超高效液相色譜
——串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定農(nóng)田環(huán)境中16 種磺胺類抗生素

張 彤,孟祥勇,楊智宇,徐宜宏,付海濱,栗 杰,粟有志,張 敏,于 麗

(1.沈陽海關(guān)技術(shù)中心,遼寧 沈陽 110016; 2.遼陽海關(guān)綜合技術(shù)服務中心,遼寧 遼陽 111000; 3.沈陽農(nóng)業(yè)大學,遼寧 沈陽 110866 ; 4.伊寧海關(guān)技術(shù)中心,新疆 伊寧 835000)

磺胺作為一類廣譜抗菌藥物,主要用于臨床上傳染病的防治。 被畜牧業(yè)和獸醫(yī)診所廣泛用于飼料添加劑和動物疾病的治療[1～4],由于獸用抗生素并不能完全被動物體所吸收,約30% ～90%抗生素隨著畜禽糞便排泄出來[5～6],而畜禽糞便通常會作為肥料回到農(nóng)田中,從而也對農(nóng)田環(huán)境(水、土壤)造成了污染[7～12]。

據(jù)調(diào)查顯示,目前國家標準中檢測磺胺類藥物的方法有SC/T 9436-2020,可以同時檢測21 種磺胺類藥物,在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中養(yǎng)殖水中檢出限為1～5 ng/ml,養(yǎng)殖環(huán)境底泥中檢出限為12.50 ～50 ng/g。 GB 31658.17-2021 可以同時檢測19 種磺胺類藥物,且動物組織檢出限為2.0 μg/kg;GB/T 22966-2008 使用范圍窄僅適用于牛奶和奶粉,可以檢測16 種喹諾酮類物,檢出低限1.0 μg/kg;GB/T 22947-2008,可以同時檢測18 種磺胺類藥物但是基質(zhì)只適用于蜂王漿,檢測低限5.0 μg/kg。 所以綜上所述,現(xiàn)有的國家標準中并沒有應用于農(nóng)田環(huán)境中16 種磺胺類藥物的檢測方法。 而且現(xiàn)有的相關(guān)文獻中對于磺胺類藥物殘留的檢測也多為食品,僅有的水和土壤中的檢測方法也因為磺胺種類少而應用較少[13～18]。 為此,本研究針對農(nóng)田環(huán)境中磺胺咧類抗生素檢測方法存在不足的現(xiàn)狀,運用UPLC-MS S 技術(shù),建立了農(nóng)田環(huán)境中16 種磺胺類抗生素殘留的快速篩查方法,為處理農(nóng)田環(huán)境中的磺胺類化合物,以及后期農(nóng)田環(huán)境的使用安全提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器:UPLC-MS 8060,日本島津公司)、固相萃取儀(美國Supelco 公司)超純水機(樂楓公司)、電子天平、氮吹儀、離心機、均質(zhì)器。

試劑:16 種磺胺類化學標準品(購自德國Dr.Ehrenstorfer,純度≥96%),乙腈、甲醇、甲酸為色譜級、PSA、500 mg/6ml MCX 固相萃取柱(均購自美國迪馬公司)。

1.2 樣品提取與凈化

1.2.1 試樣制備

土壤:按照《YC/T 386-2011 土壤中有機氯農(nóng)藥殘留量的測定 氣相色譜法》方法制備。

水樣:每個采集到的水樣至少為1 L,密閉容器中保存待用,測定前搖勻。

1.2.2 提取

土壤:稱取10.0 g 混合均勻試樣,于100 ml 離心管中,加入50 ml 乙腈,4 000 r/min 超聲提取30 min,過濾提取液,重復提取1 次,合并濾液,加入5.0 g 無水硫酸鈉,渦混1 min、4 000 r/min 離心5 min,取上清液,待凈化。

養(yǎng)殖廢水:稱取250 ml 水樣于500 ml 分液漏斗中,加入2 g 無水硫酸鈉溶解后,用50 ml 乙腈溶液,振搖萃取,靜置分層后,收集有機相,共萃取3 次,合并有機相。40 ℃真空條件下快速濃縮至5 ml 左右。

