• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    胎盤WNT5A表達(dá)異常通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲參與子癇前期發(fā)生*

    2023-11-08 06:47:48孫鳳萱趙洪進(jìn)鄧建業(yè)
    關(guān)鍵詞:原代胎盤測(cè)序

    郭 玲,孫鳳萱**,趙洪進(jìn),鄧建業(yè),宋 坤,杜 鵬,李 艷***

    (1.山東大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心,濟(jì)南 250012;2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院,濟(jì)南 250021;3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科,濟(jì)南 250012;4.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100871)

    子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期高血壓疾病,多于妊娠20周后出現(xiàn),常伴有多系統(tǒng)受累和損害,發(fā)病率約為2%~8%[1-2]。PE常引起孕產(chǎn)婦HELLP綜合征、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(intrauterine growth retardation,IUGR)、早產(chǎn)等嚴(yán)重并發(fā)癥,并可增加患者及子代遠(yuǎn)期心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。胎盤形成過程中滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過淺與PE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但其具體分子機(jī)制尚未明確,缺乏有效的早期診斷和治療方法[1]。因此,深入闡明PE的發(fā)病機(jī)制并鑒定有效靶標(biāo)分子有助于針對(duì)PE及其他胎盤功能障礙相關(guān)妊娠疾病的精準(zhǔn)診療體系的建立。

    WNT/β-catenin信號(hào)通路在滋養(yǎng)細(xì)胞融合、分化、增殖、侵襲和遷移等過程中均發(fā)揮著重要作用[5]。WNT家族成員5A(WNT5A)是一種分泌蛋白,屬于β-catenin非依賴WNT通路的經(jīng)典配體,可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、極性以及分化等,在胚胎發(fā)育和器官穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[6]。目前,WNT5A在PE患者胎盤組織中的表達(dá)及其對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的調(diào)節(jié)作用仍存較大爭(zhēng)議[7-9]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族中一員,已被確定為人類子宮內(nèi)膜蛻膜化的生物標(biāo)志物,可通過激活經(jīng)典的SMAD1/5/9-SMAD4信號(hào)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)作用[10]。但BMP2對(duì)WNT信號(hào)通路的影響及其與PE的關(guān)系目前鮮少研究。本研究旨在評(píng)估胎盤WNT5A表達(dá)水平與PE嚴(yán)重程度的相關(guān)性,并探討B(tài)MP2對(duì)WNT5A表達(dá)的調(diào)控作用及PE發(fā)生的潛在分子機(jī)制,以期為PE的早期診療提供新思路。

    1 資料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 研究對(duì)象 選擇2020年5月至2020年12月于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)終止妊娠的27例PE孕婦(PE組)和38例血壓正常的健康孕婦(對(duì)照組),收集所有研究對(duì)象的胎盤組織。PE組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)妊娠20周后新發(fā)高血壓伴蛋白尿(≥0.3mg尿蛋白/24h);(2)單胎妊娠;(3)未使用輔助生殖技術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)先前存在繼發(fā)性/原發(fā)性高血壓、妊娠期糖尿病及心血管疾病;(2)患有慢性自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺自身免疫或抗磷脂綜合征等);(3)有不良孕產(chǎn)史或其他妊娠合并癥等。對(duì)照組為同期因臀位、子宮瘢痕和社會(huì)因素等選擇剖宮產(chǎn)終止妊娠的血壓正常且無(wú)其他妊娠合并癥的健康孕婦。本研究已獲得山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試者均簽署知情同意書。

    1.1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 永生化人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo購(gòu)自美國(guó)ATCC公司,細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM/高糖培養(yǎng)基。置37℃、5% CO2和95%濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育,培養(yǎng)基每隔一天更換一次。重組蛋白添加前,將細(xì)胞維持在含0.1% FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM/高糖培養(yǎng)基中饑餓處理24h。

