長(zhǎng)鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1及微小RNA-874對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞功能改善的調(diào)控

陳璐 陳艷萍 段效軍 張瑾 李林瑞 郭寬鵬

支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸道炎癥性疾病[1-2]。盡管在治療方面取得了很大進(jìn)展,但哮喘仍是導(dǎo)致肺部疾病發(fā)病率和死亡率高的重要原因[3]。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)是一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA),已被報(bào)道參與多種腫瘤和疾病的發(fā)生與發(fā)展[4]。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的短鏈非編碼內(nèi)源性RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)[5]。有研究報(bào)道,miR-874的異常表達(dá)可能與過敏性鼻炎發(fā)展密切相關(guān),并參與哮喘發(fā)病過程[6]。利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),MALAT1與miR-874存在靶向調(diào)節(jié)的關(guān)系,但尚無相關(guān)研究報(bào)道。因此,本研究通過檢測(cè)血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)刺激下氣道平滑肌細(xì)胞(ASMCs)中MALAT1和miR-874的表達(dá),明確MALAT1/miR-874軸在哮喘發(fā)展的過程中對(duì)ASMCs的增殖、遷移和炎性因子分泌的作用。

材料與方法

1.材料:ASMCs購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基、Transwell小室(8 μm)購(gòu)自美國(guó)Corning公司;胎牛血清(FBS)、SYBR Green PCR Master Mix試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;PDGF-BB購(gòu)自美國(guó)R&D公司;TRIzol試劑、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司;ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司;miR-874 mimics、miR-874 inhibitor及陰性對(duì)照序列miR-NC和下調(diào)MALAT1表達(dá)的sh-MALAT及陰性對(duì)照序列sh-NC、攜帶與miR-874潛在結(jié)合位點(diǎn)的MALAT野生型(MALAT-WT)及其突變型(MALAT-MUT)序列均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司;psi-CHECK2熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自美國(guó)Promega公司;分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;雙熒光素酶分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

2.方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組:使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ASMCs過夜。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ASMCs,按Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書方法參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行轉(zhuǎn)染,使用25 ng/ml的PDGF-BB處理ASMCs,并將ASMCs分為正常培養(yǎng)的對(duì)照組(Control組)、PDGF-BB處理的PDGF-BB組[再根據(jù)處理時(shí)間分為PDGF-BB(6 h)組、PDGF-BB(12 h)組、PDGF-BB(28 h)組、PDGF-BB(24 h)組)]、PDGF-BB處理的轉(zhuǎn)染sh-MALAT組(PDGF-BB+sh-MALAT組)、PDGF-BB處理的轉(zhuǎn)染sh-NC組(PDGF-BB+sh-NC組)、PDGF-BB處理的轉(zhuǎn)染miR-874 mimics組(PDGF-BB+miR-874 mimics組)、PDGF-BB處理的轉(zhuǎn)染miR-NC組(PDGF-BB+miR-NC組)、PDGF-BB處理的聯(lián)合轉(zhuǎn)染sh-NC與miR-NC組(PDGF-BB+sh-NC+miR-NC組)、PDGF-BB處理的聯(lián)合轉(zhuǎn)染sh-NC與miR-NC組(PDGF-BB+sh-NC+miR-NC組)PDGF-BB處理的聯(lián)合轉(zhuǎn)染sh-MALAT1與miR-NC組(PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-NC組)、PDGF-BB處理的聯(lián)合轉(zhuǎn)染sh-MALAT1與miR-874 inhibitor組(PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-874 inhibitor組)。

(2)RT-PCR:采用TRIzol法提取ASMCs中總RNA,使用TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,然后按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書方法行RT-PCR檢測(cè)MALAT1、miR-874表達(dá)水平。

(3)CCK-8法:將各組ASMCs在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后向每孔加入10 μl的CCK-8試劑,在分光光度計(jì)490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度值代表細(xì)胞增殖能力,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

