內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療對肝硬化食管胃底靜脈曲張患者口腔和腸道菌群的影響

任海霞,李淑霞,郭永澤,平付敏,牛淑利,王建華,郭曉會,閆華楠

(1. 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 邯鄲 056000;2. 河北工程大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河北 邯鄲 056000)

肝硬化失代償期的患者常發(fā)生腹水、肝性腦病、食管胃底靜脈曲張出血等并發(fā)癥。其中食管胃底靜脈曲張出血最為嚴(yán)重,根據(jù)2019年《肝硬化診治指南》[1]推薦,臨床上二級預(yù)防的一線治療首推內(nèi)鏡聯(lián)合藥物干預(yù)。目前的內(nèi)鏡技術(shù)包括食管胃底曲張靜脈套扎術(shù)、硬化劑注射術(shù)和組織膠注射術(shù),注射硬化劑可以損傷血管內(nèi)皮,進(jìn)一步引起靜脈內(nèi)膜炎、血栓形成[2],最后曲張靜脈逐漸機(jī)化直至消失;組織膠與血液會迅速固化,也可產(chǎn)生局部炎癥,使血管纖維化[3]?？祻?fù)新液為中成藥,來源于美洲蟑螂體內(nèi)的有效成分,有通利血脈、養(yǎng)陰生肌的功效[4]。從上個世紀(jì)開始,有關(guān)肝臟疾病與菌群改變的研究不斷深入,逐漸形成了口腔-腸-肝軸理論,目前關(guān)于內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液干預(yù)對肝硬化食管胃底靜脈曲張患者口腔和腸道菌群是否有影響尚不明確,本研究通過測序肝硬化食管胃底靜脈曲張患者經(jīng)內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療前后的唾液樣本和糞便樣本,分析了內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療對口腔和腸道菌群影響,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2021年6月—2022年9月在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院、邯鄲市傳染病醫(yī)院擇期接受內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療的肝硬化食管胃底靜脈曲張患者17例作為研究對象,男11例,女6例;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)29.20(22.10,41.75)IU/L,谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)29.90(26.35,34.60)IU/L,總膽紅素(TBil)24.30(16.70,34.30)μmol/L,直接膽紅素(DBil)7.70(5.10,11.40)μmol/L,間接膽紅素(IBil)16.60(10.60,22.30)μmol/L,白蛋白(ALB)(39.45±5.18)g/L,凝血酶原時間(PT)14.90(13.00,16.05)s?；颊呔稀陡斡不\治指南》[1]中肝硬化食管胃底靜脈曲張診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除伴其他系統(tǒng)重大疾病及惡性腫瘤者;有牙科病史和口腔檢查發(fā)現(xiàn)任何有活動性牙齦或牙周病者;合并慢性腹瀉、炎癥性腸病等可引起腸道菌群紊亂的患者;有胃腸道手術(shù)史者;1個月內(nèi)使用過抗生素及益生菌者。本研究通過了河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會的審核,且所有參與的患者均已知情同意。

1.2樣本采集 分別于內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療前1～3 d共收集唾液17份、糞便17份,治療3 d后、治療7 d后各收集唾液樣本17份、糞便樣本17份。

1.2.1唾液采集 所有研究對象至少在樣本收集2 h前不進(jìn)食、不飲水、不刷牙。在收集過程中,受試者手拿無菌、無酶收集管,口含唾液至少1 min,隨后使唾液流入試管中,收集量2～5 mL,2 h內(nèi)送至實驗室-86 ℃冰箱保存。

1.2.2糞便采集 用糞便取樣器留取糞便中段里部50～100 mg樣本,每樣留存2～3管備份,2 h內(nèi)放入-86 ℃超低溫冰箱保存,采集管要求無菌、密封,采集過程中避免尿液等污染。

1.3DNA提取、16S rRNA基因文庫制備及信息分析 將唾液和糞便樣本放入裂解液中裂解離心,得到樣品DNA進(jìn)行NanoDrop樣品濃度檢測和1%瓊脂糖凝膠樣品完整性檢測。取唾液或糞便樣品與融合擴(kuò)增引物配置PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增后,用Agencourt AMPure XP 磁珠進(jìn)行純化,溶于Elution Buffer內(nèi),文庫構(gòu)建完成。使用Agilent 2100 Bioanalyzer儀器檢測文庫片段的濃度和總量片段大小。檢測合格的樣本pooling后,采用Illumina Hiseq 2500測序儀進(jìn)行測序,測序類型為PE300,測序得到的Raw data經(jīng)過過濾獲得Clean data。通過reads之間的互相重疊關(guān)系將reads拼接成Tags,聚類成OTU并與數(shù)據(jù)庫比對、物種注釋;基于OTU和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種分析。

