稻田土壤可溶性有機(jī)碳熒光組分對(duì)砷甲基化的影響

李令儀，張楠，張洋，吳翠霞，曾希柏，蘇世鳴

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)農(nóng)村生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

砷（As）是一種廣泛存在于環(huán)境中的有毒類金屬元素，通常以無(wú)機(jī)態(tài)砷包括砷酸鹽[As（Ⅴ）]、亞砷酸鹽[As（Ⅲ）]和有機(jī)態(tài)砷如一甲基砷（MMAs）、二甲基砷（DMAs）和三甲基砷（TMAsO）等形式存在[1]。不同形態(tài)砷的毒性差異較大，一般認(rèn)為無(wú)機(jī)砷的毒性遠(yuǎn)高于有機(jī)砷，其中As（Ⅲ）毒性約是As（Ⅴ）的25～60倍，約是有機(jī)砷的70 倍[2]。稻田淹水后As（Ⅴ）易還原為As（Ⅲ），從而增加了砷的移動(dòng)性與活性[3]，而水稻根系可分別通過(guò)磷酸鹽和硅酸鹽的通道蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)As（Ⅴ）和As（Ⅲ）的吸收，進(jìn)而造成水稻對(duì)砷的累積[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，與其他類型作物如葉類蔬菜、玉米等的可食部位砷累積狀況相比，稻米中砷含量高出10～22 倍[5]。稻米是我國(guó)特別是南方地區(qū)居民飲食的主要作物，也是人體通過(guò)食物鏈攝入砷的主要來(lái)源[6-7]。

水稻直穗病是水稻穎殼畸形病變?cè)斐蔁o(wú)法成功灌漿，表形為稻穗直立，可造成水稻減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)[8-9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，水稻籽粒穎殼中積累較多的DMAs 是導(dǎo)致直穗病發(fā)生的主要原因[9]。然而水稻植株本身不會(huì)合成有機(jī)砷，其主要是通過(guò)根系吸收土壤中的DMAs，DMAs 在根系中具有較高的向上轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而導(dǎo)致水稻穎殼和籽粒中DMAs 過(guò)量積累[10]。研究表明，土壤微生物通過(guò)胞內(nèi)arsM基因編碼的S-腺苷甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SAM）使As（Ⅲ）發(fā)生甲基轉(zhuǎn)化，主要依次產(chǎn)生MMAs、DMAs和TMAsO[2，11]。稻田土壤中影響砷甲基化的因素有很多，例如底物As（Ⅲ）濃度水平[12]、arsM功能微生物活性[11]、水分狀況[13]、溫度[12]以及有機(jī)質(zhì)含量狀況[14]等。砷超標(biāo)稻田施用有機(jī)物料不僅易造成孔隙水As（Ⅲ）濃度增加，還易增加砷甲基轉(zhuǎn)化效率和水稻籽粒累積As（Ⅲ）和DMAs的風(fēng)險(xiǎn)[15]。不同類型及不同投入量的有機(jī)物料對(duì)砷甲基化過(guò)程的促進(jìn)作用存在明顯差異[16-17]，這可能是由于有機(jī)物料分解后的有機(jī)碳分子組成、性質(zhì)和含量存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致其介導(dǎo)砷甲基轉(zhuǎn)化過(guò)程差別化。Yan 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，稻田土壤中砷甲基化效率隨著可溶性有機(jī)物中烷基碳、羧基碳等活性碳官能團(tuán)豐度的增加而顯著提高。田翔等[19]發(fā)現(xiàn)秸稈和牛糞的分解產(chǎn)物的芳香性、疏水性和腐殖化水平存在明顯差異，芳香性較高的有機(jī)質(zhì)會(huì)絡(luò)合甲基汞，降低其植物可利用性。Lei 等[20]的研究表明藻類分解過(guò)程中芳香性低的富氧富氮小分子碳，如芳香蛋白類有機(jī)物，提高了攜帶有汞甲基化基因的微生物豐度，從而提高了湖泊中的汞甲基化效率。目前稻田土壤中可溶性有機(jī)碳組成特征與甲基砷產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)性仍未明確，該工作對(duì)于探索稻田砷甲基化過(guò)程的可能影響因素及服務(wù)于今后水稻直穗病的發(fā)生預(yù)警均具有重要意義。