(4)Transwell實(shí)驗(yàn):取轉(zhuǎn)染后ASMCs按3×104個(gè)/孔接種至Transwell小室中,并加入200 μl不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),下室為600 μl按方法(3)進(jìn)行處理分組。培養(yǎng)24 h后,4%甲醛溶液固定15 min,0.4%結(jié)晶紫染色10 min,選取5個(gè)視野在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞遷移能力。

(5)ELISA試驗(yàn):取各組ASMCs的培養(yǎng)上清液,按ELISA試劑盒說明書方法檢測(cè)IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。

(6)雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn):使用在線數(shù)據(jù)庫starbase(2.0版;http://starbase.sysu.Eedu.cn)預(yù)測(cè)MALAT和miR-874之間的潛在結(jié)合位點(diǎn)。將MALAT-WT或MALAT-MUT序列和miR-874 mimics或miR-NC共同轉(zhuǎn)染入psi-CHECK2熒光素酶報(bào)告載體中,并將共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為miR-874 mimics+MALAT-WT組、miR-NC+MALAT-WT組、miR-874 mimics+MALAT-MUT組和miR-NC+MALAT-MUT組。培養(yǎng)48 h后,采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)各組ASMCs中熒光素酶活性。

結(jié) 果

1.不同PDGF-BB處理時(shí)間組ASMCs中MALAT1與miR-874表達(dá)水平比較:Control組、PDGF-BB(6 h)組、PDGF-BB(12 h)組、PDGF-BB(18 h)組及PDGF-BB(24 h)組細(xì)胞MALAT1相對(duì)水平依次升高,miR-874相對(duì)水平依次降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同PDGF-BB處理時(shí)間組ASMCs中MALAT1與miR-874表達(dá)水平比較

2.下調(diào)LncRNA MALAT1表達(dá)對(duì)ASMCs增殖與遷移能力和炎癥因子水平的影響:與Control組(1.00±0.14)比較,PDGF-BB+sh-MALAT1組(0.27±0.08)細(xì)胞MALAT1表達(dá)水平降低(P<0.01),但PDGF-BB+sh-NC組(0.94±0.18)細(xì)胞MALAT1表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。與Control組比較,PDGF-BB組、PDGF-BB+sh-NC組和PDGF-BB+sh-MALAT1組細(xì)胞增殖能力、遷移能力和細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯增強(qiáng);與PDGF-BB組比較,PDGF-BB+sh-MALAT1組細(xì)胞上述能力與指標(biāo)水平均明顯降低(P<0.05),PDGF-BB+sh-NC組無明顯改變(P>0.05)。見表2。

表2 各組ASMCs增殖與遷移能力和炎癥因子水平的影響

3.過表達(dá)miR-874對(duì)ASMCs增殖與遷移能力和炎癥因子水平的影響:與Control組(1.00±0.08)比較,PDGF-BB+miR-874 mimics組(4.17±0.28)細(xì)胞miR-874表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),PDGF-BB+miR-NC組(0.89±0.15)細(xì)胞miR-874表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。與Control組比較,PDGF-BB組、PDGF-BB+miR-NC組和PDGF-BB+miR-874 mimics組細(xì)胞增殖能力、遷移能力和細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明顯升高;與PDGF-BB組比較,PDGF-BB+miR-874 mimics組細(xì)胞上述能力與指標(biāo)水平均明顯降低(P<0.05),PDGF-BB+miR-NC組無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3 各組ASMCs增殖與遷移能力和炎癥因子水平的影響

4.MALAT1與miR-874的調(diào)控關(guān)系:在線數(shù)據(jù)庫Starbase預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,MALAT1和miR-874之間存在潛在結(jié)合位點(diǎn)。見圖1。雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與miR-NC+MALAT1-WT組細(xì)胞(1.03±0.09)比較,miR-874 mimics+MALAT1-WT組細(xì)胞(0.31±0.08)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),但miR-NC+MALAT1-MUT組(1.07±0.06)和miR-874 mimics+MALAT1-WT組(0.97±0.04)細(xì)胞熒光素酶活性改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與Control組(1.02±0.10)比較,轉(zhuǎn)染sh-MALAT1后細(xì)胞miR-874表達(dá)水平(3.62±0.26)明顯升高(P<0.01),轉(zhuǎn)染sh-NC后細(xì)胞miR-874表達(dá)水平(0.93±0.11)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 Starbase預(yù)測(cè)MALAT1和miR-874的結(jié)合位點(diǎn)

