組分分類中的上調(diào)基因數(shù)量均多于下調(diào)基因，同時(shí)在生物學(xué)過程分類中的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和運(yùn)動(dòng)功能條目、分子功能中的陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性功能條目中，上調(diào)基因數(shù)量也多于下調(diào)基因。而在生物學(xué)過程分類中的維生素合成功能條目、分子功能分類中的氧化還原酶和水解酶活性功能條目中，下調(diào)基因數(shù)量要多于上調(diào)基因。此外，值得一提的是運(yùn)動(dòng)功能條目，其差異基因表達(dá)全部為上調(diào)，這意味著鎘壓力明顯增強(qiáng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能。盡管枯草芽孢桿菌面對鎘毒性會(huì)產(chǎn)生上述自衛(wèi)反應(yīng)，但鎘脅迫對枯草芽孢桿菌的侵害仍然是直接且不可避免的，在鎘毒性下，枯草芽孢桿菌的部分生理代謝功能仍然受到了明顯抑制。

圖3 BS_Cd vs BS組（a）和BS_C vs BS組（b）的差異基因GO功能富集分析Figure 3 GO function enrichment analysis of differentially expressed genes in BS_Cd vs BS（a）and BS_C vs BS（b）groups

BS_CvsBS以BS_C為處理組、BS為對照組。圖3（b）顯示，添加生物炭后，GO 富集分析在細(xì)胞組分分類中上調(diào)基因數(shù)量均多于下調(diào)基因。上調(diào)的差異表達(dá)基因主要?dú)w類為細(xì)胞（Cell）、胞內(nèi)（Intracellular）、水解酶活性（Hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、催化復(fù)合體（Catalytic complex）、核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成（Ribonucleoprotein complex biogenesis）。下調(diào)的差異基因主要?dú)w類為各種生物大分子合成及代謝調(diào)控，包括RNA 合成和DNA 的轉(zhuǎn)錄過程，以及各種轉(zhuǎn)移酶活性。從增強(qiáng)的基因功能條目來看，生物炭的添加對枯草芽孢桿菌的細(xì)胞組分相關(guān)功能產(chǎn)生了積極影響，但對其生物合成和各種轉(zhuǎn)移酶活性產(chǎn)生了負(fù)面影響。

2.3.2 生物炭-鎘脅迫體系中枯草芽孢桿菌重要功能條目表達(dá)變化

BS_C_CdvsBS_C 是以BS_C_Cd 為處理組、BS_C為對照組。圖4（a）顯示，上調(diào)的差異基因包括細(xì)胞組分的各功能條目和分子功能下的各種底物/離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能條目，特別是轉(zhuǎn)運(yùn)活性（Transporter activity）。此外，在生物學(xué)過程分類下的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cell motility）、趨化性（Chemotaxis）、纖毛或鞭毛依賴的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（Cilium or flagellum-dependent cell motility）、運(yùn)動(dòng)（Locomotion）、細(xì)胞或亞細(xì)胞組分的移動(dòng)（Movement of cell or subcellular component）和趨避性（Taxis）功能條目中，差異基因表達(dá)全部為上調(diào)。下調(diào)的差異基因主要為維生素的生物合成和代謝過程，以及內(nèi)肽酶活性。這表明相對于BS_C 體系，BS_C_Cd 體系中的枯草芽孢桿菌受到鎘脅迫時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)部的一些生物合成和代謝過程會(huì)受到抑制，但是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)趨勢明顯增強(qiáng)（或許會(huì)向生物炭表面和內(nèi)部運(yùn)動(dòng)），從而使其有效規(guī)避鎘毒性壓力。并且，細(xì)菌的離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能也得到明顯增強(qiáng)，這可能提高了枯草芽孢桿菌的鎘轉(zhuǎn)移能力。

圖4 BS_C_Cd vs BS_C組（a）和BS_C_Cd vs BS_Cd組（b）的差異基因GO功能富集分析Figure 4 GO function enrichment analysis of differentially expressed genes in BS_C_Cd vs BS_C（a）and BS_C_Cd vs BS_Cd（b）groups