三維熒光光譜（3DEEM）技術(shù)在有機(jī)質(zhì)成分表征方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，熒光區(qū)域積分（FRI）法是常用的解譜方法，可對(duì)復(fù)雜體系中的熒光組分進(jìn)行識(shí)別，并通過(guò)積分獲得其相對(duì)濃度[21]。本實(shí)驗(yàn)選取砷污染水稻土壤為研究對(duì)象，通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)模擬開(kāi)展相關(guān)工作，一是分析稻田孔隙水培養(yǎng)前后有機(jī)砷含量及總有機(jī)碳（TOC）變化，二是利用三維熒光光譜技術(shù)表征培養(yǎng)后溶液中有機(jī)碳分子熒光組分特征，并嘗試探索其與甲基態(tài)砷的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 供試材料及其理化性質(zhì)

供試土壤采自浙江省紹興市上虞地區(qū)（29°59′N，120°47′ E）砷污染水稻土壤，母質(zhì)類型為粗松咸砂土。土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干后混合均勻，去除植物殘根和石礫，用瑪瑙研缽研磨后過(guò)2 mm 和0.25 mm 尼龍篩備用。供試土壤總砷含量為96.7 mg·kg-1，全鐵含量為19.7 g·kg-1，全錳含量為435.0 mg·kg-1，總氮含量為2.2 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量為33.6 g·kg-1，陽(yáng)離子交換量為43.2 cmol·kg-1，pH值為5.8。

水稻秸稈和豬糞取自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院岳陽(yáng)農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，實(shí)驗(yàn)前水稻秸稈切碎研磨成粉末，豬糞自然風(fēng)干研磨后過(guò)20 目（0.850 mm）篩備用。秸稈和豬糞在施用前均利用γ 射線物理滅菌，避免帶入生物污染。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為模擬稻田土壤不同類型和不同添加量的有機(jī)物料還田營(yíng)造的復(fù)雜有機(jī)碳環(huán)境，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了2 種有機(jī)物料處理和3 種投入量水平。為研究培養(yǎng)過(guò)程中土壤溶液甲基砷含量變化與有機(jī)碳熒光組分特征變化之間的可能關(guān)聯(lián)，減少土壤膠體本身對(duì)溶液中有機(jī)碳分子的可能補(bǔ)給與固定的影響，實(shí)驗(yàn)以土壤浸提液培養(yǎng)的方式開(kāi)展。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：將滅菌后的秸稈粉末和豬糞粉末與30 g供試土壤充分混合，秸稈施用量分別為0.375、0.750 g 和1.500 g（分別標(biāo)記為RS、2RS和3RS），豬糞施用量分別為0.470、0.940 g 和1.880 g（分別標(biāo)記為PM、2PM 和3PM），有機(jī)物料施用量按TOC 添加量分別為土壤質(zhì)量的0.5%、1.0%和1.5%計(jì)算得到，以不添加任何有機(jī)物料的供試土壤作為對(duì)照（CK），各處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。將各處理土壤放進(jìn)100 mL 離心管，在30 ℃的黑暗環(huán)境中進(jìn)行恒溫淹水培養(yǎng)，保持土面以上2 cm 的靜水層，每日通過(guò)稱質(zhì)量補(bǔ)充水分，保持水分不變。土壤培養(yǎng)7 d 以后，以4 000 r·min-1離心20 min，靜置后提取25 mL 上清液，轉(zhuǎn)移到血清培養(yǎng)瓶中，在液面以上充氮?dú)? min，趕走上層空氣，營(yíng)造相對(duì)厭氧環(huán)境，并于30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h 和5 d 時(shí)分別收集溶液樣品，用于砷形態(tài)、TOC含量測(cè)定，考慮工作量原因，將培養(yǎng)5 d后的各添加量水平的3 個(gè)重復(fù)樣品混合均勻后用于三維熒光光譜分析。

1.3 樣品分析與測(cè)定

砷形態(tài)分析：溶液樣品過(guò)0.22 μm 濾膜后，取1 mL 待測(cè)液添加200 μL H2O2（30%）氧化樣品15 min，使用高效液相電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（HPLCICP-MS，Agilent 7900，美國(guó)）測(cè)定各砷形態(tài)的濃度。為提高砷形態(tài)分析質(zhì)量，測(cè)樣時(shí)每間隔10 個(gè)樣品檢測(cè)一次As（Ⅲ）單標(biāo)溶液（GBW08666，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院），本實(shí)驗(yàn)中各批次單標(biāo)溶液回收率達(dá)97%。

