單核銦配合物的合成和抗腫瘤活性研究

蓋爽爽,藍(lán)峻峰,甘慶藍(lán),蔣才云

(廣西科技師范學(xué)院 食品與生化工程學(xué)院,廣西 來賓 545004)

癌癥嚴(yán)重危害著人類的生命安全。化療是最常用的治療方案之一,50%以上的化療方案都包含鉑類藥物如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑等,然而鉑類藥物因耐藥性和對腎臟等臟器的毒副作用而導(dǎo)致治療失敗[1-2]。因此,越來越多的研究開發(fā)其他金屬配合物用以治療惡性腫瘤。

銦配合物(Indium complexes)在臨床中有許多種應(yīng)用,比如作為診斷試劑,但尚未有用作化療藥物[3]。然而,在之前的報(bào)道顯示銦配合物具有良好的抗腫瘤活性[4-6]。有趣的是,銦配合物與轉(zhuǎn)鐵蛋白具有良好的親和力,而更易被腫瘤細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞表面比正常細(xì)胞表達(dá)更多的轉(zhuǎn)鐵蛋白)攝取,繼而產(chǎn)生更高的抗腫瘤活性[3]。縮氨基硫脲是具有多種生物活性,如抗菌、抗病毒和抗腫瘤等。同時(shí),縮氨基硫脲由于其結(jié)構(gòu)含有N,N,S-供體,因而是一類優(yōu)秀的金屬螯合劑[7-8]?？s氨基硫脲金屬配合物作為潛在的抗癌藥物已被廣泛研究[8-9]。因此,本文擬以縮氨基硫脲為配體合成銦配合物,研究其體外的抗腫瘤活性,并初步探索其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker APEX-II CCD單晶衍射儀,Perkin-Elmer240Q元素分析儀。三氯化銦四水合物、硫代氨基脲和2-噻唑甲醛購自北京伊諾凱試劑公司,甲醇等常用溶劑購自西隴化工廠。

1.2 銦配合物的合成

稱取硫代氨基脲(4.6 mg,0.05 mmol)、2-噻唑甲醛(5.7 mg,0.05 mmol)和三氯化銦四水合物 (14.7 mg,0.05 mmol)加入20 mL甲醇于65 ℃回流5 h后,過濾至燒杯內(nèi),在室溫條件下?lián)]發(fā),7 d在燒杯底部得到淡黃色晶體,圖1為銦配合物的合成路線。配合物1:產(chǎn)率75.8%;元素分析(%):C5H7Cl2InN4OS2:理論值:C,15.44;H,1.81;N,14.40;O,4.11;實(shí)測值:C,15.48;H,1.78;N,14.31;O,4.15。CCDC號:2171366。

圖1 銦配合物(配合物1)的合成路線

1.3 X-射線單晶衍射分析

應(yīng)用X-射線單晶衍射技術(shù)檢測銦配合物的結(jié)構(gòu)。挑選一顆晶體,在Bruker APEX-II CCD 單晶衍射儀于296.15 K的溫度下收集晶體數(shù)據(jù)。將收集的數(shù)據(jù)應(yīng)用Olex 2 軟件解析結(jié)構(gòu)。晶體數(shù)據(jù)見表1和部分鍵長、鍵角見表2。

表1 配合物1的晶體數(shù)據(jù)

表2 配合物1部分鍵長(?)和鍵角(°)

1.4 細(xì)胞毒性測試

在96孔板內(nèi)加入180 μL含1×104個細(xì)胞的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)6 h至細(xì)胞貼壁。加入20 μL 不同濃度的配合物1,繼續(xù)在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。用排槍吸取10 μL噻唑藍(lán)(5 mg /mL) 溶液加至每孔內(nèi)。4 h后,去除培養(yǎng)基后加入100 μL DMSO,振蕩10 min后,用酶標(biāo)儀檢測吸光值。

1.5 線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)

將HepG2細(xì)胞種至6孔內(nèi),置入在恒溫箱培養(yǎng)內(nèi)至細(xì)胞貼壁。然后在培養(yǎng)基中繼續(xù)加入配合物1。24 h后,用PBS洗滌細(xì)胞,繼續(xù)加入JC-1染色工作液于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)染色20 min。染色結(jié)束后用熒光倒置顯微鏡觀察和拍照。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ATP檢測

細(xì)胞內(nèi)ATP的檢測根據(jù)pCMV-Mito-AT1.03 Kit試劑盒 (碧云天生物技術(shù)有限公司,上海)的說明書操作。先將HepG2細(xì)胞種至6孔板內(nèi),細(xì)胞貼壁后加入配合物1繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用PBS洗滌后,用pCMV-Mito-AT1.03轉(zhuǎn)染。最后,在共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并拍照。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

通過Acridine Orange/ Ethidium Bromid(AO/EB)雙染法檢測配合物1對細(xì)胞凋亡的影響。將HepG2細(xì)胞種至6孔板內(nèi),培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。隨后加入配合物1繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌后,用AO和EB染色。20 min后用PBS洗滌,最后用熒光倒置顯微鏡觀察和拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)

