灌溉與生物質(zhì)炭對土壤硝化反硝化功能微生物的影響

劉杰云，邱虎森，張文正，胡壯壯，呂謀超，王鈺

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)田灌溉研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部節(jié)水灌溉工程重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453002；2.宿州學院環(huán)境與測繪工程學院，安徽 宿州 234100；3.宿州市農(nóng)業(yè)科學院，安徽 宿州 234100）

硝化和反硝化作用是土壤氮循環(huán)中的重要過程，二者均受到土壤微生物的調(diào)控。硝化作用將在土壤中移動性較小的銨根離子轉化為移動性較強的硝酸根離子，有利于補充根區(qū)氮素，便于植物吸收利用。氨氧化作用是土壤硝化作用的第一步，也是其限速步驟[1]。氨氧化作用主要由具有編碼氨單加氧酶基因amoA的氨氧化微生物參與完成，包括氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea，AOA）。氨氧化細菌在中性或堿性及富氮環(huán)境中占主導地位，而氨氧化古菌則在酸性及養(yǎng)分含量較低的環(huán)境中占主導地位[2]。反硝化作用是在嫌氣條件下，硝酸鹽在反硝化微生物的作用下，還原為N2、N2O 或NO 的過程，又被稱為脫氮作用，它是在由nar、nir、nor、nos等基因編碼的一系列還原酶的作用下完成的。土壤硝化作用及反硝化作用受土壤水分、養(yǎng)分、氧氣、pH、溫度等的影響。

灌溉可通過改變土壤水分狀況及理化性質(zhì)、微生物數(shù)量及活性、土壤中氣體擴散速率等影響土壤氮轉化過程[3]。不同灌溉方式下土壤水分含量及分布有較大差異，因而其對土壤氮轉化過程的影響差異也較大[4-5]。滴灌采用滴灌帶，通過少量多次灌水，在不破壞土壤結構條件下，將水肥精確施到根系周圍，為根際創(chuàng)造良好的生長條件。噴灌灌水過程類似天然降雨，水分以微小液滴的形式逐漸且均勻地降落并滲入土壤，減少了表層土壤緊實度和板結，從而提高了土壤孔隙度和通氣性。微噴灌是通過微噴帶將水噴射到空中，散成細小霧滴，噴灑到根區(qū)的一種節(jié)水灌溉技術。節(jié)水灌溉方式因其較高的水分利用效率，可有效降低灌水量。土壤水分含量的改變勢必影響土壤微生物群落及功能菌群的作用。如充足的水分條件可以提高微生物的豐富度和均勻度[6]；與AOB相比，干燥的土壤環(huán)境更有利于AOA豐度的提高[7]。土壤水分含量的增加會促進微生物反硝化過程[8]，在降低土壤銨態(tài)氮含量的同時會增加硝態(tài)氮的遷移與淋失風險。韓冰等[9]的研究結果表明滴灌和滲灌較溝灌降低了土壤反硝化細菌豐度，進而降低N2O 排放。不同灌溉方式是否可通過改變土壤濕潤體的大小，影響土壤氮形態(tài)，尤其是無機氮的形態(tài)以及其微生物過程，有待于進一步研究。

生物質(zhì)炭作為一種堿性、多孔性、高比表面積和含有大量表面電荷及高電荷密度的材料，施入土壤后能夠在改變土壤pH、吸附固定土壤無機離子及各種極性和非極性化合物的同時，一定程度上改變土壤結構和微環(huán)境，如土壤通氣性等[10]，從而對土壤硝化及反硝化過程產(chǎn)生影響。Xiao 等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭通過改善土壤孔隙結構和通氣狀況，增加溶氧量來改變AOA 和AOB 的活性，從而促進土壤硝化作用。Song 等[12]通過12 周的培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，4～6 周內(nèi)生物質(zhì)炭對土壤氨氮的吸附作用促進了氨氧化作用。生物質(zhì)炭可促進土壤pH 的升高和土壤硝化速率的提升，有利于提高NO-3-N 含量[13-14]。王曉輝等[15]將稻稈生物質(zhì)炭施入到酸性土壤中，結果發(fā)現(xiàn)，土壤中AOB 的豐度和pH 均增加，進而增加了土壤的硝化潛勢。生物質(zhì)炭帶入的電子供體，可降低NO-3-N 含量，促進N2O 排放，而對銨根離子和硝酸根離子的吸附作用和生物質(zhì)炭的強堿性引起的氨揮發(fā)卻不利于反硝化過程的進行[16]。