TOC 測(cè)定：溶液樣品過(guò)0.22 μm 濾膜后，采用同步TOC/N 分析儀（Multi C/N 2100 S，Jena Analytik Jena，Jena，德國(guó)）測(cè)定樣品中的TOC。

三維熒光光譜測(cè)定：溶液樣品過(guò)0.45 μm 濾膜后，使用穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀（FLS1000，英國(guó)愛(ài)丁堡公司）掃描三維熒光光譜。以去離子水為空白，激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）范圍為200～450 nm，增量為5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）范圍為250～600 nm，掃描信號(hào)積分時(shí)間為3 s，光源為150 W 氙弧燈。采用熒光區(qū)域積分法[21]對(duì)溶液中的成分進(jìn)行半定量分析，5 個(gè)積分區(qū)域分別為芳香蛋白類Ⅰ（APⅠ，Ex 為220～250 nm，Em 為280～330 nm）、芳香蛋白類Ⅱ（APⅡ，Ex 為220～250 nm，Em 為330～380 nm）、富里酸類物質(zhì)（FA，Ex 為220～250 nm，Em 為380～550 nm）、可溶性微生物副產(chǎn)物（SMP，Ex為250～340 nm，Em 為280～380 nm）和腐植酸類物質(zhì)（HA，Ex 為250～280 nm，Em 為280～550 nm）。其他熒光光譜的特征參數(shù)計(jì)算方法見(jiàn)表1。

表1 特征參數(shù)計(jì)算方法Table 1 Description of commonly used characteristic parameters of fluorescence spectra

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 2021 進(jìn)行繪圖和PCA 分析，將原始三維熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化矯正并扣除空白后用Matlab 2016a軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行熒光區(qū)域積分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤溶液甲基砷含量變化

土壤溶液厭氧培養(yǎng)4 h 和5 d 時(shí)相比較（圖1A），2RS、PM 和3PM 處理總砷（無(wú)機(jī)砷和甲基砷）濃度無(wú)顯著差異（P＞0.05），而CK、RS、3RS 及2PM 處理培養(yǎng)5 d 后總砷濃度相比4 h 時(shí)分別顯著增加20.8%、26.2%、23.3%和5.4%。添加有機(jī)物料處理的土壤溶液中具有相對(duì)更高的甲基砷濃度，但不同類型有機(jī)物料處理后土壤溶液砷甲基化過(guò)程的激發(fā)作用不同，添加秸稈粉末后土壤溶液的甲基砷濃度增幅明顯高于添加豬糞處理。CK 處理培養(yǎng)5 d 后溶液中甲基砷濃度比培養(yǎng)4 h 時(shí)僅增加了7.1μg·L-1；秸稈處理下，培養(yǎng)5 d 后RS、2RS、3RS 處理甲基砷濃度分別增加了13.7、9.6 μg·L-1和13.3 μg·L-1，增幅分別為40.3%、24.2%和24.0%；豬糞處理3 種添加量水平下溶液甲基砷增加量要明顯低于秸稈處理，培養(yǎng)5 d 后PM、2PM、3PM 處理甲基砷濃度分別增加了4.3、2.0μg·L-1和1.3μg·L-1，增幅分別為15.5%、6.9%和3.8%。

圖1 不同有機(jī)物料處理及不同添加量水平下土壤溶液中各砷形態(tài)濃度Figure 1 Concentrations of arsenic in soil solution with addition of different types and does of organic materials

進(jìn)一步分析各甲基態(tài)砷濃度變化發(fā)現(xiàn)，DMAs 濃度在各處理的甲基砷形態(tài)中比例最高，其在各處理培養(yǎng)前后占比達(dá)到64.4%～78.4%（圖1B）。各處理土壤溶液厭氧培養(yǎng)4 h 和5 d 時(shí)比較：CK 處理DMAs 濃度僅增加了5.0 μg·L-1，增幅為44.0%；秸稈處理下，培養(yǎng)5 d 后PM、2RS、3RS 處理DMAs 濃度分別增加了11.2、7.4 μg·L-1和13.2 μg·L-1，增幅分別為43.4%、26.6% 和37.0%；豬糞處理下PM、2RM、3RM 處理DMAs 濃度分別增加了2.3、3.2 μg·L-1和3.2 μg·L-1，增幅分別為11.9%、16.0%和12.6%。

