肺金生方對(duì)肺癌干細(xì)胞自我更新的抑制作用及其機(jī)制研究

楊 敏,高文倉(cāng),龐德湘,張?jiān)瞥?/p>

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院·浙江 杭州 310000;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院·上海 200437)

肺癌是起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤,死亡率在癌癥相關(guān)的死亡中位居第一,其5 年生存率為19.4%[1]。肺癌中有一部分具有自我更新能力的細(xì)胞亞群,被稱為肺癌干細(xì)胞(Lung Cancer Stem Cells, LCSC),可調(diào)控腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,誘發(fā)對(duì)當(dāng)前治療的耐藥。研究表明,LCSC的干性受多種分子調(diào)節(jié),如CD133、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)、SOX2等[2]。其中CD133,也稱為Prominin-1,是鑒定和分離LCSC的可靠標(biāo)志物[3]。肺癌患者化療后其腫瘤組織中的CD133表達(dá)增加,從中分離的CD133+的腫瘤細(xì)胞亞群具有更高的致瘤性及耐藥性,并高表達(dá)AKT/PKB與BCL-2,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[4]。OCT4與SOX2是重要的干性維持基因,在LCSC自我更新中起至關(guān)重要的作用[5-7]。LCSC通過(guò)自我更新能力進(jìn)行腫瘤特征性的無(wú)限的增殖分裂,產(chǎn)生新生的LCSC或分化為具有特定耐藥表型的肺癌細(xì)胞,在臨床治療中,LCSC的自我更新能力是導(dǎo)致治療失敗的主要原因,因此,找到抑制LCSC自我更新的藥物具有重要意義[8]。

肺金生方由我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)典籍《金匱要略》中的經(jīng)典方“澤漆湯”結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果加減化裁得來(lái),在臨床肺癌患者的治療中取得了較好的療效,其聯(lián)合化療可顯著改善患者咳嗽、氣急、痰中帶血等肺癌常見(jiàn)癥狀[9]。但其發(fā)揮抑制肺癌的作用是否與調(diào)控LCSC自我更新有關(guān)仍未可知。

Notch信號(hào)通路廣泛存在于各種細(xì)胞中,干細(xì)胞中主要負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞的自我更新和與其他細(xì)胞間通訊,與肺癌及多種腫瘤干細(xì)胞的發(fā)展密切相關(guān)。本研究使用肺金方對(duì)LCSC進(jìn)行干預(yù),檢測(cè)其對(duì)LCSC自我更新能力的影響并探究其可能的作用機(jī)制,報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 細(xì)胞 人肺癌A549細(xì)胞系購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 肺金生方:將肺金生方(澤漆、生曬參、桂枝、制半夏、石見(jiàn)穿、白前、炒黃芩、露蜂房、制膽南星、生姜、甘草)藥液濃縮滅菌后定量分裝,制作成凍干粉,使用前用PBS溶解,0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10],制成1 g/L及2 g/L的中藥原液,-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器 DMEM /F12 培養(yǎng)基和胎牛血清:美國(guó) Gibco;CD133抗體:美國(guó) Cell Signaling Technology 公司;EGF、FGF-basic:美國(guó)peprotech公司;小鼠抗兔二抗:美國(guó)Santa cruz公司;RIPA蛋白裂解液、胰蛋白酶及PCR引物:上海生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白定量試劑盒:中國(guó)賽默飛世爾有限公司;兔抗人/鼠CD133、兔抗人/鼠SOX2、兔抗人/鼠OCT4、兔抗人/鼠Notch1、兔抗人/鼠Jagged1、兔抗人/鼠GAPDH辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記單克隆抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗):美國(guó)Cell Signaling Technology公司。CO2恒溫孵育箱:法國(guó)Jouan公司;高速低溫離心機(jī):美國(guó)SIGMA公司;超凈工作臺(tái):北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基于25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),于CO2含量5%的37 ℃恒溫孵育箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。每2～3 d進(jìn)行換液,待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞增殖至覆蓋培養(yǎng)瓶底部的80%～90%即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,使用無(wú)Ca+、Mg+的PBS沖洗2 次,加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA分離細(xì)胞,按1∶3的比例進(jìn)行常規(guī)傳代,代數(shù)不超過(guò)30,即含血清培養(yǎng)(serum containing medium, SCM)。