目前，灌溉方式與生物質(zhì)炭互作對土壤氮轉化的影響研究主要集中在氮形態(tài)、氮素損失、氮素利用率等方面。Wang 等[17]的研究表明，與畦灌相比，膜下滴灌可降低土壤礦質(zhì)態(tài)氮含量及N2O 排放，在各灌溉方式下（畦灌、地表滴灌、膜下滴灌），添加生物質(zhì)炭均可降低土壤N2O 排放和NH3揮發(fā)，增加土壤NO-3-N 含量及植物對氮素的吸收利用。節(jié)水灌溉模式與生物質(zhì)炭互作可降低土壤NO-3-N的淋溶損失，與漫灌、畦灌相比，噴灌條件下，土壤淋洗液中NO-3-N分別降低了37.51%和34.29%，生物質(zhì)炭與漫灌、畦灌互作對NO-3-N 淋失均沒有影響，但噴灌條件下添加生物質(zhì)炭可顯著降低NO-3-N 淋失[18]。此外，灌溉和生物質(zhì)炭均可通過影響土壤微生物的活動而影響土壤礦質(zhì)態(tài)氮的遷移轉化。蔡九茂等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，參與土壤礦質(zhì)態(tài)氮轉化的關鍵功能菌群不受滴灌方式（地表滴灌和插入式滴灌）的影響，但受生物質(zhì)炭的調(diào)控，生物質(zhì)炭削弱了地表滴灌與插入式滴灌非根際土壤硝態(tài)氮的差異，促進了同種滴灌方式下非根際土壤NO-3-N的積累。綜上所述，不同灌溉方式及生物質(zhì)炭均可影響礦質(zhì)態(tài)氮的遷移轉化，但不同灌溉方式與生物質(zhì)炭互作如何影響土壤硝化及反硝化微生物，進而影響土壤礦質(zhì)態(tài)氮的轉化，目前尚不清楚?；诖?，本研究采用田間小區(qū)試驗，通過在4 種不同灌溉方式下（常規(guī)地表漫灌、滴灌、噴灌和微噴灌）添加不同量生物質(zhì)炭（0、10、20 t·hm-2），研究灌溉方式與生物質(zhì)炭互作對土壤硝化及反硝化作用相關功能微生物的影響，擬探明灌溉方式與生物質(zhì)炭互作對土壤礦質(zhì)態(tài)氮轉化影響的微生物學機制，以期為華北地區(qū)節(jié)水灌溉方式及生物質(zhì)炭的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與生物質(zhì)炭

試驗小區(qū)位于河南省新鄉(xiāng)縣七里營鎮(zhèn)中國農(nóng)業(yè)科學院新鄉(xiāng)綜合試驗基地（35°08′N，113°45′E），海拔73.2 m。本區(qū)域多年平均氣溫為14.1 ℃，多年平均降水量為582 mm，且多集中在7—9 月（占全年降水量的70%～80%），無霜期為210 d，多年平均蒸發(fā)量為2 000 mm，光熱資源豐富，農(nóng)作物種植制度以冬小麥-夏玉米輪作為主。供試土壤類型為潮土，土壤質(zhì)地為粉壤土。生物質(zhì)炭產(chǎn)自河南商丘三利新能源有限責任公司，為花生殼在500 ℃左右條件下制成，為粉末狀。供試土壤和生物質(zhì)炭的基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤（0～20 cm）及生物質(zhì)炭基本理化性質(zhì)Table 1 Basic properties of soil and biochar