2.2 土壤溶液TOC濃度及其與甲基砷的相關(guān)性

添加有機(jī)物料顯著提高土壤溶液中TOC 濃度（圖2A）。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)（4 h），CK處理土壤溶液TOC濃度為244.3 mg·L-1，而秸稈或豬糞處理TOC 濃度均高于CK處理，且隨著有機(jī)物料添加量增加而明顯提高。RS、2RS、3RS 處理土壤溶液中TOC 濃度分別為306.2、386.1 mg·L-1和538.0 mg·L-1，PM、2PM、3PM 處理土壤溶液中TOC 濃度分別為339.2、443.8 mg·L-1和588.5 mg·L-1，秸稈處理土壤溶液中TOC 濃度明顯高于豬糞處理。培養(yǎng)5 d 后，各處理溶液中TOC 濃度明顯降低，其中秸稈處理土壤溶液中TOC 消耗量明顯高于豬糞處理。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，各處理TOC 消耗量（ΔTOC）與甲基砷增加量（Δ 甲基砷）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，圖2B）。

圖2 土壤溶液TOC濃度變化及其與甲基砷變化量的相關(guān)性Figure 2 Concentration of TOC in soil solution and the correlation between the consumed TOC（ΔTOC）and methylated As（ΔMethylated As）

2.3 土壤溶液TOC熒光光譜特征

為解析各處理土壤溶液中可溶性碳分子的組分性質(zhì)差異，本文進(jìn)一步基于熒光指數(shù)（FI）、自生源指數(shù)（BIX）和腐殖化指數(shù)（HIX）開(kāi)展分析。已有研究表明：FI＞1.9，主要為微生物活動(dòng)所產(chǎn)生的內(nèi)源可溶性有機(jī)質(zhì)（DOM），自生源特征明顯；FI＜1.4，主要為以陸源輸入的外源性DOM，自身生產(chǎn)力和微生物活動(dòng)等貢獻(xiàn)相對(duì)較低[21，25]。如圖3A所示，所有處理的土壤溶液在厭氧培養(yǎng)5 d后FI值均在1.4～1.9之間，說(shuō)明溶解性有機(jī)碳的來(lái)源既包括陸源輸入又包括自生源。CK處理的FI值為1.60，秸稈處理3 個(gè)添加量水平下的FI值分別為1.64（RS）、1.75（2RS）和1.72（3RS），說(shuō)明添加秸稈處理的土壤溶液中自生源有機(jī)碳的成分較多，且2RS 處理的FI 值最高，表明其微生物的生命活動(dòng)最為活躍。而豬糞處理3 個(gè)添加量水平下的FI 值分別為1.58（PM）、1.52（2PM）和1.55（3PM），均低于CK處理，說(shuō)明在豬糞處理的土壤溶液有機(jī)碳中微生物活動(dòng)的貢獻(xiàn)相對(duì)較低，且隨著豬糞添加量的增加，自生源成分反而減少。此外，BIX 指數(shù)越高，自生源特征越明顯，蛋白組分的貢獻(xiàn)越大，生物可利用性越高[26]。本研究中，CK 處理的BIX 指數(shù)為0.43（圖3B），秸稈處理3 個(gè)添加量水平下的BIX 值分別為0.45（RS）、0.54（2RS）和0.45（3RS），豬糞處理3 個(gè)添加量水平下的BIX 值分別為0.40（PM）、0.37（2PM）和0.35（3PM），表明在本實(shí)驗(yàn)條件下，秸稈分解產(chǎn)生的生物可利用成分多于豬糞。HIX 指數(shù)用來(lái)指示有機(jī)碳的腐殖化程度，指數(shù)越高，腐殖化程度越高，生物可利用性越低[27]。CK 處理土壤溶液厭氧培養(yǎng)5 d 后HIX 值為17.89（圖3C），秸稈處理3 個(gè)添加量水平下土壤溶液HIX 值分別為15.03（RS）、9.54（2RS）和13.10（3RS），均明顯低于CK 處理。比較來(lái)看，2RS 處理中土壤溶液的腐殖化程度最低，表明添加適量秸稈會(huì)降低土壤溶液中有機(jī)碳的腐殖化程度，有利于微生物分解利用。而添加豬糞則會(huì)明顯提高土壤溶液中有機(jī)碳的腐殖化水平，其不同添加量水平下的HIX 值分別為26.83（PM）、28.68（2PM）和28.31（3PM）。

