南北五味子多糖含量及成分比較

武天元

(黑龍江中醫(yī)藥大學·黑龍江 哈爾濱 150040)

五味子為木蘭科(Magnoliaceae)植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實,南五味子為木蘭科華中五味子SchisandrasphenantheraRehd. et Wils.的干燥成熟果實[1]。通常根據(jù)五味子生長區(qū)域不同分為南、北五味子,主要產(chǎn)于東北地區(qū)的五味子習慣稱為“北五味子”,主產(chǎn)于華東、華中、云貴等地的五味子習慣稱為“南五味子”。南、北五味子在歷史上曾作為同一味中藥材應用,2000年《中國藥典》將南、北五味子加以區(qū)分應用,除質(zhì)量標準不同外,性味歸經(jīng)、功能主治等表述均一致。二者作為同屬植物基原,性狀等方面較為相似,市場上存在摻入、混用等現(xiàn)象[2]。五味子中主要含有木脂素類、多糖類、皂苷類、揮發(fā)油類等活性成分[3],現(xiàn)代藥理學研究表明,五味子多糖具有抗炎、抗氧化、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等功效[4]。近年來已有HPLC[5]、LC-MS[6]等一系列方法區(qū)分南、北五味子木脂素類等成分差異以及GC-MS方法[7-8]區(qū)分南北五味子揮發(fā)油類成分。目前關于南北五味子多糖結(jié)構(gòu)差異的報道較少,結(jié)構(gòu)差異尚不明確。

本研究通過對南、北五味子中多糖類成分的提取分離純化得到五味子總多糖,對其多糖結(jié)構(gòu)進行比較,以期豐富南、北五味子多糖差異研究,更好地指導南、北五味子的區(qū)分鑒別。

1 材料

北五味子采集于黑龍江省,華中五味子采集于湖北省,經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥大學孫慧峰教授鑒定分別為北五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)、華中五味子(SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.)。

N-1100V-W(WD)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:日本EYELA東京理化器械株式會社;Christ LDplus冷凍干燥機:北京思達興業(yè)儀器有限公司;FA2104電子分析天平:上海天平廠;2695高效液相色譜儀:Waters公司;8400S紅外光譜儀:日本島津有限公司;BONA-GM-20膜分離機:山東博納生物科技集團有限公司。

AB-8大孔樹脂:天津市匯達化工有限公司;咔唑、苯酚、牛血清蛋白、考馬斯亮藍、半乳糖醛酸、無水葡萄糖、氫氧化鈉、濃硫酸、三氟乙酸、磷酸等均為分析純。

2 實驗方法

2.1 五味子多糖的提取 稱取南、北五味子藥材各500 g,粉碎,10倍量體積加熱回流提取3次,每次提取時間為3 h,濃縮提取液,使用AB-8大孔樹脂柱色譜進行分離,得到水洗組分,透析后通過膜分離技術(Mw=3 kDa)分別得到南、北五味子總多糖(SCP),濃縮,冷凍干燥,并計算出其膏率。

2.2 五味子總糖含量測定

2.2.1 標準品溶液的制備 精密稱取12.5 g苯酚,充分溶解后,定容至250 mL,得5%苯酚溶液。精密稱取20 mg無水葡萄糖,充分溶解后,定容至50 mL,得0.40 g/L的無水葡萄糖標準品溶液,梯度稀釋得到0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 g/L的無水葡萄糖標準品溶液。

2.2.2 標準曲線的繪制 分別加入1 mL不同濃度葡萄糖標準溶液,加入5%苯酚0.2 mL搖勻后加入濃硫酸1.0 mL。搖勻后沸水浴15 min,流水冷卻至室溫,吸取200 μL于96孔板中,測定490 nm處吸光度值,重復3次。以Glu濃度(mg/L)為橫坐標,以吸光度值(A)為縱坐標,繪制標準曲線,計算回歸方程。