    1.1.3 人類原代絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous trophoblasts,EVT)分離和培養(yǎng) 人類原代EVT于人類孕早期(妊娠6~9周)的新鮮絨毛組織中機(jī)械分離得到[11-12]。分離純化的人類原代EVT細(xì)胞使用含10% FBS和1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    1.1.4 主要試劑 DMEM/高糖培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、FBS均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;青霉素-鏈霉素、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)GE Hyclone公司;人重組BMP2和WNT5A蛋白均購(gòu)自美國(guó)R&D公司;WNT5A Taqman引物購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;α-Tubulin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;WNT5A、β-catenin抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司;8μm Transwell培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 去生長(zhǎng)因子的Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶8稀釋混勻,50μL/孔覆蓋Transwell小室,37℃溫箱,靜置2h。每個(gè)小室中用250μL含0.1% FBS的DMEM培養(yǎng)基種植5×104個(gè)細(xì)胞,小室下方加750μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱中靜置孵育36h,棉簽擦去小室膜內(nèi)側(cè)未侵襲的細(xì)胞,用預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞20min,PBS沖洗,Hoechst33258染細(xì)胞核30min。在熒光顯微鏡下拍照,每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞數(shù)后取平均值。

    1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 使用Trizol Reagent提取胎盤組織和細(xì)胞總RNA,檢測(cè)RNA濃度和純度。使用Prime Script RT reagent Kit進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,并將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔重復(fù)檢驗(yàn),GAPDH為參照,采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量相對(duì)值。引物序列:WNT5A-F:CCTGAAGGAGAAGTACGACAG,WNT5A-R:CCTGAAGGAGAAGTACGACAG;GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT,GAPDH-R:GACAAGCTTCCCGTTCTCAG。

    1.2.3 蛋白免疫印跡 使用含適量蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。使用BCA試劑盒按說明書檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1h,加一抗4℃過夜孵育,TBST洗膜,加相應(yīng)二抗,室溫?fù)u床孵育1h,用ECL法化學(xué)發(fā)光后采集圖像。

    1.2.4 RNA-seq測(cè)序 將經(jīng)空白對(duì)照和外源性BMP2處理24h后的HTR8/SVneo細(xì)胞,干冰冷凍寄送生物公司進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。提取mRNA,PCR擴(kuò)增,2%瓊脂糖凝膠回收目的條帶,定量后按比例混合上機(jī)。橋式PCR擴(kuò)增生成clusters,Illumina Hiseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因注釋和富集,篩選Cut offP≤0.05,fold change≥2的基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 正常組與PE組患者的一般資料比較 PE組分娩時(shí)體重、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)、平均動(dòng)脈壓、早產(chǎn)率及小于孕齡兒(small for gestational age infant,SGA)比例均高于正常對(duì)照組,而分娩孕周和新生兒出生體重均低于正常對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

    表1 PE組與Control組患者一般資料比較

    2.2 WNT5A在PE胎盤中表達(dá)降低 RT-qPCR結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,PE組胎盤組織中WNT5A表達(dá)水平明顯降低(P<0.0001)(圖1)。

    圖1 WNT5A在PE胎盤組織中表達(dá)水平****P<0.001

    2.3 胎盤WNT5A mRNA水平與PE嚴(yán)重程度相關(guān) 與對(duì)照組相比,PE組血清肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amintransferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但各項(xiàng)指標(biāo)均在臨床正常值范圍內(nèi)(表2)。胎盤WNT5A可較好地用于評(píng)估PE嚴(yán)重程度,曲線下面積(area under curve,AUC)為0.844(95%CI為0.74~0.95,P<0.001)(圖2)。

    圖2 胎盤WNT5A水平與PE嚴(yán)重程度相關(guān)

    表2 PE組與Control組患者相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

    2.4 WNT5A促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲并抑制β-catenin活性 HTR8/SVneo細(xì)胞暴露于含人重組WNT5A蛋白(200ng/mL)的DMEM培養(yǎng)基中并進(jìn)行Transwell侵襲力測(cè)定,結(jié)果顯示,WNT5A處理組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01)(圖3A)。人原代EVT細(xì)胞中,Western blot法結(jié)果顯示,與空白對(duì)照相比,WNT5A處理組降低活化β-catenin蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3B)。

