濕潤(rùn)燒傷膏對(duì)大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型愈合及TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響

鮑新坤,張曉雨,肖文潔,孫光軍,林愛珍

(湖北省中醫(yī)院,湖北 武漢 430061)

肛瘺又名肛門直腸瘺,多為肛門直腸周圍間隙膿腫破潰或引流后形成,是結(jié)直腸肛門外科領(lǐng)域中常見的疾病之一[1]。本病易反復(fù)發(fā)作,主要以手術(shù)治療為主。目前,肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合時(shí)間長(zhǎng),排便和換藥時(shí)的劇烈疼痛,遠(yuǎn)期瘢痕形成導(dǎo)致的肛門狹窄和失禁等成為困擾醫(yī)患雙方的重大問題,如何有效促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合、縮短創(chuàng)面的愈合時(shí)間是臨床醫(yī)生亟須攻克的難題之一。近年來,腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子的異常表達(dá)在創(chuàng)面修復(fù)中的影響受到廣泛關(guān)注[2]。有研究表明,濕潤(rùn)燒傷膏可通過激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad家族成員3信號(hào)通路,有效抑制白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥因子的表達(dá),從而促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合[3]。譚偉能[4]和汪明[5]報(bào)道,濕潤(rùn)燒傷膏用于肛瘺術(shù)后換藥,可明顯減輕患者術(shù)后疼痛,減少術(shù)后瘢痕形成,縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間,但具體分子機(jī)制尚未明確。本研究通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肛瘺術(shù)后大鼠創(chuàng)面組織愈合情況及創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量,探討了濕潤(rùn)燒傷膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制,以為臨床應(yīng)用濕潤(rùn)燒傷膏促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SPF級(jí)SD雄性大鼠,6～8周齡,體重(200±20)g,由湖北省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)的環(huán)境符合國(guó)標(biāo)(GB14925-2010)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所需的標(biāo)準(zhǔn),室溫控制在22～24 ℃,相對(duì)濕度40%～60%,每日定時(shí)更換飼料,自由攝食飲水。

1.2藥物及菌株 濕潤(rùn)燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司,規(guī)格:60 g/支),易孚[重組人表皮生長(zhǎng)因子凝膠(酵母),桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司,規(guī)格:20 g/支],生理鹽水(湖南科倫制藥有限公司,規(guī)格:500 mL/瓶),金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌液(湖北中醫(yī)藥大學(xué)腸道微生態(tài)實(shí)驗(yàn)室提供)。

1.3主要試劑與儀器 伊紅Y(國(guó)藥集團(tuán),71014544);中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán),10004160);蘇木素(Sigma,H9627);TNF-α(ABclonal,A11534);IL-1β(三鷹,21865-1-AP);離心機(jī)(H1650-W,湘儀);電熱恒溫培養(yǎng)箱(ICV-450,日本ASONE);FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀(Flexstation3,Molecular Devices)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 所有大鼠均先進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,然后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為濕潤(rùn)燒傷膏組、易孚組及生理鹽水組,每組10只。3組均參考文獻(xiàn)[6]方法建立肛瘺術(shù)后創(chuàng)面:對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行備皮,用5%水合氯醛溶液(0.007 mL/g)腹腔注射麻醉大鼠后,用碘伏消毒手術(shù)區(qū)域,剪除邊長(zhǎng)約為3.0 cm的方形皮膚,創(chuàng)面深至肌層。傷口淋灑金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌液,創(chuàng)面部位敷以創(chuàng)面相應(yīng)大小的油紗敷料,用紗布包扎止血,24 h后去除紗布和敷料。每日傷口淋灑金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌液0.2 mL,72 h后見傷口有膿性分泌物,滲液較多,創(chuàng)緣皮色發(fā)紅,類似于臨床肛瘺術(shù)后“急性、開放、滲血、感染”的創(chuàng)面,提示造模成功。造模成功后,每日下午定時(shí)對(duì)3組大鼠創(chuàng)面進(jìn)行換藥1次,換藥時(shí)濕潤(rùn)燒傷膏組創(chuàng)面外敷濕潤(rùn)燒傷膏0.2 mL,易孚組創(chuàng)面外敷易孚凝膠0.2 mL,生理鹽水組創(chuàng)面外敷生理鹽水0.2 mL。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1創(chuàng)面愈合情況 分別于換藥第3,7,14天,肉眼觀察創(chuàng)面顏色、肉芽生長(zhǎng)、分泌物滲出、結(jié)痂等情況,并拍照記錄創(chuàng)面愈合情況。每組大鼠各隨機(jī)選取3只(共9個(gè)創(chuàng)面),用透明薄膜緊密敷貼于創(chuàng)面上,用較細(xì)記號(hào)筆畫出傷口的邊緣,然后將透明薄膜平鋪在ECG紙上,計(jì)算出創(chuàng)面面積,創(chuàng)面愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.5.2創(chuàng)面組織病理學(xué)形態(tài) 換藥第14天麻醉所有大鼠,在無菌條件下取創(chuàng)面中心至創(chuàng)緣正常皮膚間的新生肉芽組織,洗去表面血液后固定于10%中性福爾馬林溶液中。將提取的新生肉芽組織經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋制成蠟塊,用病理切片機(jī)進(jìn)行切片,切好的組織片放入40 ℃的水浴鍋中進(jìn)行攤片,切片用二甲苯脫蠟、蘇木精-伊紅染色5 min、自來水浸洗30 s、乙醇梯度脫水,風(fēng)干后中性樹膠封片,最后顯微鏡(×100)下觀察創(chuàng)面組織的病理學(xué)形態(tài)。