1.5 肺癌干細(xì)胞培養(yǎng) 將A549肺癌細(xì)胞0.5 mL胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化,使用不含Ca+、Mg+的PBS及無(wú)血清DMEM清洗后制成單細(xì)胞懸液,以1×103cells/孔接種于超低粘附6 孔板中,使用含20 mL/LB27,20 μg/L 重組人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)與20 μg/L 重組人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的DMEM進(jìn)行懸浮培養(yǎng),2～3 d更換培養(yǎng)基,即無(wú)血清培養(yǎng)(SFM)。定期于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察,約2～3 周可見(jiàn)3D懸浮細(xì)胞球落形成,收集并離心,以1∶3的比例進(jìn)行傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 二次球落形成實(shí)驗(yàn) 將收集的肺癌干細(xì)胞以2×103cells/孔接種于超低粘附6 孔板中,分別以不同濃度的肺金生方提取液進(jìn)行干預(yù),7 d后收集細(xì)胞,再次以2×103個(gè)cells/孔接種于另一6 孔板中使用不同濃度肺金生方進(jìn)行干預(yù),7～10 d后于顯微鏡下觀察,計(jì)算3D懸浮腫瘤球落形成數(shù)量并拍照記錄。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)CD133、OCT4、SOX2及Notch1,Jagged1 mRNA的表達(dá) 收集常規(guī)培養(yǎng)的A549細(xì)胞及不同濃度肺金生方干預(yù)后的肺癌干細(xì)胞,使用TRIzol法分別提取細(xì)胞總RNA,并進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 預(yù)變性30 s;95 ℃ 預(yù)變性15 s;63 ℃ 退火60 s,每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。共40 個(gè)循環(huán)。以2△△Ct值表示目的基因的表達(dá)水平,檢測(cè)CD133、OCT4、SOX2、Notch1 及Jagged1的表達(dá)。

1.8 Western blot檢測(cè)CD133、SOX2、OCT4、Notch1、Jagged1蛋白的表達(dá) 收集A549細(xì)胞及不同濃度肺金生方干預(yù)后的肺癌干細(xì)胞,加入RIPA強(qiáng)裂解液,于冰上靜置裂解5 min,裂解結(jié)束后12 000 r/min 4 ℃離心15 min,使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。計(jì)算后每組取等量蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳,使用220 Ma恒流2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。并使用5%的脫脂奶粉的TBST室溫下進(jìn)行封閉1 h,清洗后分別使用不同抗體進(jìn)行孵育,4 ℃過(guò)夜,室溫下使用ECL法顯色并拍照記錄。使用Image J對(duì)蛋白的灰度值進(jìn)行分析,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)肺癌干細(xì)胞 在體外適宜條件的干細(xì)胞培養(yǎng)液中形成3D懸浮腫瘤細(xì)胞球落是腫瘤干細(xì)胞的典型特征之一[11-13]。結(jié)果表明,干細(xì)胞條件培養(yǎng)液可使A549細(xì)胞形成非粘附性的懸浮腫瘤球落,與常規(guī)培養(yǎng)狀態(tài)下的A549細(xì)胞差異明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 A549細(xì)胞及干細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.2 體外培養(yǎng)干細(xì)胞CD133、SOX2、OCT4表達(dá) 與A549細(xì)胞相比,肺癌干細(xì)胞中CD133、SOX2、OCT4在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達(dá)更高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2,圖3。以上結(jié)果提示肺癌干細(xì)胞具有更高的干性,即成功建立了肺癌干細(xì)胞模型。