    2.5 BMP2下調(diào)WNT5A表達(dá) HTR8/SVneo細(xì)胞經(jīng)人重組BMP2蛋白(25ng/mL)處理24h后,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNAseq)結(jié)果火山圖顯示W(wǎng)NT5A mRNA水平顯著降低(圖4A);差異顯著的基因主要富集于“TGF-β信號(hào)通路”、“WNT信號(hào)通路”和“細(xì)胞黏附”等相關(guān)的信號(hào)通路中(圖4B)。

    圖4 BMP2處理人滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄譜測(cè)序分析A:BMP2和空白對(duì)照處理后(n=3)差異表達(dá)基因的火山圖;B:差異表達(dá)基因所在的信號(hào)通路富集分析結(jié)果

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNAseq結(jié)果,使用25ng/mL人重組BMP2蛋白分別處理HTR8/SVneo和人類原代EVT細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置3、6、12、24h時(shí)間梯度,RT-qPCR結(jié)果表明BMP2降低了HTR8/SVneo細(xì)胞和人類原代EVT細(xì)胞中WNT5A mRNA水平(圖5A、B)。Western blot法結(jié)果顯示,BMP2降低了WNT5A蛋白表達(dá)水平,但增加了細(xì)胞內(nèi)活化的β-catenin蛋白水平(圖5C~H)。

    圖5 BMP2對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞WNT5A和β-catenin表達(dá)的影響A、B:RT-qPCR檢測(cè)WNT5A mRNA表達(dá);C~H:Western blot法檢測(cè)WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá);*P<0.05,**P<0.01,****P<0.01

    2.6 BMP2通過激活SMAD1/5/9-SMAD4通路負(fù)調(diào)控WNT5A表達(dá) HTR8/SVneo細(xì)胞先用DMSO或BMP2受體抑制劑DMH-1預(yù)處理1h,經(jīng)人重組BMP2蛋白(25ng/mL)或空白對(duì)照處理24h,RT-qPCR結(jié)果顯示BMP2受體抑制劑DMH-1預(yù)處理可阻斷BMP2對(duì)WNT5A mRNA水平的下調(diào)(圖6A)。Western blot法結(jié)果顯示BMP2可上調(diào)磷酸化的SMAD1/5/9蛋白的表達(dá)(圖6B),并且DMH-1預(yù)處理可消除BMP2介導(dǎo)的這一作用(圖6C)。

    圖6 BMP2受體抑制劑DMH-1阻斷BMP2激活SMAD1/5/9通路介導(dǎo)的WNT5A下調(diào)A:RT-qPCR測(cè)定WNT5A mRNA表達(dá);B:Western blot法檢測(cè)SMAD1/5/9蛋白表達(dá);C:Western blot法檢測(cè)磷酸化SMAD1/5/9蛋白表達(dá)

    2.7 WNT5A參與PE發(fā)生的作用模式圖 母胎界面WNT5A表達(dá)不足通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程,引起胎盤發(fā)育異常,導(dǎo)致PE發(fā)生(圖7)。

    3 討 論

    PE是妊娠期常見的胎盤源性疾病,嚴(yán)重影響母胎健康,是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)期胎兒死亡的主要原因之一[13]。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為,妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲受損和胎盤螺旋動(dòng)脈重塑不足是PE發(fā)生發(fā)展中的重要事件,而蛻膜化異常在PE發(fā)生過程中的作用亦得到越來越多的關(guān)注[14]。在胎盤形成和母胎界面建立的過程中,人類滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)子宮內(nèi)膜這一過程受到多種分子的精確調(diào)控。已有研究報(bào)道WNT5A在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力參與PE發(fā)生過程中的作用,但BMP2信號(hào)通路與WNT5A抑制的Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間的相互作用及其在PE發(fā)生機(jī)制中的作用尚未明確。