如前所述，除上述3 組樣品間的差異基因分析外，本研究對BS_C_Cd 和BS_Cd 的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果也進(jìn)行了對比分析，用以參考性地認(rèn)識(shí)生物炭刺激枯草芽孢桿菌活性后，枯草芽孢桿菌對鎘脅迫壓力的生理響應(yīng)是否與正常狀態(tài)下的鎘應(yīng)對措施有所不同。圖4（b）顯示，GO 富集分析在大部分功能條目中的上調(diào)基因數(shù)量都多于下調(diào)基因。上調(diào)的差異基因主要有小分子結(jié)合（Small molecule binding）、核苷酸結(jié)合（Nucleotide binding）、核苷磷酸結(jié)合（Nucleoside phosphate binding）、裂解酶活性（Lyase activity）、氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity，acting on CH-OH group of donors）、膜的內(nèi)在組分（Intrinsic component of membrane）、膜的必需組分（Integral component of membrane）、細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞組分（Cell part）、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、胞內(nèi)（Intracellular）、輔因子生物合成過程（Cofactor biosynthetic process）、輔因子代謝過程（Cofactor metabolic process）、單羧酸生物合成過程（Monocarboxylic acid biosynthetic process）、單羧酸代謝過程（Monocarboxylic acid metabolic process）、有機(jī)磷生物合成過程（Organophosphate biosynthetic process）、有機(jī)磷代謝過程（Organophosphate metabolic process）、含磷化合物代謝過程（Phosphate-containing compound metabolic process）、磷代謝過程（Phosphorus metabolic process）、四吡咯生物合成過程（Tetrapyrrole biosynthetic process）、四吡咯代謝過程（Tetrapyrrole metabolic process）。下調(diào)的差異基因有細(xì)胞外圍（Cell periphery）、質(zhì)膜（Plasma membrane）和激酶活性（Kinase activity）?？梢钥吹?，相比于單一含鎘體系，生物炭的存在增強(qiáng)了枯草芽孢桿菌體內(nèi)各種生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能基因的表達(dá)，這與前文生物炭為枯草芽孢桿菌提供營養(yǎng)的說法相一致。張秋等[32]探究了生物炭對鎘污染土壤團(tuán)聚體酶活性的影響，結(jié)果顯示，生物炭顯著提升了鎘污染土壤團(tuán)聚體的酶活性，尤其是在碳循環(huán)酶中的蛋白酶和氧化還原酶中的過氧化氫酶處理上表現(xiàn)明顯。本研究認(rèn)為，這可能是因?yàn)樯锾扛牧己吞岣吡藞F(tuán)聚體的結(jié)構(gòu)和性能，形成了對微生物更有利的生存環(huán)境，同時(shí)對土壤中重金屬有效態(tài)的鈍化作用也促進(jìn)了作物根系的生長，但對酶活性變化機(jī)理并未進(jìn)行深入討論。生物炭也促進(jìn)了細(xì)菌在鎘環(huán)境下對含磷化合物的合成和代謝。有研究指出[33]，微生物分泌的有機(jī)酸會(huì)在生物炭表面形成弱酸性的微環(huán)境，促進(jìn)生物炭中磷的釋放，使重金屬與其形成穩(wěn)定的磷化合物進(jìn)而被長期固定在生物炭表面。此外值得注意的是，陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因czcD和重金屬外流泵蛋白相關(guān)基因cadA在BS_CdvsBS 組的表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào)，而在BS_C_Cd 和BS_Cd 的對比結(jié)果中則呈現(xiàn)為上調(diào)。czcD基因已被證明是金屬抗性基因[34]。并且研究發(fā)現(xiàn)，鎘的抗性基因系統(tǒng)主要有czc 和cad 兩種，cadA基因存在于包括葡萄球菌屬、微球菌屬及鹽芽孢桿菌屬等多種細(xì)菌基因組中，菌株通過該基因所編碼的酶將鎘泵出菌體外，從而起到解毒作用[35]。因此，czcD和cadA基因在BS_C_Cd 和BS_Cd 組中的表達(dá)上調(diào)，意味著生物炭可能激活了枯草芽孢桿菌體內(nèi)鎘抗性基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)了其對鎘脅迫的抵抗能力。并且膜相關(guān)功能條目的差異基因以上調(diào)為主。已有研究通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在生物炭-鎘脅迫體系中確實(shí)形成了生物膜[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)中膜相關(guān)功能條目差異基因的上調(diào)，也進(jìn)一步驗(yàn)證了以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，預(yù)示著體系中早期生物膜發(fā)育跡象。