圖3 土壤溶液TOC熒光特征指數(shù)Figure 3 Characteristic parameters of fluorescence spectra of TOC in soil solution

2.4 土壤溶液TOC 三維熒光組分及其與甲基砷的相關(guān)性

通過(guò)熒光區(qū)域積分計(jì)算分析了培養(yǎng)5 d后不同處理及添加量的土壤溶液三維熒光組分積分標(biāo)準(zhǔn)體積（圖4A），發(fā)現(xiàn)各處理土壤溶液TOC 的主要熒光組分為HA、SMP和FA，而APⅠ和APⅡ兩類有機(jī)物占比較小。秸稈處理的土壤溶液中可檢測(cè)到的熒光組分總強(qiáng)度均明顯高于CK 和豬糞處理，且隨秸稈添加量增加，熒光組分總強(qiáng)度增大；豬糞處理的土壤溶液中熒光組分總強(qiáng)度與CK 處理相比差異較小，其中2PM 處理的熒光組分總強(qiáng)度低于CK處理。各處理中含量最高的TOC 組分為HA，占比達(dá)82.2%～89.5%，且豬糞處理的HA 占比明顯高于秸稈處理。各處理中SMP、FA、AP Ⅰ和AP Ⅱ占比分別為9.3%～15.1%、2.1%～2.8%、0～0.1%和0.1%～0.2%。秸稈處理3種添加量下的SMP、APⅠ和APⅡ組分熒光積分分別為1.2×106～1.8×106、4.0×103～6.9×103AU-nm2和1.5×104～2.3×104AU-nm2，均分別高于豬糞處理的5.7×105～8.4×105、1.5×103～2.9×103AU-nm2和4.6×103～8.3×103AU-nm2。

圖4 5種有機(jī)組分熒光區(qū)域積分及不同處理土壤溶液有機(jī)組分主成分分析Figure 4 Five organic carbon components identified by fluorescence regional integration（FRI）method and the principal component analysis of organic carbon components among different treatments

為進(jìn)一步分析土壤溶液中TOC 不同熒光組分對(duì)處理的響應(yīng)程度，采用主成分分析法將各處理間TOC組分差異性進(jìn)行可視化（圖4B）。第1、2 主成分方差貢獻(xiàn)率分別為86.0%、12.6%，對(duì)實(shí)驗(yàn)變量的總解釋度達(dá)到98.6%。秸稈和豬糞處理后土壤溶液TOC 在組分上存在明顯差異，且在相同處理不同添加量下亦存在一定差異，但這種差異小于有機(jī)物料類別之間的差異。進(jìn)一步將土壤溶液中熒光光譜特征參數(shù)、熒光組分區(qū)域積分結(jié)果和土壤溶液中甲基砷濃度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)FI 指數(shù)、APⅡ、FA、HA 區(qū)域積分與甲基砷濃度顯著正相關(guān)（P＜0.05），而HIX 指數(shù)與甲基砷含量為負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖5）。

圖5 熒光光譜特征參數(shù)及熒光組分區(qū)域積分結(jié)果和土壤溶液中甲基砷的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis of spectral characteristic parameters，organic carbon components and the methylated As in soil solution