    WNT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化、組織再生和器官穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,與母胎界面建立以及妊娠維持密切相關(guān)[15-17]。WNT通路包括經(jīng)典β-catenin依賴通路和非經(jīng)典非β-catenin依賴通路。經(jīng)典WNT信號(hào)通路分子如WNT2、WNT4、β-catenin等在胎盤多種細(xì)胞中表達(dá),可通過調(diào)控蛻膜細(xì)胞或滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為參與PE的發(fā)生發(fā)展[18-20]。然而非經(jīng)典WNT通路分子在調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞行為及PE進(jìn)程中的作用目前仍存爭(zhēng)議。WNT5A是非經(jīng)典WNT信號(hào)通路的重要配體,并且能通過抑制或促進(jìn)其他WNT配體的表達(dá)影響經(jīng)典WNT通路。WNT5A在多種腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用,但其作用存在較大異質(zhì)性,如在卵巢癌中WNT5A可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT和侵襲過程;而在乳腺癌中WNT5A被認(rèn)為可抑制腫瘤細(xì)胞的EMT和侵襲[21]。在女性生殖系統(tǒng)中,WNT5A存在胎盤成纖維細(xì)胞、胎盤巨噬細(xì)胞和多種滋養(yǎng)細(xì)胞亞型中[22-23],但其對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響及其分子作用機(jī)制亟待進(jìn)一步明確。Chen等研究發(fā)現(xiàn),WNT5A可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲[24]。本研究發(fā)現(xiàn),外源性補(bǔ)充人重組WNT5A蛋白可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲,這與Takahashi等研究結(jié)果一致[7,9,25]。本研究發(fā)現(xiàn),WNT5A處理后β-catenin的活性被抑制,這與先前在人類絨毛膜癌中的研究結(jié)果相一致[26]。本研究還發(fā)現(xiàn),PE患者胎盤組織中WNT5A表達(dá)水平顯著下調(diào),提示W(wǎng)NT5A表達(dá)受損可介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足,從而參與PE發(fā)生。

    TGF-β超家族成員BMP2在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞的多種亞型中均有表達(dá),已被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜蛻膜化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[27]。蛻膜化過程異常能導(dǎo)致胚胎著床時(shí)期的子宮微環(huán)境發(fā)生改變,影響隨后的滋養(yǎng)細(xì)胞分化及胎盤發(fā)育[28]。既往研究表明,在成骨分化過程中,BMP2與WNT信號(hào)通路關(guān)系密切[29]。骨分化與滋養(yǎng)細(xì)胞分化有一定相似性,本研究基于外源性人重組BMP2蛋白處理的人滋養(yǎng)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄圖譜結(jié)果,并在人滋養(yǎng)細(xì)胞系和原代EVT細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)BMP2可顯著下調(diào)WNT5A表達(dá),上調(diào)細(xì)胞內(nèi)活化β-catenin水平。隨后對(duì)BMP2調(diào)控下游基因表達(dá)的經(jīng)典SMAD信號(hào)通路檢測(cè),發(fā)現(xiàn)BMP2可激活經(jīng)典SMAD1/5/9通路負(fù)調(diào)控WNT5A的表達(dá),并且這一作用可被BMP2受體抑制劑所阻斷。以上發(fā)現(xiàn)提示,BMP2可通過激活經(jīng)典的SMAD1/5/9通路抑制WNT5A表達(dá),從而降低了WNT5A對(duì)于經(jīng)典WNT/β-catenin信號(hào)通路的抑制,進(jìn)而影響PE病理進(jìn)程。

    綜上所述,WNT5A在PE患者胎盤組織中表達(dá)降低,其表達(dá)受到BMP2及激活的SMAD1/5/9信號(hào)通路調(diào)控。母胎界面WNT5A表達(dá)不足通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程,引起胎盤發(fā)育異常,導(dǎo)致PE發(fā)生。本研究為后續(xù)揭示W(wǎng)NT5A在PE發(fā)生發(fā)展中潛在作用的研究提供了創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),但由于PE病因的復(fù)雜性和疾病分類的多樣性,本研究未對(duì)WNT5A在特定臨床背景下對(duì)PE的調(diào)控作用進(jìn)行探究,如早發(fā)型PE和晚發(fā)型PE之間胎盤病變存在的差異等,且研究納入的樣本量相對(duì)較少,未來仍有待進(jìn)一步的深入研究。