2.2.3 五味子多糖含量測定 精密稱取南、北五味子粗多糖各10 mg,定容于25 mL容量瓶內(nèi),超聲至完全溶解后,配以0.4 g/L五味子粗多糖溶液,將1 mL吸取于試管內(nèi),加1 mL蒸餾水拌勻后,繼續(xù)提取1 mL后,再加1 mL蒸餾水。以此類推,稀釋3組不同濃度的藥液,重復上述操作步驟,平行測定3次,取平均值,代入測定出來的葡萄糖含量標準曲線中,計算五味子粗多糖中總糖含量。

2.3 五味子總糖中糖醛酸含量測定

2.3.1 標準品溶液的制備 精密稱取450 mg硼砂,加5 mL蒸餾水完全溶解后,加入98%濃硫酸定容至50 mL棕色容量瓶中儲存。精密稱取0.05 g咔唑,定容至50 mL棕色瓶中儲存。精密稱取10 mg半乳糖醛酸標準品,蒸餾水定容至25 mL,得0.4 g/L半乳糖醛酸標準溶液,梯度稀釋得0.2、0.1、0.05、0.025 g/L半乳糖醛酸標準溶液。

2.3.2 標準曲線的繪制 分別加入0.2 mL不同濃度的半乳糖醛酸標準品溶液。加入1.2 mL的硫酸-硼砂溶液,烘箱中加熱5 min,冰水浴降至室溫。加入1 g/mL咔唑無水乙醇溶液0.04 mL搖勻,烘箱中加熱10 min,待冷卻后搖勻,分別吸取200 μL于96孔板上,用酶標儀測定525 nm處吸光度值,重復測定3次。利用以糖醛酸濃度(mg/L)為橫坐標,吸光度值(A)為縱坐標,繪制半乳糖醛酸標準曲線,并計算回歸方程。

2.3.3 五味子多糖糖醛酸含量測定 精密稱取 南、北五味子多糖各10 mg,定容到25 mL容量瓶內(nèi),超聲至完全溶解后,獲得北五味子多糖溶液的濃度0.4 g/L。將1 mL吸取于試管內(nèi),加1 mL蒸餾水拌勻后,繼續(xù)提取1 mL后,再加1 mL蒸餾水。以此類推,稀釋3組不同濃度的藥液,重復上述操作步驟,平行測定3次,取平均值,代入半乳糖醛酸含量標準曲線,計算五味子多糖中糖醛酸含量。

2.4 五味子多糖總蛋白含量測定

2.4.1 標準品及樣品溶液的制備 精密稱取考馬斯亮藍G250 25 mg,加入12.5 mL 95%乙醇溶解,再加入85%的磷酸25 mL,蒸餾水定容至250 mL,過濾,得0.1 g/L考馬斯亮藍溶液,避光保存。精密稱取25 mg牛血清蛋白,蒸餾定容至250 mL,得0.1 g/L標準蛋白質(zhì)溶液,梯度稀釋得50、25、12.5、6.25 mg/L的標準蛋白溶液。分別精密稱取南、北五味子多糖各25 mg,定容至25 mL得1 g/L五味子多糖溶液。

2.4.2 標準曲線的繪制 分別吸取不同濃度標準蛋白溶液0.2 mL于試管中,分別1 mL的考馬斯亮藍溶液,測定595 nm波長處吸光度值。以牛血清白蛋白濃度(μg/mL)作為橫坐標,以吸光度(A)作為縱坐標,繪制標準曲線,并計算出相應的回歸方程。

2.4.3 五味子多糖總蛋白含量測定 精密稱取南、北五味子多糖各25 mg進行,用蒸餾水定容到25 mL容量瓶內(nèi),制得1 g/L北五味子多糖溶液,在試管內(nèi)分別提取0.2 mL溶液,反復以上操作,平行測定3次,取其平均值,代入蛋白質(zhì)含量標準曲線內(nèi),計算南、北五味子多糖蛋白質(zhì)含量。