2 結(jié) 果

2.1OTU聚類花瓣圖 3個時間點檢測的唾液和糞便樣本中共同擁有不重復(fù)的137個OTU,治療前唾液獨有40個OTU,治療3 d后唾液擁有5個不重復(fù)OTU,治療7 d后唾液獨有34個OTU;治療前糞便獨有11個OTU,治療3 d后糞便獨有75個OTU,治療7 d后糞便獨有6個OTU。見圖1。

圖1 肝硬化食管胃底靜脈曲張患者治療前后唾液、糞便OTU統(tǒng)計的花瓣圖

2.2唾液、糞便部分物種相對豐度 在唾液樣本中,3個時間點檢測的韋榮球菌屬在治療后豐度處于上升趨勢,而梭桿菌屬、嗜血桿菌屬、顆粒鏈菌屬、巨球形菌屬則處于逐漸下降的趨勢。3個時間點檢測的糞便樣本中普氏菌屬比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05),治療前和治療7 d后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026);韋榮球菌屬、布勞特菌屬、顫螺旋菌屬呈現(xiàn)出逐漸上升的變化,巨球形菌屬、梭桿菌屬在治療后出現(xiàn)下降的趨勢,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 肝硬化食管胃底靜脈曲張患者治療前后唾液、糞便屬水平上部分優(yōu)勢菌群相對豐度 %

2.3唾液樣本GraPhlAn 物種組成圖 由圖2可見,從門水平上分析,3個時間點檢測的唾液、糞便樣本中的優(yōu)勢菌群為Bacteroidetes(擬桿菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)和Proteobacteria(變形菌門)等。3個時間點檢測的唾液樣本中的優(yōu)勢菌屬是擬桿菌門中的Prevotella(普氏菌屬),其次是厚壁菌門中的Veillonella(韋榮球菌屬)。3個時間點檢測的糞便樣本從屬水平上分析,豐度由大到小依次是Bacteroides(擬桿菌屬)、FaecaliBacterium(糞桿菌屬)、Escherichia(埃希桿菌屬)、Prevotella(普氏菌屬)等。

圖2 肝硬化食管胃底靜脈曲張患者治療前后唾液、糞便樣本GraphlAn圖

2.4Alpha多樣性分析 3個時間點檢測的唾液、糞便樣本間Ace、Shannon指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),但各時間點唾液樣本Ace指數(shù)的均數(shù)呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,且治療7 d后的指數(shù)要高于治療前;3個時間點檢測的糞便標(biāo)本間Ace、Shannon指數(shù)的均數(shù)(中位數(shù))呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,且治療7 d后的數(shù)值要稍高于治療前,說明內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療后腸道菌群多樣性有升高的趨勢。見表2。

表2 肝硬化食管胃底靜脈曲張患者治療前后唾液、糞便菌群多樣性指數(shù)比較

2.5糞便標(biāo)本菌群分型分析 3個時間點檢測的糞便樣本被聚類為三類腸型,其中治療前和治療7 d后糞便標(biāo)本絕大多數(shù)聚集在腸型1,治療3 d后糞便標(biāo)本主要聚集在腸型2和腸型3。見圖3。

圖3 肝硬化食管胃底靜脈曲張患者治療前后糞便標(biāo)本菌群分型分析圖

3 討 論

本研究采用同一批肝硬化食管胃底靜脈曲張患者經(jīng)內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療前后患者的唾液樣本和糞便樣本,它們擁有共同的137個OTU。經(jīng)內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療后口腔菌群豐度有增加的趨勢。從屬水平上可見3個時間點檢測的唾液中物種相對豐度占前兩位的是普氏菌屬和韋榮球菌屬,顆粒鏈菌屬、巨球形菌屬均處于下降的態(tài)勢。顆粒鏈菌屬屬于人類口腔常見的優(yōu)勢菌,無動力、不形成芽孢的革蘭陽性球菌,除了與口腔疾病有密切關(guān)系外,還與機(jī)體多系統(tǒng)疾病有關(guān)聯(lián)[5]。加州大學(xué)一項關(guān)于30例肝硬化患者的研究發(fā)現(xiàn),顆粒鏈菌屬在肝硬化合并肝性腦病的患者中比肝硬化無肝性腦病的患者增加3.1倍[6]。國外關(guān)于健康人和患有牙周疾病人群的口腔微生物高通量測序發(fā)現(xiàn),患有牙周疾病的人口腔中含有大量的巨球形菌屬[7]。Bajaj等[8]發(fā)現(xiàn)在肝性腦病與肝硬化未合并肝性腦病的糞便微生物無差別,可在肝性腦病患者的乙狀結(jié)腸黏膜中發(fā)現(xiàn)巨球形菌屬異常存在。這兩種致病菌屬相對豐度在治療后處于下降趨勢,說明內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療對患者的口腔環(huán)境有改善作用。