    猜你喜歡
    原代胎盤測(cè)序
    杰 Sir 帶你認(rèn)識(shí)宏基因二代測(cè)序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    二代測(cè)序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    被診斷為前置胎盤,我該怎么辦
    改良無(wú)血清法培養(yǎng)新生SD乳鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞
    新生大鼠右心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
    被診斷為前置胎盤,我該怎么辦
    艾迪注射液對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP1A2、CYP3A2酶活性的影響
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:32
    基因捕獲測(cè)序診斷血癌
    單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展
    橋粒芯糖蛋白1、3 在HaCaT 細(xì)胞、A431 細(xì)胞及原代角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)
    亚洲国产毛片av蜜桃av| 18禁观看日本| 男人舔女人的私密视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产欧美亚洲国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品 欧美亚洲| 午夜福利,免费看| 大片电影免费在线观看免费| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久精品国产亚洲av高清一级| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黄片小视频在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产成人免费观看mmmm| 亚洲欧美一区二区三区久久| av天堂在线播放| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲中文日韩欧美视频| 老司机靠b影院| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 妹子高潮喷水视频| 另类亚洲欧美激情| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲av男天堂| 精品高清国产在线一区| 亚洲专区字幕在线| 日日爽夜夜爽网站| 日韩一区二区三区影片| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黑丝袜美女国产一区| 国产日韩欧美在线精品| 成年av动漫网址| 丁香六月天网| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产成人免费无遮挡视频| 久9热在线精品视频| 一区二区三区精品91| 老司机午夜福利在线观看视频 | 午夜精品久久久久久毛片777| 精品福利永久在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 99国产综合亚洲精品| 欧美在线一区亚洲| 热99re8久久精品国产| 黄色怎么调成土黄色| 丝袜脚勾引网站| 在线观看一区二区三区激情| 久久99一区二区三区| 桃花免费在线播放| 欧美性长视频在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 黑丝袜美女国产一区| 国产一区二区在线观看av| 精品少妇内射三级| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产成人影院久久av| 国产野战对白在线观看| 搡老岳熟女国产| 9色porny在线观看| 一本综合久久免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品视频人人做人人爽| tube8黄色片| av欧美777| 久热这里只有精品99| 国产精品二区激情视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 韩国高清视频一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产黄频视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲av欧美aⅴ国产| 99久久精品国产亚洲精品| 一级毛片电影观看| 91麻豆av在线| www.熟女人妻精品国产| 国产精品99久久99久久久不卡| 男女无遮挡免费网站观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 老司机午夜福利在线观看视频 | 我的亚洲天堂| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久人妻熟女aⅴ| 黑丝袜美女国产一区| 女性生殖器流出的白浆| 狠狠狠狠99中文字幕| 中文字幕色久视频| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 精品人妻在线不人妻| 欧美精品一区二区大全| 精品第一国产精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 色94色欧美一区二区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 五月天丁香电影| 美女中出高潮动态图| 美女大奶头黄色视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲精品成人av观看孕妇| 蜜桃在线观看..| 欧美精品一区二区免费开放| 久久精品国产综合久久久| 少妇精品久久久久久久| 久久久久国内视频| 大码成人一级视频| 日韩有码中文字幕| 欧美黄色片欧美黄色片| 高清在线国产一区| 人妻 亚洲 视频| 亚洲精品一二三| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 久久亚洲精品不卡| 国产黄频视频在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 少妇精品久久久久久久| 18在线观看网站| 亚洲情色 制服丝袜| 妹子高潮喷水视频| 成人av一区二区三区在线看 | 美女主播在线视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久久欧美国产精品| 两性夫妻黄色片| 午夜免费鲁丝| av在线老鸭窝| 亚洲人成电影观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 日本欧美视频一区| 最新的欧美精品一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产色视频综合| 国产99久久九九免费精品| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 色播在线永久视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 美女中出高潮动态图| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产高清视频在线播放一区 | cao死你这个sao货| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 午夜福利在线观看吧| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲全国av大片| 亚洲九九香蕉| 国产精品一区二区免费欧美 | 亚洲综合色网址| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美国产精品一级二级三级| www.