1.2 試驗設計

本試驗小區(qū)面積為49 m2（7 m×7 m），小區(qū)之間設置2 m 寬保護行。選取4 種灌溉方式：傳統(tǒng)漫灌（F）、滴灌（D）、噴灌（S）和微噴灌（I）。因本研究土壤為堿性土壤，為避免生物質(zhì)炭對堿性土壤的pH影響過大，每種灌溉方式設置3 個較低量的生物質(zhì)炭處理：①無生物質(zhì)炭添加（CK）；②添加10 t·hm-2生物質(zhì)炭（LB）；③添加20 t·hm-2生物質(zhì)炭（HB）。生物質(zhì)炭在2018年10 月冬小麥種植前添加，具體施用方法：前茬玉米收獲后，采用移動式噴灌方式灌水，待土壤濕度適宜后，用旋耕機旋耕，為保證灌水均勻度，再用激光平地儀平整土地。人工劃定小區(qū)后，按照不同處理將基肥、生物質(zhì)炭先后人工均勻撒施入土壤，然后翻耕（為避免翻耕對不同生物質(zhì)炭處理造成影響，按照生物質(zhì)炭處理縱向直線翻耕），以免灌水時出現(xiàn)生物質(zhì)炭漂浮損失。翻耕后人工起田埂（高20 cm 左右），起埂所用土壤來自保護行。灌水時，雖然有少量生物質(zhì)炭漂浮現(xiàn)象，但由于田埂的保護，避免了不同處理間的影響及生物質(zhì)炭的損失。每個處理3 個重復，小區(qū)分布見圖1。

圖1 田間小區(qū)分布示意圖Figure 1 The distribution diagram of field plots

供試冬小麥品種為矮抗207，2018 年10 月11 日種植，行間距20 cm，2019 年6 月8 日收獲，小麥產(chǎn)量等作物生長情況詳見文獻[20]。氮肥施用量按照當?shù)爻Ｒ?guī)施肥，總施氮量為202.5 kg·hm-2，分2 次人工撒施入土壤，小麥播種前施用750 kg·hm-2含鉀二銨復合肥（N、P2O5、K2O 質(zhì)量比為15∶39∶8）作為基肥（以N 計為112.5 kg·hm-2），返青期施用600 kg·hm-2尿素作為追肥（以N 計為90 kg·hm-2），施肥后灌水。灌溉用水來自地下水，符合灌溉用水水質(zhì)標準，根據(jù)作物需水規(guī)律灌水4 次：2018 年11 月12 日采用移動式噴灌方式灌越冬水；2019 年2 月25 日、4 月17 日、5 月20日分別進行灌水，漫灌為灌足水，每次灌水定額約為90 mm（每次每個小區(qū)灌水量為4.4 t），滴灌、噴灌、微噴灌根據(jù)當?shù)亟邓考白魑镄杷縼泶_定，設定每次灌水定額為45 mm（每次每個小區(qū)灌水量為2.2 t）。每個小區(qū)一個水表和閥門，單獨控制。整個小麥生育期漫灌、滴灌、噴灌和微噴灌的總灌水量分別為360、225、225 mm 和225 mm。農(nóng)田病蟲害防治等田間管理均采用當?shù)爻Ｒ?guī)管理模式：12 月下旬噴施除草劑，4 月初及4 月底分別噴施防治病蟲害（蚜蟲、白粉病、黃銹病）藥劑1 次，同時添加磷酸二氫鉀增加作物營養(yǎng)。

1.3 土壤樣品采集與測定

于冬小麥拔節(jié)期（2019 年4 月2 日）采集土壤樣品。在每個小區(qū)內(nèi)按照“S”形取5個點，采集0～20 cm耕層土壤，混合后作為1 個樣品。將土壤樣品中的根系、石子等挑出，并將其充分混勻，實驗室4 ℃保存。另取其中200 g 左右樣品迅速用錫箔紙包好，放入滅菌的袋子，投入到液氮中，運送至實驗室，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取50 mL 的0.5 mol·L-1K2SO4加到10 g 土中，振蕩1 h后過濾。濾液用連續(xù)流動分析儀（AA3，德國）測定土壤中的-N 和-N 含量；礦質(zhì)態(tài)氮（Nmin）為-N 和-N 含量之和。土壤pH 值測定：蒸餾水（土水比為1∶2.5）浸提30 min，用Mettler-toledo320 pH 計測定。