1.2.3 凈化

土壤:提取液中加入0.4 g PSA 粉末,渦混2 min、5 000 r/min,離心5 min,上清液經(jīng)5 g 無水硫酸柱除水后,于40 ℃真空條件下快速濃縮至近干。 1.0 ml 色譜純乙腈定容、渦混1 min,4 000 r/min 離心3 min,上清液過0.22 μm 微孔濾膜,供UPLC-MS 測定。

養(yǎng)殖廢水:提取液經(jīng)5 g 無水硫酸柱除水后,于40 ℃真空條件下快速濃縮至近干。 1.0 ml 色譜純乙腈定容,渦混1 min,過0.22 μm 微孔濾膜,供UPLC-MS 測定。

1.3 樣品分析

1.3.1 色譜條件

色譜柱:島津 C18(100 mm×2.1 mm ,2.0 μm);柱溫:40 ℃;進樣體積:1.0 μl;流速:0.20 ml/min;流動相:乙腈(A)和5 mmol/L 乙酸銨含0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫,0～0.5 min B 保持90 %;0.5～5 min B 由90%變化至75%;5～10 min B 由75%變化至50%;10 ～12 min B 保持50%;12～14 min B 由50%變化至90%;14～19 min B 保持90%。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源:ESI+ ;DL 溫度:250 ℃;加熱塊溫度:400 ℃;接口溫度:300 ℃;接口電壓:3.0 KV;霧化氣流量:3.0 L/min;干 燥 氣 流 量:10.0 L/min; 加 熱 氣 流 量:10.0 L/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的選擇優(yōu)化

比較了有機相(甲醇和乙腈),水相(水、0.1%甲酸、5 mmol/L 乙酸銨、5 mmol/L 乙酸銨含0.1%甲酸)的各種組合,分析了不同流動相組合對16 種磺胺的分離度,試驗結(jié)果表明:乙腈+5 mmol/L 乙酸銨含0.1%甲酸水溶液作為流動相時,16 種磺胺經(jīng)梯度洗滌完全分離且具有更好的峰值形狀和更高的靈敏度,因此,本研究選擇甲醇+0.1%甲酸水溶液作為流動相,此流動相條件下16 種磺胺類藥物的保留時間和MRM 圖如圖1 所示。

圖1 16 種磺胺類藥物的保留時間和MRM 圖Figure 1 Retention time and MRM of 16 quinolones

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先對16 種濃度為0.1 μg/ml 的磺胺的單標標準液進行全掃描,根據(jù)峰高、峰形,以及干擾度等因素確定母離子、定量離子和定性離子,然后在MRM 模式下,對Q1 Pre Bias、Q3 Pre Bias、和CE 進行優(yōu)化參數(shù),最終確定質(zhì)譜參數(shù),如表1 所示。

表1 待測抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters of antibiotics to be tested

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)現(xiàn)有文獻及標準,本方法對比了16 種分析物在不同提取溶劑(甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮)下的提取效果。 表2 的實驗結(jié)果表明,采用乙酸乙酯和丙酮作為提取溶劑,16 種磺胺回收率不到60%,部分藥物甚至低于50%,可能是磺胺類藥物在乙酸乙酯和丙酮中的溶解性不好,提取率過低。 而使用乙腈和甲醇的提取效果具有明顯優(yōu)勢,其中乙腈的提取效果最好,回收率為 65.4%～105.4%。 因此,本研究采用乙腈作為提取溶劑。

表2 不同酸性條件下16 種獸藥的回收率Table 2 Recovery rate of 16 veterinary drugs under different acid conditions