自偷自拍.com| 美女大奶头黄色视频| 天堂8中文在线网| 成人国产一区最新在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美国产精品va在线观看不卡| 九色亚洲精品在线播放| 日本一区二区免费在线视频| 国产精品 国内视频| 亚洲综合色网址| 一本大道久久a久久精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 麻豆av在线久日| 国产区一区二久久| 在线 av 中文字幕| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 飞空精品影院首页| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 少妇 在线观看| 亚洲国产精品999| 国产欧美日韩一区二区精品| 大片免费播放器 马上看| 波多野结衣av一区二区av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美日韩精品网址| 国产精品久久久人人做人人爽| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩制服丝袜自拍偷拍| 黄色视频,在线免费观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 欧美激情 高清一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 国产97色在线日韩免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲男人天堂网一区| 国产色视频综合| av又黄又爽大尺度在线免费看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品亚洲成a人片在线观看| 婷婷成人精品国产| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲第一青青草原| 99热国产这里只有精品6| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品99久久99久久久不卡| 人妻 亚洲 视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产成人av激情在线播放| 中文字幕制服av| 亚洲七黄色美女视频| 欧美中文综合在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 在线天堂中文资源库| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 91精品国产国语对白视频| 国产在线一区二区三区精| 国产成人精品在线电影| 国产男人的电影天堂91| 日韩一区二区三区影片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲成人免费av在线播放| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 少妇人妻久久综合中文| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 欧美日韩视频精品一区| 一级毛片精品| 91字幕亚洲| 免费高清在线观看日韩| 久久久久国产一级毛片高清牌| 女性被躁到高潮视频| 十八禁高潮呻吟视频| av网站免费在线观看视频| 免费av中文字幕在线| 69精品国产乱码久久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 国产国语露脸激情在线看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 激情视频va一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 久久ye,这里只有精品| 999精品在线视频| 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久久久网色| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费不卡黄色视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲国产av影院在线观看| 一本久久精品| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产精品.久久久| 伊人亚洲综合成人网| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费av中文字幕在线| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 日本a在线网址| 99久久人妻综合| 免费在线观看完整版高清| 大型av网站在线播放| 日本一区二区免费在线视频| 各种免费的搞黄视频| 黄色毛片三级朝国网站| 久久综合国产亚洲精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 夜夜夜夜夜久久久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 午夜91福利影院| av免费在线观看网站| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 捣出白浆h1v1| 国产福利在线免费观看视频| 日韩视频一区二区在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线观看免费午夜福利视频| 国产成人欧美在线观看 | 久久久国产成人免费| av片东京热男人的天堂| 一级片'在线观看视频| 国产精品一区二区在线不卡| 日日爽夜夜爽网站| 午夜激情av网站| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男女免费视频国产| 91大片在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 国产成人精品在线电影| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 性色av一级| 久久女婷五月综合色啪小说| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲专区字幕在线| 一二三四社区在线视频社区8| 一进一出抽搐动态| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲精品美女久久av网站| 人人妻人人澡人人看| 国产精品熟女久久久久浪| 精品一区二区三卡| 波多野结衣一区麻豆| 午夜日韩欧美国产| 在线观看一区二区三区激情| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品影院久久| 在线看a的网站| 成人影院久久| 亚洲少妇的诱惑av| 久久久久久久久久久久大奶| 国产1区2区3区精品| tube8黄色片| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| a 毛片基地| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲av电影在线进入| 亚洲第一青青草原| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲av片天天在线观看| av线在线观看网站| 国产精品偷伦视频观看了| 精品高清国产在线一区| 美女中出高潮动态图| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产成人影院久久av| 99久久99久久久精品蜜桃| 蜜桃在线观看..| 精品福利永久在线观看| 久久久久视频综合| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 91国产中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 制服人妻中文乱码| 搡老岳熟女国产| 一级片免费观看大全| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美中文综合在线视频| 不卡一级毛片| 亚洲国产日韩一区二区| 国产黄频视频在线观看| av电影中文网址| 亚洲第一青青草原| 国产精品免费大片| 国产又爽黄色视频| 少妇人妻久久综合中文| 中文字幕制服av| 国产av又大| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日韩视频一区二区在线观看| 成人免费观看视频高清| 国产一区二区在线观看av| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品一区蜜桃| 91av网站免费观看| 91老司机精品| 在线观看一区二区三区激情| av网站免费在线观看视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧美激情在线| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品熟女少妇八av免费久了| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品一品国产午夜福利视频| 制服诱惑二区| 国产男人的电影天堂91| 精品国产国语对白av| 精品亚洲成a人片在线观看| 男女免费视频国产| 男女国产视频网站| 激情视频va一区二区三区| 亚洲中文av在线| 国产在线视频一区二区| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 