1.4 硝化/反硝化微生物功能基因豐度測定

土壤中微生物的總DNA用DNA提取試劑盒（PowerSoilTMDNA Isolation Kit，Mo Bio Laboratories Inc.，CA）提取，使用Nanodrop2000核酸分析儀測定DNA濃度和純度后，將提取的總DNA置于-20 ℃保存。

AOA-amoA、AOB-amoA、nirK和nosZ基因標準曲線的構建參見Chen 等[21]的方法：首先構建克隆文庫，然后選擇陽性克隆子，吸取10μL菌液于5 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)10 h，提取重組質(zhì)粒，測量OD 值，換算成拷貝數(shù)。10 倍梯度稀釋作為標準曲線的模板。標準曲線的范圍為102～108?？截悢?shù)計算：拷貝數(shù)（μL）=6.02×1023×質(zhì)粒濃度（ng·μL-1）×10-9/（插入片段長度×660）。

實時熒光定量PCR（qPCR）分析：所用儀器為ABI 7500 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystem）。AOA-amoA、AOB-amoA、nirK和nosZ基因的反應體系為：1μL DNA 模板，0.8μL 上游引物（Arch-amoAF[21]，AmoA-1F，nirK-FlaCu[22]，nosZ-1126F[23]），0.8μL 下游引物（Arch-amoAR，AmoA-2R，nirK-R3Cu，nosZ-1381R），10μL 2X Taq Plus Master Mix，補充ddH2O 至20 μL。AOA-amoA、AOB-amoA和nosZ的擴增程序相同：95 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃1 min。nirK擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，35個循環(huán)；72 ℃1 min。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 20.0 分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA，置信水平為95%）和雙因素方差分析；利用R 語言分析軟件分析土壤性質(zhì)與功能基因豐度之間的相關性。

2 結果與分析

2.1 灌溉方式及生物質(zhì)炭添加對土壤性質(zhì)的影響

由雙因素方差分析的結果（表2）可知，灌溉方式可顯著影響土壤-N、-N、Nmin和pH（P＜0.01），生物質(zhì)炭添加可顯著影響土壤-N（P＜0.01）、Nmin（P＜0.05）和pH（P＜0.01），但對土壤-N 含量影響不顯著（P＞0.05）。灌溉方式與生物質(zhì)炭互作可顯著影響土壤-N（P＜0.01）、Nmin（P＜0.01）和pH（P＜0.05），但對土壤-N含量影響不顯著（P＞0.05）。

表2 灌溉方式及生物質(zhì)炭對土壤性質(zhì)影響的雙因素方差分析Table 2 Two-way ANOVA analysis for the effects of irrigation types and biochar on soil properties