3 討論

本研究選擇秸稈和豬糞作為植物源和動(dòng)物源有機(jī)物料，將其施入稻田土壤淹水培養(yǎng)后，提取其土壤溶液開(kāi)展培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2RS、PM、3PM 處理培養(yǎng)4 h和5 d時(shí)的溶液總砷濃度無(wú)顯著差異，但在CK、RS、3RS 及2PM 處理中有顯著增加。這可能是由于土壤溶液中混有的少量土壤顆粒溶解釋放砷所致，因土壤膠體固定的砷形態(tài)主要以無(wú)機(jī)砷為主[15]，故該現(xiàn)象并不影響對(duì)土壤溶液中砷甲基化的研究。研究發(fā)現(xiàn)在淹水土壤中施入兩種有機(jī)物料后土壤溶液中甲基砷與TOC 濃度均顯著提高，兩者均表現(xiàn)出隨物料添加量增加而增加的趨勢(shì)，且厭氧培養(yǎng)前后的TOC消耗量與甲基砷增加量顯著正相關(guān)。該結(jié)果表明溶解性有機(jī)碳作為厭氧環(huán)境下砷甲基化微生物的有效碳源，很可能與甲基砷的產(chǎn)生存在關(guān)聯(lián)。該結(jié)果與Yan等[18]報(bào)道的結(jié)果一致，即添加有機(jī)物料源DOM 可以顯著提高稻田土壤中砷的甲基化效率，其主要是通過(guò)增加砷甲基化底物濃度及arsM功能微生物豐度的方式實(shí)現(xiàn)。Afroz 等[28]亦發(fā)現(xiàn)稻田土壤中施用豬糞可以顯著提高土壤孔隙水中甲基態(tài)砷濃度，同時(shí)增加水稻地上部對(duì)甲基砷的吸收。本研究?jī)煞N有機(jī)物料比較來(lái)看，厭氧培養(yǎng)后秸稈處理土壤溶液中消耗的TOC明顯高于豬糞處理，這可能與不同來(lái)源有機(jī)物料發(fā)酵產(chǎn)生的可溶性有機(jī)碳分子的微生物利用度存在差異有關(guān)。羅雪婷等[29]研究發(fā)現(xiàn)，秸稈分解后的有機(jī)碳的主要類型為多糖類、蛋白質(zhì)類、芳香類和氨基酸類；田翔等[19]的研究表明牛糞等動(dòng)物源有機(jī)質(zhì)芳香性和腐殖化程度明顯高于秸稈源有機(jī)質(zhì)。一般認(rèn)為，芳香性和腐殖化程度高的有機(jī)碳分子相對(duì)較難被微生物利用，相反低腐殖化程度的有機(jī)碳分子更易被微生物同化[23]。研究還發(fā)現(xiàn)，厭氧培養(yǎng)末期，和豬糞處理相比，秸稈處理土壤溶液中有機(jī)碳自生源特征明顯，蛋白類等生物可利用性組分含量多，腐殖化程度低。通過(guò)參考前人研究進(jìn)行推測(cè)，該結(jié)果可能是本實(shí)驗(yàn)中秸稈處理通過(guò)提供相對(duì)更高的低腐殖化程度的有機(jī)碳分子，促進(jìn)了微生物的同化作用，從而產(chǎn)生了相對(duì)更高的自生源有機(jī)碳組分，該過(guò)程中很可能激發(fā)了砷甲基化功能微生物的活性，從而產(chǎn)生了相對(duì)更高的甲基態(tài)砷[30]，該推測(cè)還需開(kāi)展進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究利用三維熒光技術(shù)表征了不同處理土壤溶液中有機(jī)碳分子的熒光組分，發(fā)現(xiàn)熒光區(qū)域積分結(jié)果與熒光特征指數(shù)規(guī)律有很好的印證關(guān)系。各處理中相對(duì)含量最高的熒光組分均為HA，且豬糞處理的HA占比高于秸稈處理，這與HIX指數(shù)的結(jié)果一致，豬糞分解產(chǎn)生的有機(jī)碳腐殖化程度高于秸稈分解產(chǎn)生的有機(jī)碳。SMP主要是微生物代謝活動(dòng)產(chǎn)生的物質(zhì)，對(duì)自生源有機(jī)碳貢獻(xiàn)較大[21]，其在本實(shí)驗(yàn)秸稈處理中占比明顯高于豬糞處理，這亦與BIX 指數(shù)結(jié)果一致。比較來(lái)看，豬糞處理土壤溶液中HA 和FA 兩種有機(jī)物在總熒光物質(zhì)中占比高于秸稈處理，而秸稈處理土壤溶液中APⅠ、APⅡ和SMP 3 種有機(jī)組分的相對(duì)濃度高于豬糞處理。這可能是因?yàn)樨i糞是機(jī)體系統(tǒng)消化分解的產(chǎn)物，易分解的蛋白類組分已經(jīng)被消耗，能提供的生物可利用性有機(jī)碳含量相對(duì)較低[31]。本研究中，2PM處理的熒光組分總強(qiáng)度低于CK處理，這可能是因?yàn)楦郴潭仍黾?，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定的大分子有機(jī)物趨于生成，并被土壤顆粒吸附沉淀，從而導(dǎo)致沒(méi)有被熒光檢測(cè)到，這也可以在一定程度上解釋豬糞添加量越高，自生源成分相對(duì)越少的現(xiàn)象。豬糞添加量越高，土壤溶液中有機(jī)碳腐殖化程度越高，越不利于微生物分解利用，所以產(chǎn)生的微生物副產(chǎn)物等自生源成分越低[27]。

