基于PARMS 技術(shù)的抗稻瘟病基因Piz-t分子標(biāo)記的開發(fā)與利用

何 娜,王麗麗,高 虹,張麗穎,唐志強(qiáng),付 亮,王昌華,隋國民,鄭文靜,馬作斌

(遼寧省水稻研究所, 遼寧 沈陽 110101)

水稻是世界上最主要的糧食作物之一,養(yǎng)活了全球一半以上的人口,但每年因稻瘟病菌引起的稻瘟病(Magnaportheoryzae)對(duì)水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失[1]。 利用抗稻瘟病基因選育抗病品種是控制稻瘟病大面積發(fā)生最經(jīng)濟(jì)有效的途徑[2]。 國內(nèi)外很多育種家將常規(guī)育種方法與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)相結(jié)合,利用主效的抗稻瘟病基因?qū)λ酒贩N的稻瘟病抗性進(jìn)行定向改良,取得了令人矚目的成績[3～5]。 截至目前為止,已至少報(bào)道了114 個(gè)主效基因,半數(shù)以上的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色體區(qū)域[6]。其中,最大的4 個(gè)基因簇分別位于第6、9、11 和12 染色體上[7]。 通過不斷深入研究,目前已有39個(gè)基因成功克隆,包括第6 染色體上的Pi2/Pigm/Pi9/Piz-t、Pid2、Pid3、Pi25;第9 染色體上的Pi5/Pi3/Pi-i、Pi56;第11 染色體上的Pia、Pi-CO39、Pi1/Pik/Pik-h/Pi54/Pikp/Pikm、pb1;以及第12 染色體上的Pita和Ptr[8]。

Piz-t位于水稻6 號(hào)染色體短臂,是一個(gè)具有對(duì)稻瘟病生理小種具有廣譜抗性的基因[9],對(duì)于培育具有廣譜抗性的水稻品種具有巨大的利用價(jià)值,但該基因所在染色體區(qū)段包含多個(gè)對(duì)不同稻瘟病生理小種具有抗性的等位基因,如Pi9、Pi-z、Pi-2 以及感病等位基因[10],水稻抗稻瘟病基因Pizt對(duì)我國不同稻區(qū)的稻瘟病菌表現(xiàn)廣譜抗性,在水稻育種中具有較高的利用價(jià)值。

水稻抗病育種是通過抗性鑒定對(duì)植株進(jìn)行表型選擇,耗費(fèi)時(shí)間長,且易受環(huán)境條件的限制,鑒定結(jié)果容易造成誤差,選擇效率較低。 育種家開展了大量分子標(biāo)記輔助選擇抗稻瘟病基因,改良現(xiàn)有水稻品種的稻瘟病抗性的實(shí)踐,如聚合3 個(gè)稻瘟病基因改良金23B 的稻瘟病抗性[11],利用分子標(biāo)記轉(zhuǎn)育3 個(gè)基因改良空育131 稻瘟病抗性[12],利用分子標(biāo)記技術(shù)聚合Pi-1 和Pi-2 基因改良三系不育系榮豐A 的稻瘟病抗性[13],表明利用分子標(biāo)記輔助選擇育種簡單有效,可以降低育種成本,縮短選育周期,亦可進(jìn)行有目的的多基因聚合,提高育種效率,帶來巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

本研究根據(jù)Piz-t與其等位基因Pi2、Pi9、Pigm、Pi50 的序列差異,開發(fā)了一套基于PARMS檢測技術(shù)(Penta-primer amplification refractory mutation system)的熒光分子標(biāo)記。 該標(biāo)記能夠準(zhǔn)確的檢測出育種后代材料中Piz-t基因型,以及是否純和,結(jié)合高通量DNA 提取和熒光檢測技術(shù)能夠?yàn)樗究沟疚敛》肿訕?biāo)記輔助育種提供簡便、可靠、低價(jià)高通量的基因鑒定技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為國家作物種質(zhì)資源庫遼寧分庫提供的水稻資源98 份,以龍粳31 為父本遼星21 號(hào)為母本構(gòu)建的后代材料。

1.2 DNA 提取

DNA 提取采用SDS 裂解法,首先將植物葉片用打孔器取8 片放入取樣盤中,加入鋼珠,-80 ℃凍存,用組織研磨儀研磨葉片后加入1.5% SDS裂解液,65 ℃孵育裂解,再用醋酸鈉沉淀離心,獲得上清液,加入異丙醇沉淀出DNA,用70%酒精漂洗2 次,晾干,得到干凈的DNA,加入TE 溶劑溶解,放入4 ℃待用。