2.5 五味子多糖紅外光譜分析 稱取南、五味子多糖各2 mg,采用KBr壓片法,測定五味子的紅外波譜圖,掃描范圍為400～4 000 cm-1。

2.6 五味子多糖單糖成分測定 分別精密稱取南、北五味子多糖樣品各5 mg,加入2M TFA溶液3 mL,110 ℃反應4 h,旋干,加入甲醇繼續(xù)旋至無酸味,加水溶解,過0.22 μm濾膜。使用Thermo ICS 6000離子色譜儀,使用Dionex CarboPacTM PA20色譜柱(3×150 mm),流動相A為水,B為100 mM/L氫氧化鈉-水溶液,C為100 mM/L醋酸鈉-水溶液,混合洗脫。流速0.5 mL/min,柱溫25 ℃,進樣量體積5 μL。

3 結(jié)果

3.1 五味子多糖含量測定結(jié)果 北五味子多糖提取率為10.6%,南五味子多糖提取率為5.56%。采用苯酚-硫酸法測得的葡萄糖含量標準曲線為y=0.0046x + 0.033(R2=0.9997),見圖1,計算得北五味子多糖總糖含量67.07%,南五味子多糖總糖含量5.56%。

圖1 葡萄糖標準曲線

采用硫酸-咔唑法測得的半乳糖醛酸標準曲線為y=0.0052x+0.0905(R2=0.9905),見圖2,計算得北五味子多糖中糖醛酸含量為22.05%,南五味子多糖中糖醛酸含量為29.1%。

圖2 半乳糖醛酸標準曲線

使用考馬斯亮藍法獲得的標準曲線為y=0.003x-0.0132,(R2=0.9996),見圖3。計算得北五味子多糖中所含蛋白質(zhì)含量為0.7%,南五味子多糖中所含蛋白質(zhì)含量為1.7%。

3.2 五味子多糖紅外光譜分析 北五味子的FT-IR光譜在3 307、2 918、1 100 cm-1處顯示出多糖的特征吸收峰,見圖4;此外,在1 739、1 629 cm-1處的吸收峰表示北五味子含有酸性多糖。南五味子在3 378、2 919、1 101 cm-1處顯示出多糖的特征峰,見圖5;此外,在1 728、1 612 cm-1處的吸收峰表示南五味子含有酸性多糖。

圖4 北五味子多糖紅外光譜

圖5 南五味子總多糖紅外光譜

A.北五味子單糖組成;B.南五味子單糖組成(1.鼠李糖;2.阿拉伯糖;3.半乳糖;4.葡萄糖;5.木糖;6.甘露糖;7.半乳糖醛酸)圖6 南、北五味子多糖離子色譜圖

3.3 五味子多糖單糖成分測定結(jié)果 北五味子多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸、甘露糖組成;其摩爾百分比分別為0.1%、0.63%、9.8%、43%、0.37%、33%、13.5%,其中含有33%的酸性糖和67%的中性糖。南五味子多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖組成;其摩爾百分比分別為10%、0.48%、1.8%、18.4%、64.5%、4.7%其中含有64.5%的酸性糖和35.5%的中性糖。

4 討論

《本草綱目》中記載:“五味,今有南北之分,南產(chǎn)者,色紅;北產(chǎn)者,色黑,入滋補藥必用北產(chǎn)者乃良”[9],《本草求真》中記載:“北產(chǎn)紫黑者良。”[10],《本草蒙筌》中記載,“南北各有所長,藏留切勿相混,風寒咳嗽南五味為奇,虛損勞傷北五味最妙”[11]。其中所含活性成分種類含量的差異,可能是導致功效差異的關鍵。本研究表明,南北五味子總多糖中總糖含量北五味子高于南五味子,而糖醛酸含量南五味子高于北五味子。單糖組成分析結(jié)果表明南北五味子單糖組成比例具有一定的差異。北五味子中含有較多的中性糖,以葡萄糖含量最多,南五味子中含有大量的酸性糖,主要為半乳糖醛酸[12]。可根據(jù)化學成分的差異指導南、北五味子的臨床使用。