2.4 枯草芽孢桿菌在不同體系中的KEGG通路富集

2.4.1 鎘脅迫/生物炭添加前后枯草芽孢桿菌代謝通路表達(dá)變化

KEGG 富集分析結(jié)果表明（表1），體系中加入鎘后，枯草芽孢桿菌的鞭毛組裝和細(xì)菌趨化性通路都明顯增強(qiáng)。這兩條通路的增強(qiáng)是枯草芽孢桿菌在鎘脅迫下產(chǎn)生應(yīng)激自衛(wèi)反應(yīng)的直接表現(xiàn)。鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，同時(shí)也在細(xì)菌的表面黏附上起到一定作用[36]。鎘的存在激活了枯草芽孢桿菌鞭毛運(yùn)動(dòng)的開關(guān)FliM，鞭毛組裝通路的增強(qiáng)說明在鎘環(huán)境中，枯草芽孢桿菌通過加快自身運(yùn)動(dòng)來躲避鎘毒性[37]。此外，氧化磷酸化通路也被增強(qiáng)。氧化磷酸化是細(xì)菌生成ATP 的重要途徑之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，氧化磷酸化參與了細(xì)胞的抗毒害活動(dòng)，通過促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)能和提高能量轉(zhuǎn)化效率來解毒，證實(shí)了能量衰竭可能是造成毒害的原因[38]。而核黃素代謝和硫傳遞系統(tǒng)相關(guān)通路都受到了明顯抑制，說明細(xì)菌在鎘毒性壓力下部分物質(zhì)代謝能力減弱，進(jìn)一步體現(xiàn)了鎘毒性對枯草芽孢桿菌代謝活性的抑制。BS_CvsBS處理組的KEGG通路富集分析中，只有淀粉和蔗糖代謝通路表現(xiàn)出顯著富集，說明生物炭的添加顯著增強(qiáng)了枯草芽孢桿菌對能源物質(zhì)的代謝功能。

表1 各處理/對照組KEGG顯著富集通路中的差異基因表達(dá)情況Table 1 Expression of the differential genes in KEGG enrichment pathways in the experimental/control groups

2.4.2 生物炭-鎘脅迫體系中枯草芽孢桿菌代謝通路表達(dá)變化

BS_C_CdvsBS_C 處理組的差異基因顯著富集通路情況與BS_CdvsBS 組相似，部分代謝相關(guān)通路（核黃素代謝、硫代謝、不同環(huán)境中的微生物代謝）的基因表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，但與鞭毛組裝及細(xì)菌趨化性通路相關(guān)的基因表達(dá)則呈現(xiàn)上調(diào)。此外，核糖體和纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸生物合成通路的差異基因表達(dá)也表現(xiàn)出明顯上調(diào)?？梢婃k添加確實(shí)對細(xì)菌的代謝產(chǎn)生了部分抑制，但是會(huì)明顯增強(qiáng)細(xì)胞躲避壓力和毒性的運(yùn)動(dòng)行為。

而對BS_C_Cd 和BS_Cd 的差異基因進(jìn)行顯著富集代謝通路分析時(shí)發(fā)現(xiàn)（表2），枯草芽孢桿菌物質(zhì)和能源代謝相關(guān)通路的基因表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)，包括氨基糖和核苷酸糖代謝、不同環(huán)境中的微生物代謝、碳代謝、糖酵解和糖異生以及磷酸戊糖途徑。這說明生物炭的存在可以緩解鎘脅迫對枯草芽孢桿菌的毒性效應(yīng)，且可能為細(xì)菌提供了能源，繼而刺激了枯草芽孢桿菌的生命代謝活動(dòng)。這也與周鳳等[39]的研究結(jié)果類似。