注:與SCM比較,*P<0.05;**P<0.01圖2 肺癌干細(xì)胞CD133、SOX2、OCT4 mRNA表達(dá)

2.3 肺金生方對(duì)肺癌干細(xì)胞自我更新能力(球落形成)抑制作用 與對(duì)照組相比,不同濃度的肺金生方提取液可抑制肺癌干細(xì)胞形成的球落數(shù)量及大小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)見(jiàn)圖4～圖5。

注:與0 g/L組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 肺金生方對(duì)肺癌干細(xì)胞球落體積的影響(×200)

注:與0 g/L組比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 肺金生方對(duì)肺癌干細(xì)胞球落形成數(shù)量的影響(×100)

2.4 肺金生方對(duì)肺癌干細(xì)胞CD133、Sox2、OCT4 mRNA表達(dá)的影響 不同濃度的肺金生方可顯著抑制肺癌干細(xì)胞中CD133、Sox2、OCT4 mRNA的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表2。

表2 各組肺癌干細(xì)胞CD133及OCT4、SOX2 mRNA表達(dá)的比較

2.5 肺金生方對(duì)肺癌干細(xì)胞Notch1通路標(biāo)志物Notch1、Jagged1 mRNA表達(dá)的影響 不同濃度的肺金生方可顯著抑制肺癌干細(xì)胞中Notch1、Jagged1 mRNA的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組肺癌干細(xì)胞Notch1、Jagged1 mRNA表達(dá)的比較

2.6 肺金生方對(duì)肺癌干細(xì)胞Notch1通路標(biāo)志物Notch1、Jagged1蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的肺金生方可顯著抑制肺癌干細(xì)胞中Notch1、Jagged1 蛋白的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注:與0 g/L組比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 肺生金方對(duì)肺癌干細(xì)胞Notch1、Jagged1 蛋白表達(dá)的作用

4 討論

在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,肺癌屬于“肺積”“咳嗽”“胸痛”等范疇,《雜病源流犀燭》認(rèn)為:“邪積胸中,阻塞氣逆,氣不得通……遂結(jié)成形而有塊”?！端貑?wèn)·玉機(jī)真藏論》詳細(xì)記載了晚期肺癌發(fā)熱、胸痛引肩背、惡液質(zhì)的癥狀,指出“大骨枯槁,大肉陷下,胸中氣滿,喘息不便,內(nèi)痛引肩項(xiàng),身熱脫肉破”。龐德湘教授經(jīng)過(guò)臨床上多年實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的總結(jié),結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究成果,自擬肺金生方以治療肺癌,該方可由“澤漆湯”化裁而來(lái),已廣泛應(yīng)用于臨床上肺癌患者的治療,可抑制肺癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、減少放化療的副作用并延長(zhǎng)患者生存期[14]。相關(guān)研究表明,肺金生方提取物可下調(diào)Lewis肺癌細(xì)胞VEGF-C與nm23的表達(dá),進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[15]。LCSC與生長(zhǎng)腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),通過(guò)抑制LCSC中α-Catulin的表達(dá)可降低LCSC的干性,發(fā)揮抑制肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用[16]。但肺金生對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用是否與調(diào)控LCSC自我更新相關(guān)仍待闡明。