由圖2 可知，無論添加生物質(zhì)炭與否，D、S 和I 處理均較F處理顯著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在F 及I 處理條件下，添加生物質(zhì)炭對土壤-N 含量無顯著影響（P＞0.05）。與D+CK 處理相比，D+LB和D+HB 處理顯著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在S處理條件下，僅S+HB處理較S+CK處理顯著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在CK 處理中，D+CK較I+CK 顯著增加了土壤-N 含量（P＜0.05），其他處理之間差異不顯著（P＞0.05）。在LB 處理中，D、S與I 處理均較F 處理顯著增加了土壤-N 含量（P＜0.05），且S處理顯著高于D 和I處理（P＜0.05）。在HB處理中，I 較F、D 和S 處理顯著增加了土壤-N 含量（P＜0.05）。F 處理條件下，添加生物質(zhì)炭對土壤-N 含量影響不顯著（P＞0.05）。D+HB 較D+CK 處理顯著降低了土壤-N 含量（P＜0.05）。在S 處理條件下，各生物質(zhì)炭處理之間差異均顯著（P＜0.05），其土壤-N 含量從大到小依次為S+LB＞S+CK＞S+HB。土壤Nmin含量變化與-N 含量變化較一致，即無論添加生物質(zhì)炭與否，D、S 和I 處理均較F 處理顯著降低了土壤Nmin 含量（S+LB 除外，P＜0.05）。在F 及I 處理條件下，添加生物質(zhì)炭對土壤Nmin 含量無顯著影響（P＞0.05）。D處理條件下，D+LC和D+HC處理較D+CK 處理顯著降低了土壤Nmin 含量（P＜0.05）。S處理條件下，S+HB較S+CK處理顯著降低了土壤Nmin 含量（P＜0.05）。在CK 和HB 處理中，S 和I處理較F和D處理顯著降低了土壤pH（P＜0.05），而在LB 處理中，各灌溉方式之間差異不顯著（P＞0.05）。在S及I 處理條件下，生物質(zhì)炭添加對土壤pH 影響不顯著。F 處理條件下，各生物質(zhì)炭處理之間差異顯著（P＜0.05），其大小順序表現(xiàn)為F+HB＞F+CK＞F+LB。D 處理條件下，D+HB 處理的土壤pH 顯著高于D+CK和D+LB處理（P＜0.05）。

圖2 灌溉方式及生物質(zhì)炭添加對土壤性質(zhì)的影響Figure 2 Effects of irrigation types and biochar amendment on soil properties

2.2 灌溉方式及生物質(zhì)炭添加對土壤硝化/反硝化功能基因豐度的影響

由雙因素方差分析結果（表3）可知，灌溉方式可影響土壤AOA-amoA、AOB-amoA、nirK和nosZ的基因豐度（P＜0.01）。生物質(zhì)炭添加量可顯著影響土壤AOB-amoA、nirK和nosZ的基因豐度（P＜0.01），但灌溉方式與生物質(zhì)炭互作僅對土壤nosZ基因豐度有顯著影響（P＜0.01）。

表3 灌溉方式及生物質(zhì)炭對土壤硝化/反硝化功能基因豐度影響的雙因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA analysis for the effects of irrigation types and biochar on the abundances of nitrification and denitrification functional genes

灌溉方式及生物質(zhì)炭對土壤硝化/反硝化功能基因豐度的影響見圖3。在CK 處理中，各灌溉方式的土壤AOA-amoA基因豐度之間均有顯著差異（除S 處理外，P＜0.05），其大小依次為I＞S＞D＞F。在LB 和HB處理中，I處理較F、D 和S處理顯著增加了土壤AOAamoA基因豐度（P＜0.05）。F、D 及S 處理條件下，添加生物質(zhì)炭均未顯著影響土壤AOA-amoA基因豐度（P＞0.05），但在I 處理條件下，添加生物質(zhì)炭較CK 處理顯著增加了土壤AOA-amoA基因豐度（P＜0.05）。無論添加生物質(zhì)炭與否，D、S、I 處理均較F 處理增加了土壤AOB-amoA基因豐度，且大小依次為I＞S＞D＞F。具體表現(xiàn)為：在CK 處理中，僅I 處理較F 處理顯著增加了土壤AOB-amoA基因豐度（P＜0.05）；在LB 處理中，S和I處理均顯著高于F處理（P＜0.05）；在HB處理中，各灌溉方式之間差異均顯著（P＜0.05）。F 和D 處理條件下，添加生物質(zhì)炭對土壤AOB-amoA基因豐度無顯著影響（P＞0.05），但在S和I處理條件下，LB處理顯著增加了土壤AOB-amoA基因豐度（P＜0.05）。在CK 和LB 處理中，各灌溉方式下土壤nirK基因豐度均無顯著差異（P＞0.05），但在HB 處理中，I 處理條件下土壤nirK基因豐度顯著高于D 和F 處理（P＜0.05）。D和F 處理條件下，添加生物質(zhì)炭對土壤nirK基因豐度無顯著影響（P＞0.05），但在S 和I 處理條件下，HB處理較CK 和LB 處理顯著增加了土壤nirK基因豐度（P＜0.05）。在CK 處理中，D、S 和I 處理均較F 處理顯著降低了土壤nosZ基因豐度（P＜0.05），但D、S 和I 處理之間無顯著差異（P＞0.05）。在LB和HB處理中，各灌溉方式的土壤nosZ基因豐度差異均顯著（P＜0.05），其大小順序分別為F＞D＞I＞S 和D＞F＞I＞S。在F、D 和I 處理條件下，添加生物質(zhì)炭顯著增加了土壤nosZ基因豐度（P＜0.05），但在S 處理條件下，與CK 相比，LB 顯著降低了土壤nosZ基因豐度（P＜0.05），但HB顯著增加了土壤nosZ基因豐度（P＜0.05）。