1.3 PARMS 反應(yīng)測試

10 μl PCR 反應(yīng)體系。 在PCR 反應(yīng)板中加入20 ng DNA 樣品,烘干后加入PARMS Master Mix反應(yīng)混合液(武漢市景肽生物科技有限公司生產(chǎn)),反應(yīng)體系見表1。 PCR 擴(kuò)增在ABI 7500 熒光定量PCR 系統(tǒng)中完成,Touchdown PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性15 min;第一步擴(kuò)增反應(yīng),94 ℃變性20 s,65～57 ℃退火并延伸60 s,10 個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8 ℃;第二步擴(kuò)增反應(yīng),94 ℃變性20 s,57 ℃退火并延伸60 s,32 個(gè)循環(huán)。 PCR 反應(yīng)完成后進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)讀取,熒光數(shù)據(jù)的結(jié)果轉(zhuǎn)化成圖形。

表1 標(biāo)記引物序列Table 1 Primers infornation of marker in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)

抗稻瘟病基因Piz-t(GenBank:DQ352040.1)物理位置是的第6 號(hào)染色體10.38-10.39 Mb 區(qū)間內(nèi)(日本晴MSU 7.0),該位點(diǎn)有4 個(gè)已克隆的等位基因包括:來自小粒野生稻Pi9(GenBank:DQ285630.1);Pi2(GenBank: DQ352453)、Pigm(GenBank: KU904633.2) 和Pi50 (GenBank:KP985761.1),通過序列比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)Piz-t的第2348、2349 位堿基為TG 而其他基因?yàn)镃T。 提該區(qū)間的SNP 位點(diǎn)和側(cè)翼序列,并利用在線引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站http:/ /www.snpway.com/對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。 每組標(biāo)記有3 條引物,在其中兩條特異性引物5’端分別連接FAM 和HEX 熒光序列。 標(biāo)記引物F-TG 能跟PARMs master mix 中的FAM熒光特異結(jié)合,而F-CT 能夠與HEX 熒光特異結(jié)合,根據(jù)PCR 反應(yīng)后產(chǎn)物的熒光信號(hào)的不同,判斷樣品的基因型。 如果樣品攜帶抗稻瘟病基因Piz-t,產(chǎn)物的熒光信號(hào)為FAM,否則為HEX(表1)。

2.2 抗稻瘟病基因Pizt 在遼寧省水稻品種中的分布

根據(jù)上述檢測方法,用標(biāo)記Pizt-M1 對(duì)94 個(gè)水稻資源進(jìn)行鑒定(表2)。 分子標(biāo)記Pizt-M1 的分型圖,如圖2A 所示,橫坐標(biāo)為FAM 熒光值,縱坐標(biāo)為HEX 熒光值,每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品,部分樣品HEX 熒光較強(qiáng)FAM 熒光較弱,位于圖的左上角,該部分樣品表示的基因型為CT,即非Pizt抗病基因。 位于左下角的樣品HEX 熒光和FAM熒光都較弱,為陰性對(duì)照,即非Pizt抗病基因。 檢測樣品中僅2 個(gè)表現(xiàn)出FAM 熒光較強(qiáng),這兩個(gè)樣品為龍粳31 和遼開79,表示這2 個(gè)樣品在標(biāo)記位點(diǎn)的基因型為TG,攜帶Pizt抗病基因。 綜合檢測結(jié)果表明Pizt基因未在檢測的粳稻品種中廣泛應(yīng)用,后續(xù)可以導(dǎo)入Pizt基因定向改良稻瘟病抗性,Pizt-M1 可用于水稻Pizt基因的高效檢測。

表2 水稻資源中Pizt 基因的的鑒定Table 2 QTL of blast resistance

圖1 分子標(biāo)記位點(diǎn)的序列比對(duì)Figure 1 Sequence alignment of molecular marker sites

圖2 分子標(biāo)記Pizt-M1 的分型Figure 2 Shows the results of genotyping using the molecular marker Pizt-M1

2.3 分子標(biāo)記在水稻分子輔助育種中的應(yīng)用

為利用抗稻瘟病基因Pizt改良水稻品種的稻瘟病抗性,本研究以攜帶抗稻瘟病基因Pizt的龍粳31 與不攜帶抗稻瘟病基因Pizt遼星21 雜交,經(jīng)田間篩選后獲得55 個(gè)后代材料,利用Pizt-M1對(duì)這些后代進(jìn)行檢測(圖2B)。 后代樣品中有一部分材料HEX 熒光較強(qiáng)而FAM 熒光較弱,該部分樣品的基因型為CT,即非Pizt抗病基因。 在后代材料里能夠檢測到攜帶純和抗病基因Pizt的后代材料,表現(xiàn)出FAM 熒光較強(qiáng),位于圖的右下角。

