基于UHPLC-QE-MS的橘荔散結(jié)丸誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的炎癥機(jī)制

謝卓庭,王乃平,程曉榆,關(guān)永格,李坤寅

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)東莞醫(yī)院,廣東 東莞 523000;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

子宮肌瘤是女性最常見良性腫瘤,常伴隨經(jīng)量增多及經(jīng)期延長、下腹包塊、壓迫癥狀,可引起不孕或流產(chǎn)[1]。20%～50%的育齡期女性患過子宮肌瘤[2],25%～40%的不孕與子宮肌瘤密切相關(guān)[3-4]。目前西醫(yī)治療手段有激素藥物和非激素藥物(如止血劑、非甾體抗炎藥)、手術(shù)及放射療法等,這些治療方式對于有生育要求的女性并不友好,而中醫(yī)藥優(yōu)勢明顯。子宮肌瘤屬于中醫(yī)“癥瘕”病范疇,氣滯血瘀證是最常見的臨床證型。橘荔散結(jié)丸為全國著名婦科泰斗羅元愷教授治療氣滯血瘀型子宮肌瘤的經(jīng)典方劑,臨床治療子宮肌瘤療效顯著[5]。前期團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),橘荔散結(jié)丸能夠降低子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力,抑制大鼠子宮肌層細(xì)胞增殖[6],但該藥物發(fā)揮作用的化學(xué)成分及作用機(jī)制尚不明確。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-QE-MS)集高效分離、多組分定性和定量于一體,既發(fā)揮色譜高分離能力,又發(fā)揮質(zhì)譜高鑒別能力,近年來成為藥物分析中一項(xiàng)重要檢測技術(shù),被廣泛用于食品藥物分析、醫(yī)藥研究和藥物殘留檢測領(lǐng)域[7]。子宮肌瘤與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切,核因子-κB(NF-κB)信號通路是免疫炎癥的經(jīng)典通路[8],孕激素可通過阻斷NF-κB激活和誘導(dǎo)環(huán)氧化酶-2(COX-2)來抑制子宮收縮[9]。因此,本研究運(yùn)用UHPLC-QE-MS技術(shù)對橘荔散結(jié)丸化學(xué)成分進(jìn)行分析,并圍繞NF-κB信號通路,探討了橘荔散結(jié)丸誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的炎癥機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 選擇 2020年6月—2022年6月于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科住院行子宮全切術(shù)或子宮肌瘤剔除術(shù)的子宮肌瘤患者20例,手術(shù)后30 min內(nèi)取部分子宮肌瘤組織送病理檢查并確診。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過([2020]016)。手術(shù)室用無菌剪刀獲取手術(shù)切除子宮肌瘤病灶組織約2 cm3,立即置于裝有冰浴PBS緩沖液50 mL離心管中,2 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室行原代培養(yǎng)。

1.2試劑與藥物 DMEM、胎牛血清、青鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液(美國Gibco公司,貨號:C11995500BT,10270106,15140-122,25200-056,SH30256.01B);Ⅰ型膠原酶(德國BioFroxx公司,貨號:1904MG100);鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體SMA(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司)。AnnexinV-FITC凋亡試劑盒(美國BD公司);碘化丙啶(默克公司,貨號:P4170,Sigma-Aldrich);米非司酮片(北京紫竹藥業(yè)有限公司,規(guī)格:25 mg/片);中藥飲片(廣州至信藥業(yè)有限公司,批號:190901,191201,200601);橘荔散結(jié)片(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,批號:20200501,20200701,20200901)。IKKα、IKBα、p65、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,貨號:bs-2907R,bs-1287R,bs-0465r,bs-0078r,bs-0781R)。Phospho-IkBα(Ser32)抗體(CST公司,貨號:2859s);RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(杭州弗德生物科技有限公司);Trizol(美國Invitrogen公司)。

1.3儀器 超高效液相(Agilent公司,1290 UPHLC);高分辨質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific公司,Q Exactive Focus);超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司,YM-080S);色譜柱(Waters公司,ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm×2.1×100 mm);離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠,TDL-5);全自動顯微照相倒置式系統(tǒng)顯微鏡(日本Olympus公司,PM-20);恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Harris公司,SC-15);流式細(xì)胞儀(美國Beckman Comlter公司,ALTRA EPICS);蛋白電泳裝置系統(tǒng)(Bio-RAD公司);TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司);熒光定量PCR儀(美國ABI公司,7300)。