2008年,研究者發(fā)現(xiàn)了一種存在于造血、神經(jīng)、內(nèi)皮和上皮譜系的未分化細(xì)胞群,可在含有表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中無(wú)限生長(zhǎng)為腫瘤球體、高表達(dá)CD133、可自我更新并產(chǎn)生無(wú)限的非致瘤細(xì)胞后代的細(xì)胞群,將其定義為L(zhǎng)CSC[17]。在肺癌的臨床治療過(guò)程中,部分表達(dá)特定分子的腫瘤細(xì)胞作為藥物作用的靶點(diǎn)被殺滅,但部分LCSC通過(guò)自我更新獲得耐藥性,通過(guò)不斷增殖成為導(dǎo)致后續(xù)腫瘤復(fù)發(fā)的主要因素[18]。CD133為一種常用于鑒定腫瘤組織中干細(xì)胞的標(biāo)記物,基因特異定位于染色體4p15,是一種5次跨膜細(xì)胞蛋白[19]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),CD133+的肺癌細(xì)胞可通過(guò)高表達(dá)ATP結(jié)合盒G2表現(xiàn)出更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力與耐藥性,CD133+肺癌細(xì)胞對(duì)于9-氨基蒽環(huán)類藥物氨柔比星的耐藥性是CD133-肺癌細(xì)胞的4.3倍,故在肺癌中CD133的高表達(dá)往往與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[17, 20, 21]。使用順鉑干預(yù)肺癌患者的SCID小鼠的腫瘤異種移植模型,可在減小腫瘤體積的同時(shí),顯著提高腫瘤組織中CD133+肺癌細(xì)胞的占比,而在后續(xù)停止順鉑干預(yù)腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)時(shí),CD133+肺癌細(xì)胞的占比又恢復(fù)至原先的水平[22]。研究表明,CD133+非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤中的血管生成擬態(tài)情況表現(xiàn)高于正常組織,且CD133的表達(dá)與患者的臨床腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均呈正相關(guān),可作為預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物[23]。在非小細(xì)胞肺癌患者中與八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)由Pou5f1基因編碼,是POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,最早于胚胎干細(xì)胞中和生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[24]。研究表明,OCT4在多種惡性腫瘤中調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的自我更新與多能性,高表達(dá)的OCT4與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān),臨床病理學(xué)相關(guān)性現(xiàn)實(shí)OCT4表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞低分化和較高的TNM分期相關(guān)[25]。OCT4在肺癌細(xì)胞中可通過(guò)激活早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因1(Egr1)的啟動(dòng)子并上調(diào)其表達(dá),以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[26-27]。另一項(xiàng)研究表明,OCT4的表達(dá)與肺腺癌患者中的STAT1表達(dá)呈正相關(guān),STAT1下游基因Mcl-1在過(guò)表達(dá)OCT4的肺癌細(xì)胞中表達(dá)增加,在人肺腫瘤異種移植模型中,沉默STAT1可抑制OCT4過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)[28]。OCT4+腫瘤細(xì)胞在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中更容易形成懸浮腫瘤球,并且其他干細(xì)胞標(biāo)志物如CD133、CD34和ALDH1的表達(dá)水平更高,在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出更高的致瘤潛力[7]。SOX2是SOX基因家族的重要成員,在干細(xì)胞中編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,該因子通過(guò)高度保守的高遷移率基團(tuán)(HMG)結(jié)構(gòu)域與DNA相互作用的,生理狀態(tài)下,SOX2存在于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核中維持細(xì)胞干性,在胚胎發(fā)育的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[29-30]。近年來(lái)研究表明,SOX2被發(fā)現(xiàn)與肺癌的進(jìn)展密切相關(guān)。其可通過(guò)上調(diào)胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11的表達(dá),增加胱氨酸攝取和谷胱甘肽合成以降低肺癌細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性[31]。一些高表達(dá)SOX2的腫瘤干細(xì)胞在其細(xì)胞表面具有ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將細(xì)胞毒性藥物泵出,阻止其與靶細(xì)胞的DNA結(jié)合,使腫瘤干細(xì)胞對(duì)藥物治療產(chǎn)生耐藥性,致使治療后腫瘤復(fù)發(fā)[32]。研究表明,SOX2在包括小細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌以及腺癌所有類型的肺癌組織中均過(guò)表達(dá),下調(diào)SOX2的表達(dá)可顯著抑制肺鱗狀細(xì)胞癌的增殖[5-6]。在非小細(xì)胞肺癌中SOX2的基因拷貝數(shù)與FGFR1和PIK3CA的表達(dá)呈正相關(guān),與肺癌患者生存率和患者預(yù)后的改善相關(guān)[33]。本研究選用無(wú)血清富集培養(yǎng)法(SFM)誘導(dǎo)培養(yǎng)LCSC,與誘導(dǎo)前的肺癌貼壁細(xì)胞相比,LCSC表達(dá)更高水平的干細(xì)胞標(biāo)志物CD133及核轉(zhuǎn)錄因子SOX2、OCT4,表明成功建立了肺癌干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。二次球落形成實(shí)驗(yàn)是研究肺癌干細(xì)胞自我更新能力的重要方法,通過(guò)觀察腫瘤干細(xì)胞懸浮球落形成的大小及數(shù)量評(píng)估干細(xì)胞的自我更新能力。本研究結(jié)果顯示肺金生方作用于肺癌干細(xì)胞后,與0 g/L相比,肺金生干預(yù)組二次球落形成數(shù)量減少,球落形成體積變小,表明肺金生方可抑制肺癌干細(xì)胞的自我更新。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肺金生方可顯著降低LCSC中干性標(biāo)志物CD133及干細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2的表達(dá)。