1.5.3創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量 換藥第14天,提取并準(zhǔn)確稱取創(chuàng)面組織30 mg,加入800 μL預(yù)冷PBS沖洗組織表面血液。將洗凈后的組織放入600 μL預(yù)冷PBS勻漿機(jī)勻漿至無明顯組織顆粒,低溫離心后取上清。將上清放入-40 ℃冰箱凍融,此過程重復(fù)2次。按BCA定量方法進(jìn)行蛋白定量至統(tǒng)一濃度。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定TNF-α、IL-1β含量,用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠創(chuàng)面愈合情況 換藥第3天,生理鹽水組大鼠創(chuàng)面局部可見少許分泌物,顏色相對(duì)黑暗;易孚組大鼠創(chuàng)面邊緣可見少許肉芽組織增生;濕潤(rùn)燒傷膏組大鼠局部可見皮紋增生,表面少許痂皮覆蓋,局部組織較干燥。換藥第7天,濕潤(rùn)燒傷膏組創(chuàng)面修復(fù)面積均明顯大于生理鹽水組與易孚組。換藥第14天,3組大鼠創(chuàng)面局部邊緣均可見毛發(fā)覆蓋,易孚組局部少許滲出,濕潤(rùn)燒傷膏組局部組織干燥,且濕潤(rùn)燒傷膏組創(chuàng)面明顯小于生理鹽水組與易孚組。見圖1。

圖1 3組肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型大鼠換藥第3,7,14天肉眼觀察創(chuàng)面愈合情況

2.23組大鼠創(chuàng)面愈合率比較 換藥第3天,3組大鼠創(chuàng)面愈合率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);換藥第7天和第14天,濕潤(rùn)燒傷膏組和易孚組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯高于同期生理鹽水組(P均<0.05),且濕潤(rùn)燒傷膏組均明顯高于同期易孚組(P均<0.05)。見表1。

表1 3組肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型大鼠換藥后不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較

2.33組大鼠創(chuàng)面組織病理形態(tài)比較 換藥第14天,生理鹽水組大鼠創(chuàng)面組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集、浸潤(rùn),少量纖維和膠原蛋白沉積,創(chuàng)面形成肉芽組織;易孚組大鼠創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞較生理鹽水組明顯減少,局部可見紅細(xì)胞溢出血管壁外,大量膠原蛋白沉積,肉芽組織增多;濕潤(rùn)燒傷膏組大鼠創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞較易孚組明顯減少,膠原組織清晰可見并排列整齊,創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)明顯。見圖2。

圖2 3組肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型大鼠換藥第14天創(chuàng)面組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.43組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量比較 換藥第14天,濕潤(rùn)燒傷膏組和易孚組大鼠創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量均明顯低于生理鹽水組(P均<0.05),且濕潤(rùn)燒傷膏組TNF-α、IL-1β含量均明顯低于易孚組(P均<0.05)。見表2。