表2 BS_C_Cd和BS_Cd差異基因的KEGG顯著富集通路情況Table 2 KEGG enrichment pathway of differentially expressed genes between BS_C_Cd and BS_Cd

差異基因在氨基糖和核苷酸糖代謝、糖酵解和糖異生、磷酸戊糖途徑通路的顯著富集，也揭示了生物膜的早期發(fā)育現(xiàn)象。有研究指出，生物膜發(fā)育過程中，大多數(shù)被測的代謝途徑都發(fā)生了顯著的動(dòng)態(tài)變化，包括TCA 循環(huán)、糖酵解、核苷酸和氨基酸生物合成等[40]。并且差異基因在細(xì)胞組分顯著富集的功能條目也與膜組成有關(guān)。而在BS_CdvsBS 組中，則沒有表現(xiàn)出任何生物膜形成跡象。已有研究發(fā)現(xiàn)，在生物炭協(xié)同體系中，枯草芽孢桿菌可以附著在生物炭表面及孔道內(nèi)生長，形成復(fù)合體；并且菌體分泌出更多的胞外聚合物，使得細(xì)菌間粘連現(xiàn)象更明顯，這可能是形成生物膜的重要標(biāo)志[15]。生物膜附著在固體載體上，對機(jī)械應(yīng)力和生物量具有一定的保護(hù)作用，是一種有潛力的工業(yè)廢水處理方法[41]。因此生物膜的形成可以對細(xì)菌產(chǎn)生保護(hù)作用，這對于提高枯草芽孢桿菌對含鎘廢水的處理能力具有重要意義。

此外，在不顯著富集通路中，與谷胱甘肽代謝相關(guān)的差異基因表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，但在BS_CdvsBS 組中，相關(guān)的差異基因表達(dá)則呈現(xiàn)下調(diào)。谷胱甘肽具有抗氧化和解毒功能，可防止活性氧物質(zhì)如自由基、過氧化物等對細(xì)胞造成損害[42]。并且有研究指出，谷胱甘肽在金屬結(jié)合肽的合成中至關(guān)重要，金屬結(jié)合肽可通過形成細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的金屬絡(luò)合物來螯合重金屬[43-44]。因此，該差異基因上調(diào)說明生物炭的存在提高了谷胱甘肽代謝活性，在提高細(xì)菌抗氧化和解毒能力的同時(shí)，可能也對鎘的去除起到了積極作用。嘌呤代謝、蛋白質(zhì)輸出、細(xì)菌分泌系統(tǒng)這幾個(gè)通路的基因表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)，這可能是由于在BS_Cd 體系中，枯草芽孢桿菌直接暴露于鎘脅迫壓力下，需要更多刺激自身的免疫和保護(hù)功能。而在BS_C_Cd 體系中，受到生物炭的外在物理性保護(hù)和內(nèi)在代謝促進(jìn)，枯草芽孢桿菌受到的鎘脅迫壓力相對較小，因此對這些通路的基因表達(dá)刺激較小。

3 結(jié)論

（1）生物炭添加和鎘脅迫均會(huì)導(dǎo)致枯草芽孢桿菌基因表達(dá)差異，但生物炭可以緩解鎘脅迫對枯草芽孢桿菌的壓力和影響。

（2）在鎘脅迫壓力下，枯草芽孢桿菌的生理代謝功能受到了明顯抑制，但細(xì)菌通過上調(diào)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及鎘轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)來規(guī)避鎘毒性，其鞭毛組裝和細(xì)菌趨化性通路都明顯增強(qiáng)。

（3）生物炭添加對枯草芽孢桿菌的細(xì)胞組分相關(guān)功能產(chǎn)生了積極影響，并且增強(qiáng)了細(xì)菌對能源物質(zhì)的代謝功能。

（4）生物炭-鎘脅迫體系中，生物炭增強(qiáng)了枯草芽孢桿菌在鎘脅迫壓力下各種生物過程、細(xì)胞組分和分子功能基因的表達(dá)，包括細(xì)菌對含磷化合物的合成和代謝，以及細(xì)菌體內(nèi)鎘抗性基因的表達(dá)。