Notch是細(xì)胞中一種較為保守的信號(hào)通路,與癌癥生物學(xué)的多個(gè)方面密切相關(guān),如腫瘤干細(xì)胞、血管生成及腫瘤免疫信號(hào)通路等[34]。具有5 種配體,即Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4、Jagged-1和Jagged-2,以及4 個(gè)受體成員(Notch 1-4)。可通過(guò)配體結(jié)合誘導(dǎo)Notch的構(gòu)象變化,導(dǎo)致S2位點(diǎn)暴露,由蛋白酶A解聚素和金屬蛋白酶家族的成員和γ分泌酶復(fù)合物依次切割以釋放Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域至細(xì)胞核發(fā)揮作用[35]。多項(xiàng)研究表明,Notch信號(hào)通路在肺癌及肺癌干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。肺癌發(fā)展過(guò)程中Notch信號(hào)通路的異常激活可促進(jìn)肺癌干細(xì)胞的增殖,miR-211/222可通過(guò)激活Notch1信號(hào)通路,上調(diào)肺癌細(xì)胞中CD133及OCT4等干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)小鼠體內(nèi)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[36-38]。Notch1在缺氧誘導(dǎo)的CD133表達(dá)升高和化療藥物耐藥中發(fā)揮重要作用,其可介導(dǎo)Jumonji蛋白家族成員JAEID2上調(diào)肺癌細(xì)胞干性標(biāo)志物,并誘導(dǎo)腫瘤組織對(duì)順鉑的耐藥[39-40]。相關(guān)研究表明,Notch1的高表達(dá)或與肺腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān),通過(guò)靶向肺癌中Jagged1/Nocth1軸可抑制肺腺癌細(xì)胞的干細(xì)胞樣表型和腫瘤生長(zhǎng)[41-42]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺金生方提取物可顯著降低LCSC中Notch1信號(hào)通路相關(guān)分子Notch1、Jagged1在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達(dá),這可能是其抑制肺癌干細(xì)胞自我更新的作用機(jī)制。

由于LCSC具有自我更新的特性,導(dǎo)致肺癌的高復(fù)發(fā)率及高耐藥性仍是威脅患者預(yù)后及生存率的重要因素,但對(duì)于LCSC自我更新的機(jī)制仍知之甚少。本研究結(jié)果顯示肺金生方可能通過(guò)抑制Notch信號(hào)通路關(guān)鍵分子Notch1及其配體Jagged1的表達(dá),降低LCSC中干性標(biāo)志物CD133、干細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2的表達(dá),抑制LCSC的自我更新能力,發(fā)揮抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的作用。本研究揭示了肺金生方抑制肺癌的新機(jī)制,有助于肺金生方在肺癌患者的臨床治療中的應(yīng)用。但仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估詳細(xì)的機(jī)制和途徑,以更好地了解肺金生方的抗腫瘤作用。