表2 3組肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型大鼠換藥第14天創(chuàng)面組織中TNF-α、IL-1β含量比較

3 討 論

由于肛門排便的特殊性,肛瘺易慢性遷延難愈,多需要手術(shù)治療。目前大多數(shù)肛瘺手術(shù)采取開放性切開引流,術(shù)后創(chuàng)面疼痛、感染和愈合速度等與術(shù)后換藥關(guān)系密切[7],若傷口愈合不良可增加再次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn),嚴(yán)重影響患者身心健康?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,創(chuàng)面修復(fù)主要包括炎癥反應(yīng)、肉芽增殖、組織重塑3個(gè)階段,其中創(chuàng)面炎癥水腫、血管生成以及上皮化異常、肉芽組織過度增生等是影響創(chuàng)面愈合過程中的主要因素,因此維持一個(gè)良好的傷口環(huán)境及狀態(tài)在創(chuàng)面修復(fù)中至關(guān)重要[8]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,肛瘺手術(shù)時(shí)肛周組織同時(shí)為金刃所傷,形成潰瘍創(chuàng)面,余邪未盡,氣滯血瘀,兩邪客留經(jīng)絡(luò),經(jīng)絡(luò)受阻,氣血不暢,致潰瘍面失于榮養(yǎng),膿腐難祛,新肉難生,病程遷延不愈。治療上宜采用祛邪、化瘀、補(bǔ)虛等手段調(diào)和氣血,從而促進(jìn)潰瘍面修復(fù)[9-10]。濕潤(rùn)燒傷膏是由黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼等藥材制成的中藥膏,外用于創(chuàng)傷、潰瘍久不收口具有較好的治療效果。相關(guān)研究報(bào)道,濕潤(rùn)燒傷膏外用可給創(chuàng)面提供充分的氧供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),刺激創(chuàng)面新生肉芽組織中大量的血管生成,機(jī)制可能與調(diào)控抵抗素樣分子α(RELM-α)表達(dá)、活化PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路有關(guān)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,濕潤(rùn)燒傷膏組大鼠換藥第7天和第14天的創(chuàng)面愈合率均明顯高于生理鹽水組和易孚組,病理觀察顯示創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞明顯減少,大量膠原蛋白沉積,表明濕潤(rùn)燒傷膏可以有效促進(jìn)大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面模型的愈合。

術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜、多步驟的過程,其中炎癥反應(yīng)的程度是影響創(chuàng)面愈合速度的主要因素[13-14]。機(jī)體各類炎癥反應(yīng)與炎癥因子的參與密切相關(guān),在免疫應(yīng)答的急性期主要由TNF-α、IL-6和IL-1β等因子介導(dǎo),這也是研究中醫(yī)藥治療干預(yù)各種感染性炎癥所涉及的常見效應(yīng)靶點(diǎn)[15]。TNF-α是主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種多功能Th1細(xì)胞因子[16],當(dāng)機(jī)體受到損傷和刺激后會(huì)迅速釋放TNF-α,激發(fā)宿主防御機(jī)制,并趨化其他免疫細(xì)胞清除創(chuàng)面感染[17-18]。IL-1β由多種細(xì)胞合成并分泌,早期可介導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng),參與局部抗炎并吞噬及清除壞死組織[19]。既往研究表明,中藥治療能參與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)機(jī)體抗感染能力,抑制炎癥損傷,促進(jìn)受損組織的修復(fù)和血管生成,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,濕潤(rùn)燒傷膏組換藥第14天創(chuàng)面組織內(nèi)TNF-α、IL-1β含量明顯低于生理鹽水組及易孚組,提示濕潤(rùn)燒傷膏可以通過降低TNF-α、IL-1β含量,減輕大鼠局部創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)程度,促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

綜上所述,濕潤(rùn)燒傷膏可以加快肛瘺術(shù)后模型大鼠創(chuàng)面組織修復(fù)過程,機(jī)制可能與降低創(chuàng)面內(nèi)TNF-α、IL-1β的含量,抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為濕潤(rùn)燒傷膏臨床用于肛瘺術(shù)后創(chuàng)面治療提供了一定理論依據(jù),但創(chuàng)面的修復(fù)過程涉及的機(jī)制復(fù)雜,該藥是否可通過其他靶點(diǎn)發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。