圖3 灌溉方式及生物質(zhì)炭添加對土壤硝化/反硝化功能基因豐度的影響Figure 3 Effects of irrigation types and biochar amendment on soil nitrification and denitrification functional genes abundances

2.3 土壤性質(zhì)與硝化/反硝化功能基因豐度的關系

由相關性分析結果（圖4）可知，土壤AOA-amoA基因豐度與土壤-N 含量、pH 呈極顯著負相關（P＜0.01），與Nmin 含量呈顯著負相關（P＜0.05），但與-N含量呈顯著正相關（P＜0.05）。土壤AOB-amoA基因豐度與土壤-N 含量、Nmin 含量及pH 呈極顯著負相關（P＜0.01），與-N 含量及AOA-amoA基因豐度呈極顯著正相關（P＜0.01）。土壤nirK基因豐度與土壤AOA-amoA基因豐度呈極顯著正相關（P＜0.01），與AOB-amoA基因豐度呈顯著正相關（P＜0.05）。土壤nosZ基因豐度與土壤-N 含量和AOB-amoA基因豐度呈顯著負相關（P＜0.05），與土壤pH呈極顯著正相關（P＜0.01）。

圖4 土壤性質(zhì)與參與土壤硝化/反硝化作用關鍵功能基因豐度的相關性Figure 4 The correlations among soil properties and the abundances of functional genes involving soil nitrification and denitrification

3 討論

3.1 灌溉方式及生物質(zhì)炭對土壤硝化功能微生物的影響

硝化反應是土壤氮循環(huán)中的重要過程，受到土壤微生物的調(diào)控。水分是影響土壤微生物活動的重要因子，而灌溉方式的改變及生物質(zhì)炭添加帶來土壤含水率及其分布的顯著變化，勢必會對土壤硝化作用產(chǎn)生影響。

本研究中，滴灌、噴灌和微噴灌等節(jié)水灌溉方式的灌水量約為常規(guī)地表漫灌的50%，因此，灌水后，滴灌、噴灌和微噴灌條件下的土壤孔隙含水率低于漫灌，因此會產(chǎn)生有利于硝化反應而抑制反硝化反應的環(huán)境，從而加速了硝化微生物對土壤-N 的消耗，產(chǎn)生更多的-N。在本研究中，AOA-amoA、AOBamoA基因豐度均與土壤-N 含量呈顯著負相關，而與土壤-N 含量呈顯著正相關（圖4），說明與常規(guī)漫灌相比，節(jié)水灌溉方式可通過促進土壤硝化微生物活動，調(diào)節(jié)土壤礦質(zhì)態(tài)氮形態(tài)之間的轉化。