添加秸稈和豬糞對(duì)砷甲基化過(guò)程的促進(jìn)作用存在差異，這可能是由于有機(jī)物料分解后產(chǎn)生的溶解性有機(jī)碳組成和性質(zhì)存在差異。這也在汞甲基化過(guò)程中被證實(shí)，Graham等[32]認(rèn)為來(lái)自陸地生態(tài)系統(tǒng)的有機(jī)物對(duì)汞甲基化的促進(jìn)作用高于來(lái)自水生生態(tài)系統(tǒng)的有機(jī)物。Lei等[20，33]研究發(fā)現(xiàn)，APⅠ、APⅡ和SMP這類芳香性和腐殖化程度低的小分子不穩(wěn)定碳可作為微生物甲基化的激發(fā)劑，促進(jìn)環(huán)境中更多甲基汞的生成。本研究中亦發(fā)現(xiàn)秸稈處理的SMP、APⅠ和APⅡ組分均明顯高于豬糞處理，這3 類物質(zhì)很可能是激發(fā)砷甲基化效率的有效物質(zhì)成分。研究還發(fā)現(xiàn)FI 指數(shù)及APⅡ、FA、HA 區(qū)域積分均與甲基砷濃度顯著正相關(guān)，而HIX指數(shù)與甲基砷濃度為負(fù)相關(guān)關(guān)系。該結(jié)果在一定程度上說(shuō)明，有機(jī)碳腐殖化程度高的環(huán)境中，甲基砷含量低，這可能因?yàn)楦郴潭雀叩挠袡C(jī)碳分子比較穩(wěn)定，特別是在厭氧培養(yǎng)環(huán)境下不易被微生物代謝利用[27]。此外，不同組分的有機(jī)碳分子還可能通過(guò)差異性促進(jìn)培養(yǎng)環(huán)境中砷的解吸與釋放，改變砷甲基化底物濃度的方式影響砷甲基化進(jìn)程[34]。例如豬糞分解產(chǎn)生的有機(jī)碳腐殖化程度較高，HA和FA相對(duì)含量較高，富含的羥基、羧基等官能團(tuán)易與無(wú)機(jī)砷形成絡(luò)合物，一定程度上可能會(huì)降低砷甲基化作用的底物濃度[35]。本研究并未發(fā)現(xiàn)SMP、APⅠ與甲基砷濃度呈顯著正相關(guān)，且APⅠ和APⅡ組分相對(duì)濃度均較低，這很可能與本文只檢測(cè)了培養(yǎng)5 d后的結(jié)果有關(guān)，其間這些組分被微生物同化利用。此外，本研究還嘗試探索了不同熒光組分物質(zhì)比值（各組分占總熒光組分的百分比）與砷甲基化的可能關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)兩者間并沒(méi)有顯著相關(guān)，綜合上述結(jié)果，熒光組分APⅡ、FA 和HA 很可能是影響砷甲基化的主要因素。另外，本研究工作還存在一定的局限性，本文僅對(duì)不同有機(jī)碳熒光組分與甲基砷濃度的關(guān)系進(jìn)行了初步探索，今后還需開(kāi)展驗(yàn)證試驗(yàn)以期明確影響砷甲基化的具體熒光物質(zhì)組分，對(duì)于不同有機(jī)碳分子組分介導(dǎo)砷甲基化變化的相關(guān)微生物過(guò)程與機(jī)制也將進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

（1）秸稈與豬糞處理及不同添加量水平顯著影響土壤溶液中甲基砷的生成及總有機(jī)碳（TOC）濃度水平，厭氧培養(yǎng)前后TOC 消耗量與甲基砷增加量顯著正相關(guān)。

（2）秸稈與豬糞處理后土壤溶液中有機(jī)碳組成和性質(zhì)存在明顯差異，秸稈源有機(jī)碳的腐殖化程度低，生物可利用性相對(duì)更高，可溶性微生物副產(chǎn)物（SMP）、芳香蛋白類Ⅰ（APⅠ）和芳香蛋白類Ⅱ（APⅡ）物質(zhì)占比更高。

（3）熒光指數(shù)及APⅡ、FA、HA 區(qū)域積分均與甲基砷濃度呈顯著正相關(guān)，而腐殖化指數(shù)與甲基砷濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。