2.2.2 凈化方法的選擇

QuEChERS 是最常見的用于檢測食品中的多種藥物殘留的樣品預處理方法。 由于養(yǎng)殖廢水中含有畜禽糞便、飼料、抗生素等多種殘留,基質(zhì)較土壤更為復雜,因此,本研究以養(yǎng)殖廢水為研究對象,針對其所含有的特殊雜質(zhì)進行凈化方法優(yōu)化。 對比了QuEChERS 和MCX 固相萃取柱的凈化效果。 根據(jù)圖2 的實驗結(jié)果,采用 MCX固相萃取柱凈化的16 種磺胺其回收率明顯低于QuECh-ERS 凈化的回收率。 其中經(jīng)過MCX 固相萃取柱凈化的磺胺甲噻二唑、磺胺對甲氧嘧啶等的回收率更是低于60%,這是因為凈化過程中MCX 柱吸附了過多的化合物,導致回收率偏低。 使用QuEChERS 凈化的16 種磺胺其回收率穩(wěn)定為63.5%～105.4%。 所以本研究采用QuECh-ERS 作為凈化方法。

圖2 不同凈化方法下16 種獸藥的回收率Figure 2 Recovery rate of 16 veterinary drugs under different purification methods

2.2.3 基質(zhì)效應(ME)

農(nóng)田環(huán)境中養(yǎng)殖廢水的成分最為復雜,雖然經(jīng)過凈化處理,但仍有部分雜質(zhì)會與待測物一起隨流動相進入質(zhì)譜離子源,進而對目標化合物的離子化效果產(chǎn)生影響,從而導致基質(zhì)效應(ME)。 圖3 列出了16 種磺胺在養(yǎng)殖廢水中的基質(zhì)效應。 結(jié)果顯示,ME 的范圍為2.5%～36.2%,低于50%,表明養(yǎng)殖廢水不存在強基質(zhì)效應。 由圖3 可知,磺胺醋酰和磺胺吡啶等具有基質(zhì)減弱效應,磺胺噻唑和磺胺氯噠嗪等存在基質(zhì)增強效應。 因此,本研究采用空白基質(zhì)加標曲線來校正,以克服基質(zhì)效應。

圖3 16 種獸藥的基質(zhì)效應Figure 3 Matrix effect of 16 veterinary drugs

2.3 方法學驗證

將空白基質(zhì)按1.2 處理,并配制混合工作曲線。 16種磺胺的曲線范圍如表3 所示,以被測組分的濃度為橫坐標,被測組分的峰面積為縱坐標擬合工作曲線,得到相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限。 結(jié)果見表3。 根據(jù)檢出限的不同,分別添加檢出限的1 倍、2 倍和10 倍制成模擬的加標樣品,測定16 種的回收率、變異系數(shù)見表3。 實驗結(jié)果表明16 種的相關(guān)系數(shù)均高于0.9933,回收率為65.4%～107.1%,相對標準偏差為3.2%～10.7%,方法檢出限為0.03～0.6 μg/kg,定量限為0.1～2.0 μg/kg。

表3 16 種磺胺的曲線范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率、相對標準偏差Table 3 Curve range, correlation coefficient, detection limit, quantitation limit, recovery rate and relative standard deviation of 16 sulfonamides

2.4 實際樣品檢測

用本方法分別對養(yǎng)殖廢水和周邊土壤開展16 種抗生素檢測,其中養(yǎng)殖廢水樣品 20 件、周邊土壤樣品20 件。16 種目標分析物在20 份養(yǎng)殖廢水中有5 份樣品中檢出,20 份土壤中有3 份樣品有檢出。 檢出的種類和含量如表4 所示。

表4 實際樣品中16 種磺胺的殘留量Table 4 Residues of 16 sulfonamide sin actual samples

3 結(jié)論

本研究建立了農(nóng)田環(huán)境中同時測定16 種磺胺的超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定方法,16 種磺胺的方法檢出限0.03～0.6 μg/kg,定量限0.1 ～2.0 μg/kg。 該定性定量分析方法簡便、快速、靈敏、重現(xiàn)性好,符合實驗分析要求。 可同時檢測16 種磺胺在農(nóng)田環(huán)境中的殘留。 擴大了磺胺類藥物檢測的基質(zhì),降低了檢出限和定量限,可同時推廣到行業(yè)其他實驗室,具有一定的創(chuàng)新和推廣價值。