與漫灌相比，滴灌可增加土壤硝化微生物AOAamoA、AOB-amoA的基因豐度（圖3），促進土壤硝化作用的進行。滴灌條件下滴頭滴水量小，水滴緩慢進入土壤，在毛管力和重力作用下分布于作物根系周圍[24]，且在此區(qū)域中硝化作用高于反硝化作用[25]，因而可增加土壤AOA-amoA、AOB-amoA的基因豐度。此外，與漫灌相比，滴灌灌水強度較低，土壤孔隙水流速較慢，土壤結構破壞程度較小，因此可降低由于灌溉而造成的土壤密實，使土壤保持相對疏松和較高的通透性[24]，有利于硝化微生物的生長。同時，疏松的土壤結構有利于作物根系活力的提高[26]，促進根系向土壤中釋放含碳、氮等物質(zhì)的分泌物，為硝化反應及反硝化反應提供底物，從而促進硝化微生物的生長及活性的提高。但在漫灌和滴灌條件下，添加生物質(zhì)炭并沒有顯著影響土壤硝化微生物的基因豐度，這可能與生物質(zhì)炭添加在一定程度上降低了土壤NO-3-N 含量有關（圖2），其內(nèi)在機制需要進一步研究。

噴灌較漫灌顯著增加了土壤硝化微生物AOAamoA、AOB-amoA的基因豐度（圖3），表明與常規(guī)漫灌相比，噴灌可促進土壤硝化反應。噴灌過程類似天然降雨，水分以微小液滴的形式均勻地降落并滲入土壤，減少了表層土壤的板結，減小了土壤緊實度，從而使土壤孔隙度和通透性均高于漫灌[27-28]，有利于提高硝化微生物的活動。微噴灌是在滴灌和噴灌的基礎上發(fā)展而來的一種新型節(jié)水灌溉方式，兼具二者的優(yōu)點，它采用微噴帶將水均勻地噴灑到田間，灌溉均勻度較高[29]，同時還可降低土壤容重[30]。在本研究中，無論添加生物質(zhì)炭與否，土壤AOA-amoA、AOBamoA的基因豐度均表現(xiàn)為微噴灌＞噴灌＞滴灌＞漫灌，表明微噴灌較其他灌溉方式更能有效促進土壤硝化作用。在噴灌和微噴灌條件下，生物質(zhì)炭對硝化微生物的促進作用較為明顯。AOB 在中性或堿性及富氮環(huán)境中占主導地位，而AOA 則在酸性及養(yǎng)分含量較低的環(huán)境中占主導地位[2]。有研究認為，當土壤氨氧化功能微生物中AOA 占主導地位時，生物質(zhì)炭會抑制土壤氨氧化作用；但當AOB 為主要功能菌群時，生物質(zhì)炭則會促進土壤氨氧化作用[31]。本研究土壤偏堿性（表1），AOB 占主導地位，生物質(zhì)炭添加可促進土壤氨氧化作用。王曉輝等[15]的研究表明，生物質(zhì)炭的孔隙結構及水肥吸附能力，可為好氧的AOB 和AOA 提供良好的棲息環(huán)境，故而促進其生長繁殖。噴灌及微噴灌條件下，添加生物質(zhì)炭可進一步改善土壤結構，增加土壤通氣性，有效促進氨氧化微生物的生長?；茏责B(yǎng)型的氨氧化微生物AOA-amoA、AOB-amoA的基因豐度、組成及結構受土壤氮有效性的影響[32-33]。-N 是氨氧化過程的底物，其含量大小可直接影響氨氧化微生物的活動。但在本研究中，各灌溉方式下，生物質(zhì)炭均在一定程度上降低了-N 含量（圖2），這也說明生物質(zhì)炭促進了氨氧化作用的進行，使土壤-N 向-N 轉化，這與蔡久茂等[19]的研究結果一致。