與不同品種的分型圖比較發(fā)現(xiàn)多出了一部分位于圖片中間的樣品,這部分樣品HEX 熒光和FAM 熒光都較強(qiáng),表明該位置的樣品即攜帶非Pizt抗病基因(CT)同時(shí)也攜帶Pizt抗病基因(TG),說明處于這個(gè)位置的水稻樣品攜帶Pizt的雜合基因型。 結(jié)果表明利用SNP 標(biāo)記Pizt-M1 對(duì)Pizt基因的檢測準(zhǔn)確,能夠檢測出攜帶的基因是否純合。 在利用SNP 標(biāo)記Pizt-M1 進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種時(shí)能夠有效快速篩選到攜帶純合抗病基因Pizt的水稻株系。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對(duì)Piz位點(diǎn)的5 個(gè)等位基因進(jìn)行序列比對(duì),找到了1 個(gè)能夠區(qū)分出Piz-t的SNP 位點(diǎn),開發(fā)出相應(yīng)的PARMS SNP 鑒定標(biāo)記Pizt-M1。應(yīng)利用該標(biāo)記對(duì)水稻材料進(jìn)行Piz-t基因檢測,可在秈稻、粳稻等不同種質(zhì)資源中快速、精準(zhǔn)的檢測水稻稻瘟病抗性基因Piz-t,在育種后代材料的檢測中能夠很好的區(qū)分雜合基因型和純和基因型能夠有效的開展分子標(biāo)記輔助選擇育種。 檢測過程中不需要酶切、電泳及測序等繁瑣的程序,減少PCR 產(chǎn)物氣溶膠的污染以及EB 等有毒物的使用,同時(shí)可在分子標(biāo)記輔助育種的早期進(jìn)行前景選擇和背景選擇,提高背景回復(fù)率,減小育種群體的規(guī)模,加快育種進(jìn)程,有利于Pizt基因高效、環(huán)保的應(yīng)用于水稻商業(yè)化分子育種中。

由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻主要病害之一,嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量,威脅世界糧食安全[14]。 在水稻生產(chǎn)中,利用抗病水稻品種中的主效抗稻瘟病基因改良水稻品種抗性是最經(jīng)濟(jì)有效的辦法[15～16]。 至少報(bào)道了114 個(gè)主效基因,半數(shù)以上的基因以基因簇的形式分布于水稻的不同染色體區(qū)域。 其中,最大的4 個(gè)基因簇分別位于第6、9、11 和12 染色體上[7]。 通過不斷深入研究,目前已有39 個(gè)基因成功克隆,包括第6 染色體上的Pi2/Pigm/Pi9/Piz-t/Pi50、Pid2、Pid3、Pi25;第9 染色體上的Pi5/Pi3/Pii、Pi56;第11 染色體上的Pia、PiCO39、Pi1/Pik/Pik-h/Pi54/Pikp/Pikm、pb1;以及第12 染色體上的Pita和Ptr[8]。 育種家們利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已將部分基因?qū)氩煌脑耘嗟局袘?yīng)用于水稻生產(chǎn)[11,13]聚合抗病基因?qū)⑻岣咚緦?duì)稻瘟病的抗性。 有些重要的抗病位點(diǎn)存在多個(gè)不同的等位基因,而不同的等位基因的抗譜不同。 利用這些基因進(jìn)行抗病育種,需要準(zhǔn)確的、低成本、高通量的鑒定方法,才能夠在育種中大量應(yīng)用。Piz位點(diǎn)具有5 個(gè)不同抗譜的抗病基因Pi2/Pigm/Pi9/Piz-t/Pi50,因此如想有效利用該位點(diǎn)的抗病基因,需要開發(fā)能夠區(qū)分不同等位基因的特異性分標(biāo)記,從而針對(duì)不同疫區(qū)生理小種選用不同的等位基因。

有學(xué)者利用水稻抗稻瘟病基因Piz-t特異性SNP 位點(diǎn),開發(fā)了基于PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小判斷其不同等位基因的分子標(biāo)記,并成功應(yīng)用與水稻資源的鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種中[17]。但是這種PCR 方法不能實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化操作,限制了其應(yīng)用的前景。 PARMS(Penta-primer amplification refractory mutation system,五引物擴(kuò)增受阻突變體系是由武漢市景肽生物科技有限公司自主研發(fā)的新型SNP 分子標(biāo)記檢測技術(shù),具有完全自主的知識(shí)產(chǎn)權(quán)[18]。 相比于目前最常用的基于PCR+電泳的SSR 技術(shù),PARMS SNP 檢測技術(shù)免去了耗時(shí)費(fèi)力的電泳技術(shù),采用熒光掃描的方式直接讀取等位基因的基因型信號(hào),配合數(shù)據(jù)分析軟件,可快速完成基因型分析工作,工作效率具有數(shù)量級(jí)的提升。 而且PARMS 技術(shù)非常適用于檢測自動(dòng)化,配合GeneMatrix 高通量基因分型系統(tǒng),可以做到每天10 萬個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的超高通量,已成功應(yīng)用在水稻抗稻瘟病分子輔助育種中[19]。