5.MALAT1/miR-874軸對(duì)ASMCs增殖與遷移能力的影響:與sh-NC+miR-NC組比較,PDGF-BB+sh-NC+miR-NC組、PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-NC組和PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-874 inhibitor組細(xì)胞增殖能力與遷移能力均明顯升高;與PDGF-BB+sh-NC+miR-NC組比較,PDGF-BB+sh-MALAT1+miR-874 inhibitor組細(xì)胞上述能力均明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組ASMCs增殖能力和遷移能力比較

討 論

ASMCs的異常增殖和遷移在哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[8]。PDGF-BB能誘導(dǎo)ASMCs增殖和遷移,常用PDGF-BB誘導(dǎo)ASMCs增殖和遷移作為體外研究哮喘中ASMCs功能障礙的細(xì)胞模型[4]。MALAT1是一種進(jìn)化上高度保守且廣泛表達(dá)的lncRNA,可參與調(diào)控多種生理病理過程[9]。在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中,MALAT1可通過靶向調(diào)控miR-149的表達(dá),上調(diào)肺上皮細(xì)胞中細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)途徑的活化水平,從而促進(jìn)髓樣分化因子88的表達(dá)和炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌[10]。在慢性阻塞性肺疾病中,MALAT1在患者肺組織中的表達(dá)異常升高,抑制MALAT1可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖并降低促纖維化細(xì)胞因子如纖維連接蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)[11]。而在哮喘的發(fā)病過程中,MALAT1的具體作用尚處在探究中。Huang等[12]在哮喘患者血清樣本中發(fā)現(xiàn)MALAT1上調(diào),miR-216a下調(diào),抑制MALAT1可增加miR-216a的表達(dá),并削弱ASMCs的增殖與遷移能力。本研究結(jié)果顯示,PDGF-BB可促進(jìn)ASMCs中MALAT1表達(dá)上調(diào),而miR-874表達(dá)被抑制,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)MALAT1或過表達(dá)miR-874均能抑制PDGF-BB作用下ASMCs增殖和遷移能力的升高,并降低細(xì)胞對(duì)炎癥因子IL-6,TNF-α和IL-1β的釋放。這與既往研究結(jié)果一致,均表明下調(diào)MALAT1的表達(dá)水平可抑制ASMCs增殖、遷移和炎癥反應(yīng)。

在哮喘中,TNF-α可顯著下調(diào)胎兒氣道平滑肌細(xì)胞中miR-874的表達(dá),并抑制細(xì)胞增殖、遷移和平滑肌細(xì)胞的重塑。這提示miR-874參與哮喘發(fā)病過程,并能對(duì)ASMCs功能發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果也表明過表達(dá)miR-874可抑制ASMCs增殖、遷移和炎癥反應(yīng)。同時(shí),本研究采用生物學(xué)信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),MALAT1與miR-874存在靶向關(guān)系,雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了兩者的調(diào)控關(guān)系。此外,在ASMCs的生物學(xué)行為中也表明,抑制miR-874表達(dá)部分抵消了下調(diào)MALAT1對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs功能的保護(hù)作用。這表明MALAT1與miR-874的相互作用影響哮喘發(fā)病中ASMCs的功能改變。

綜上所述,本研究結(jié)果表明抑制MALAT1/miR-874軸表達(dá)可通過降低細(xì)胞增殖、遷移和炎癥因子分泌在PDGF-BB誘導(dǎo)的ASMCs中發(fā)揮保護(hù)作用。