3.2 灌溉方式及生物質(zhì)炭對土壤反硝化功能微生物的影響

與漫灌相比，滴灌、噴灌及微噴灌等節(jié)水灌溉方式下，土壤水分含量較低，不利于厭氧的反硝化微生物生長。在本研究中，與漫灌相比，無論添加生物質(zhì)炭與否，滴灌、噴灌、微噴灌均降低了土壤nosZ基因豐度，即抑制了土壤N2O向N2的轉化。然而，滴灌、噴灌、微噴灌條件下，反硝化反應被抑制，土壤硝酸鹽向亞硝酸鹽、NO 及N2O 轉化降低，因而，節(jié)水灌溉條件未必會造成N2O 排放增加。但在20 t·hm-2生物質(zhì)炭處理中，滴灌卻較漫灌顯著增加了nosZ基因豐度，這可能是由于高量生物質(zhì)炭可作為電子穿梭體，促進土壤中電子向反硝化微生物轉移[34-35]，從而增加了nosZ基因的豐度和活性，促進了N2O 向N2的轉化[36]。在各灌溉方式下，與不添加生物質(zhì)炭處理相比，生物質(zhì)炭（尤其是高量生物質(zhì)炭添加）增加了土壤nosZ基因豐度（S+LB 處理除外），這可能與生物質(zhì)炭為微生物生長提供了碳源有關。Xiao 等[11]通過Meta 分析研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭添加增加了narG、nirS、nirK和nosZ的基因豐度，且作物殘體（如秸稈）等原料制備的生物質(zhì)炭對反硝化基因的促進作用更明顯，尤其是nirK和nosZ基因，且認為這是由于這類生物質(zhì)炭中溶解性有機碳的含量比木材等制備的生物質(zhì)炭高，這些可利用性有機碳驅(qū)動了土壤微生物中碳和氮的周轉，進而刺激微生物的生長，促進反硝化微生物活性的提高。本研究采用的生物質(zhì)炭原料為花生殼，將其添加到土壤中可能會提高土壤可溶性有機碳含量[37]，進而促進土壤反硝化微生物的生長。此外，pH 是影響土壤微生物活動的關鍵因子[38]，在漫灌和滴灌條件下，高量生物質(zhì)炭添加增加了土壤pH，促進了nosZ基因豐度的增加。生物質(zhì)炭的石灰效應可為土壤微生物生長提供適宜的環(huán)境，進而提高反硝化功能微生物的豐度[39]。

微噴灌提高了灌溉水在土壤中的分布均勻系數(shù)，創(chuàng)造了均衡適宜的土壤水分條件，這不僅有利于硝化作用的進行，同時，由于反硝化過程由兼性厭氧細菌主導，微噴灌還可在一定程度上促進反硝化反應。微噴灌條件下20 t·hm-2生物質(zhì)炭處理的nirK基因豐度顯著高于其他灌溉方式，這可能是由于在高量生物質(zhì)炭添加條件下，微噴灌的土壤-N 含量顯著高于其他灌溉方式（圖2），這與黨建友等[40]的研究結果一致。在好氧條件下，氧氣含量是反硝化作用的主要限制因素，但在厭氧條件下-N 含量則是反硝化作用的限制因素[41]。土壤-N 的增加為反硝化反應提供了底物，可促進反硝化作用，而nirK基因編碼的亞硝酸還原酶是反硝化反應的限速酶，因此，微噴灌較其他灌溉方式可顯著提高土壤nirK基因豐度。且微噴灌條件下，生物質(zhì)炭添加顯著增加了土壤NO-3-N含量，進而提高了nirK基因豐度，進一步促進了反硝化作用。

4 結論

（1）與常規(guī)地表漫灌相比，滴灌、噴灌、微噴灌均在不同程度上增加了硝化微生物AOA-amoA、AOBamoA的基因豐度，促進了土壤硝化作用，即降低了土壤NH+4-N 含量，促使其向NO-3-N 轉化，但降低了反硝化微生物nosZ基因豐度，抑制了N2O向N2的轉化。

（2）生物質(zhì)炭添加可在一定程度上增加AOAamoA、AOB-amoA的基因豐度，這可能與其增加土壤通氣性有關。高量生物質(zhì)炭添加（20 t·hm-2）可提高反硝化微生物nirK和nosZ的基因豐度，這可能與其溶解性有機碳增加及石灰效應等有關。

（3）節(jié)水灌溉方式與生物質(zhì)炭互作可促進土壤硝化作用，并通過影響反硝化微生物活動調(diào)節(jié)土壤反硝化作用。微噴灌條件下，添加20 t·hm-2生物質(zhì)炭可有效促進土壤-N 向-N 轉化，以供植物吸收利用，同時還可降低土壤硝化過程中N2O的損失風險。