對治療前后糞便樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn),內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療對腸道菌群的多樣性產(chǎn)生了影響。屬水平上,3個時間點檢測的糞便樣本中普氏菌屬相對豐度構(gòu)成上具有明顯的差異,巨球形菌屬、梭桿菌屬等處于依次下降的走向,布勞特菌屬、顫螺旋菌屬處于上升的趨勢。布勞特菌屬是一類厭氧型、發(fā)酵分解有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的菌群,可利用氫氣和二氧化碳作為主要能源,它的葡萄糖代謝產(chǎn)物包括乙酸酯、乙醇、氫、乳酸和琥珀酸,具有7-α去羥基化的作用,使初級膽汁酸代謝為次級膽汁酸。研究發(fā)現(xiàn)肝硬化患者腸道環(huán)境由微生物和消化器官分泌的因子相互作用,比如膽汁酸的代謝,Durand等[9]發(fā)現(xiàn)晚期肝硬化患者腸道內(nèi)的布勞特菌屬相對豐度降低,晚期肝硬化患者比早期肝硬化患者和健康人的次級膽汁酸/初級膽汁酸的比率要低。

糞便樣本被聚類為三類腸型,每種腸型會發(fā)生不同的功能變異[10]。腸型1富含具有糖分解能力的擬桿菌屬,而且編碼降解碳水化合物和蛋白質(zhì)的消化酶基因也在這種腸型中富集[11]。腸型2富含普氏菌屬和脫硫弧菌屬,普氏菌屬是一種已知的黏蛋白降解菌,而脫硫弧菌屬可以通過去除硫酸鹽來加強(qiáng)黏蛋白脫硫步驟,兩者協(xié)同可以降解腸黏膜層的黏蛋白和糖蛋白[12]。腸型3主要富含可降解黏蛋白的瘤胃球菌屬和阿克曼菌屬,也富含膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,這暗示這些菌屬的存在可以吸收由黏蛋白結(jié)合隨后水解產(chǎn)生的單糖[13]。本研究發(fā)現(xiàn)治療前和治療7 d后糞便標(biāo)本絕大多數(shù)聚集在腸型1,治療3 d后糞便標(biāo)本主要聚集在腸型2和腸型3,可見探究內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療不同階段的腸道菌群腸型有助于預(yù)測菌群的功能,為使用益生菌干預(yù)腸道功能提供新的方向。

食管胃底靜脈曲張可影響胃黏膜血液循環(huán),被輸送到肝臟的毒素不能被及時清除,食管下端括約肌解剖結(jié)構(gòu)受到影響,胃內(nèi)的食物反流入食管損傷食管黏膜[14-15];肝硬化患者易產(chǎn)生的高胃泌素血癥致幽門括約肌功能下降,膽汁隨食物進(jìn)入胃內(nèi)造成胃黏膜損傷。在眾多的因素作用下,患者的腸道屏障受到損傷,菌群的穩(wěn)定受到干擾。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療后,肝硬化食管胃底靜脈曲張患者曲張的血管閉塞,腸道血運(yùn)和功能得到改善,有益菌群比例上升,有害菌群的相對豐度下降,口腔環(huán)境和腸道微生物屏障存在恢復(fù)的趨勢。

本研究創(chuàng)新處是利用口腔-腸-肝軸分析內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療前后口腔和腸道菌群的變化,不足之處在于樣本容量和選擇樣本的時間周期短,所以計劃進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和延長標(biāo)本采集的時間,分析更多的數(shù)據(jù)研究內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療前后口腔和腸道菌群的變化,為將來治療食管胃底靜脈曲張?zhí)峁┪⑸锔深A(yù)措施和預(yù)測內(nèi)鏡聯(lián)合康復(fù)新液治療效果提供方案。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。