利用X-射線單晶衍射檢測得到了銦配合物的晶體結(jié)構(gòu)。如圖2A所示,銦配合物的分子結(jié)構(gòu)由一個配體、一個In3+、一個水分子和兩個Cl-組成。中心In3+處于六配位的配位環(huán)境中,分別與兩個Cl-(In1-Cl1 2.246 ?,In1-Cl2 2.516 ?)、水分子(In1-O1 2.287 ?)及配體上的兩個N原子(In1-N1 2.75 ?,In1-N2 2.23 ?)和一個S原子(In1-S2 2.526 ?)形成配位鍵,形成了略微扭曲的八面體(圖2B)。

圖2 (A)配合物1X-射線晶體結(jié)構(gòu)圖;(B)銦離子的配位多面體圖

2.2 配合物1的抗腫瘤活性

應(yīng)用MTT法檢測配合物1對不同癌細(xì)胞株(HepG2、MGC803和SKOV3)和正常肝細(xì)胞株HL-7702的細(xì)胞毒性。如表3所示,配體和銦離子的IC50值均大于30 μmol/L,表明二者對癌細(xì)胞株的毒性非常低。與其相反的是,配體與銦離子形成配合物之后展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性,其IC50值為(1.43±0.15)～(4.97±0.24) μmol/L。其中,配合物對肝癌細(xì)胞株HepG2的活性優(yōu)于胃癌細(xì)胞株MGC-803和卵巢癌細(xì)胞株SKOV3。與陽性對照順鉑相比,配合物1的體外抗腫瘤活性更優(yōu)。此外,配合物1對正常細(xì)胞株HL-7702細(xì)胞毒性要低于三種癌細(xì)胞,這也表明配合物1在體外實(shí)驗(yàn)中具有一定的選擇性。

表3 配合物1對不同細(xì)胞株48 h的IC50 值

2.3 配合物1誘導(dǎo)線粒體功能障礙

線粒體是內(nèi)源性和外源性凋亡的重要靶點(diǎn)之一。各種死亡途徑的觸發(fā)始于線粒體功能障礙和死亡因子的釋放。許多金屬配合物已被證明會引起可測量的線粒體功能障礙并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡[10-11]?；诖?配合物1孵育HepG2細(xì)胞24 h后,其線粒體膜電位的變化被檢測。如圖3所示,配合物1能夠有效引起線粒體膜電位下降,且呈劑量依賴關(guān)系,這表明線粒體功能障礙可能是配合物1誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要通路之一。

(A)對照;(B)配合物1 (1.5 μmol/L);(C)配合物1 (3 μmol/L)。圖3 配合物1對線粒體膜電位的影響

2.4 配合物1降低HepG2細(xì)胞內(nèi)ATP的含量

線粒體是細(xì)胞的能量工廠,對ATP的產(chǎn)生至關(guān)重要[12]。調(diào)節(jié)線粒體代謝是治療惡性腫瘤的一個潛在的靶點(diǎn)[13]。用pCMV-AT1.03(ATP熒光探針)轉(zhuǎn)染配合物1孵育后的HepG2細(xì)胞來觀察配合物1對癌細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生的影響。如圖4所示,配合物1孵育過的細(xì)胞熒光比對照明顯減弱,隨著配合物1的濃度增加熒光強(qiáng)度明顯減弱。這些結(jié)果表明配合物1可以有效地削弱HepG2細(xì)胞的線粒體能量代謝,進(jìn)一步證實(shí)了線粒體功能障礙參與了配合物1的細(xì)胞毒性。

(A)對照;(B)配合物1 (1.5 μmol/L);(C)配合物1 (3 μmol/L)。圖4 配合物1降低HepG2細(xì)胞內(nèi)ATP水平

2.5 配合物1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

通過AO/EB雙染法檢測配合物1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡能力。結(jié)果如圖5所示,與對照組相比,配合物1處理組綠色熒光減弱,紅色熒光增加,且配合物1的濃度升高,紅色熒光增加更明顯,這表明配合物1能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡,且呈濃度依賴關(guān)系。

圖5 配合物1對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

3 結(jié)論

以縮氨基硫脲和2-噻唑甲醛為配體合成并一個銦配合物,并通過X-射線單晶衍射儀解析了其結(jié)果,中心銦離子與配體中的N、S原子、H2O及2個Cl離子以六配位的方式形成配位。銦配合物在體外實(shí)驗(yàn)中對三種不同的癌細(xì)胞株展現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性,其體外活性優(yōu)于順鉑。此外,銦配合物通過誘導(dǎo)線粒體功能障礙并抑制細(xì)胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生,這很可能是銦配合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡的重要途徑之一。本文的研究為尋找下一代金屬抗腫瘤藥物提供了一定的理論基礎(chǔ)。