欧美日韩精品网址| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 老司机深夜福利视频在线观看 | 超色免费av| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品99久久99久久久不卡| 一级片免费观看大全| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 女性被躁到高潮视频| 欧美xxⅹ黑人| 91精品国产国语对白视频| 亚洲第一青青草原| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 男女床上黄色一级片免费看| 国产免费现黄频在线看| 色婷婷av一区二区三区视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品影院久久| 天堂中文最新版在线下载| 免费av中文字幕在线| 精品福利观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜精品久久久久久毛片777| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文字幕av电影在线播放| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人精品无人区| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美日韩黄片免| videosex国产| 午夜成年电影在线免费观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 交换朋友夫妻互换小说| 一级毛片女人18水好多| tube8黄色片| 麻豆国产av国片精品| 女人久久www免费人成看片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产av精品麻豆| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产国语露脸激情在线看| www日本在线高清视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 人人澡人人妻人| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品第一国产精品| 国产一卡二卡三卡精品| √禁漫天堂资源中文www| 午夜福利乱码中文字幕| 日韩大片免费观看网站| 久久狼人影院| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 三上悠亚av全集在线观看| 久9热在线精品视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 丝袜在线中文字幕| 少妇人妻久久综合中文| 无遮挡黄片免费观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 成人av一区二区三区在线看 | 国产成人a∨麻豆精品| 99国产综合亚洲精品| 黑人操中国人逼视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 搡老乐熟女国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国精品久久久久久国模美| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 欧美xxⅹ黑人| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久99一区二区三区| 超碰成人久久| 最新的欧美精品一区二区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成人手机av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 69精品国产乱码久久久| 少妇粗大呻吟视频| 国产麻豆69| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久精品成人免费网站| 欧美精品亚洲一区二区| 久久中文字幕一级| av免费在线观看网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产亚洲一区二区精品| 免费人妻精品一区二区三区视频| 热99re8久久精品国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 极品人妻少妇av视频| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 无遮挡黄片免费观看| 十八禁人妻一区二区| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲成人免费av在线播放| tocl精华| 水蜜桃什么品种好| 成人免费观看视频高清| 欧美精品av麻豆av| 国产野战对白在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 啦啦啦啦在线视频资源| 一区在线观看完整版| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品久久蜜臀av无| 精品人妻在线不人妻| www.熟女人妻精品国产| 精品一品国产午夜福利视频| 看免费av毛片| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一本久久精品| 青草久久国产| 久久久久久久国产电影| 一进一出抽搐动态| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 大码成人一级视频| 一个人免费在线观看的高清视频 | 欧美97在线视频| 久久久国产一区二区| 午夜福利乱码中文字幕| 国精品久久久久久国模美| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 午夜影院在线不卡| 少妇粗大呻吟视频| 老司机福利观看| 飞空精品影院首页| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲av成人一区二区三| 18禁国产床啪视频网站| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 女性生殖器流出的白浆| 国产日韩一区二区三区精品不卡| av线在线观看网站| 亚洲精品自拍成人| 又黄又粗又硬又大视频| 国产在线视频一区二区| 国产片内射在线| 97在线人人人人妻| 久久九九热精品免费| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 久久狼人影院| av片东京热男人的天堂| 波多野结衣av一区二区av| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲专区字幕在线| 精品视频人人做人人爽| 国产色视频综合| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美 日韩 精品 国产| 99精品久久久久人妻精品| 乱人伦中国视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日本vs欧美在线观看视频| 三上悠亚av全集在线观看| 久久久久国内视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 免费少妇av软件| 亚洲av欧美aⅴ国产| 丰满少妇做爰视频| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 黄片小视频在线播放| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲av美国av| 精品久久蜜臀av无| 91成人精品电影| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 9191精品国产免费久久| 成人免费观看视频高清| 国产成人a∨麻豆精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 色视频在线一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产不卡av网站在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 69av精品久久久久久 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区| av线在线观看网站| 免费看十八禁软件| 丝袜美足系列| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美精品av麻豆av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久|