1.4藥液制備方法 橘荔散結(jié)丸凍干粉:將橘核15g、荔枝核10g、莪術(shù)10g、川楝子10g、益母草10 g、小茴香10 g、烏藥10 g、海藻10 g、崗稔根15 g、黨參10 g、何首烏15 g、續(xù)斷15 g、生牡蠣20 g、風(fēng)粟殼15 g粉碎制成粗粉,按1∶8料液比加入70%酒精,回流提取2次,每次1 h,收集醇液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(60 ℃,75 r/min)至無醇味冷凍干燥,凍干粉(質(zhì)量為30 g)與原方藥材(1劑原方藥材為175 g)比為1∶5.8。橘荔散結(jié)丸含藥液:橘荔散結(jié)丸凍干粉用DMEM培養(yǎng)液稀釋溶解,配置不同濃度含藥液(0 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL)。米非司酮含藥液:米非司酮片用研缽研碎,根據(jù)其分子量計(jì)算得出配置10 mL濃度為1×10-3mol/L母液需4.3 mg米非司酮,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要使用時將母液用DMEM液稀釋為1×10-5mol/L工作液。均用0.22 μm微孔濾膜無菌過濾,pH試紙測其pH值至中性,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5橘荔散結(jié)丸主要化學(xué)成分UHPLC-QE-MS技術(shù)檢測方法 橘荔散結(jié)丸凍干粉及橘荔散結(jié)片共6個樣本,每組檢測3個樣本。色譜條件:Waters UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm×2.1×100 mm)。進(jìn)樣量5 μL,流速為0.4 mL/min ,流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B);多步線性洗脫梯度程序:0～3.5 min 5%～15%B,3.5～6 min 15%～30%B,6～12 min 30%～70%B,12～18 min 70%～100%B,18～25 min 100%B,25～26 min 100%～5%B,26～30 min 5%B。質(zhì)譜條件:每個采集周期中,質(zhì)量范圍在100～1 500之間,采用加熱電噴霧離子源,正、負(fù)離子模式檢測。參數(shù)設(shè)置:毛細(xì)管溫度400 ℃;鞘氣體流速45 Arb;輔助氣體流速15Arb;MS全分辨率為70000;MS/MS分辨率為17 500;碰撞能量15/30/45(NCE模式);噴射電壓 4.0 kV(正極)或-3.6 kV(負(fù)極)。

1.6子宮肌瘤細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1細(xì)胞培養(yǎng)及免疫組化鑒定 原代細(xì)胞傳至第3代細(xì)胞生長融合至70%～80%時,4%多聚甲醛液室溫固定,3%H2O2去離子水滅酶活性,5%BSA封閉液封閉。滴加一抗工作液鼠抗人平滑肌肌動蛋白抗體SMA和生物素二抗,DAB顯色,封片,倒置顯微鏡下拍片。

1.6.2實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 取對數(shù)期生長子宮肌瘤細(xì)胞,胰酶消化離心制備細(xì)胞懸液,種至6孔板,細(xì)胞密度(1～2)×105/mL。細(xì)胞生長同步時,實(shí)驗(yàn)分為6組,空白組常規(guī)培養(yǎng),基質(zhì)組加入0.05%DMSO培養(yǎng),米非司酮組加入1×10-5mol/L米非司酮含藥液培養(yǎng),橘荔散結(jié)丸高、低濃度組分別加入2 mg/mL和1 mg/mL橘荔散結(jié)丸含藥液培養(yǎng)。

1.6.3細(xì)胞凋亡率檢測 棄上清液,用不含EDTA胰蛋白酶進(jìn)行消化收集細(xì)胞,冷PBS液洗滌2次。加入1×AnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。5 mL流式管每組移入細(xì)胞懸液100 μL,避光條件加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液,輕輕混勻。避光條件室溫孵育15 min。每個流式管加400 μL 1×AnnexinV-FITC結(jié)合液,混勻細(xì)胞。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測,Cell quest軟件分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.4子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、IKBα、p-IKBα、p65、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測:取出含有細(xì)胞的6孔板,置于冰上操作。提取細(xì)胞蛋白,進(jìn)行蛋白樣品定量,根據(jù)測定蛋白濃度采用excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對蛋白樣品變性處理,配置完成后-20 ℃之下保存?zhèn)溆谩Ｅ渲频鞍譖AGE膠,垂直裝入電泳槽,80 V電壓下電泳跑膠。處理好的轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽,4 ℃條件下轉(zhuǎn)膜90 min。5%脫脂牛奶封閉,先后加入一抗和二抗孵育,孵育好的PVDF膜置于自動顯影儀器進(jìn)行目的蛋白顯影。采用Image J軟件處理系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

1.6.5子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、IKBα、p65、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)檢測 采用 qPCR 法檢測:從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索相應(yīng)基因序列,并設(shè)計(jì)引物。提取RNA,取1 μL RNA樣品,分光光度計(jì)測定OD260/280,計(jì)算RNA濃度和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄:42 ℃ 30 min, 95 ℃ 5 min,使酶失活;4 ℃冰上放置5 min,可繼續(xù)PCR擴(kuò)增或-20℃保存。PCR擴(kuò)增:95℃ 3 min預(yù)變性;然后95 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共循環(huán)35次;最后72 ℃ 10 min。調(diào)整內(nèi)參,計(jì)算CT值和 mRNA表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1橘荔散結(jié)丸主要化學(xué)成分 按照UHPLC-QE-MS技術(shù)條件檢測,得到橘荔散結(jié)丸正、負(fù)離子模式下總離子流TIC圖,見圖1及圖2。正離子模式能檢出更多化合物,分離出663個化合物,包括195個萜類、105個黃酮類、79個生物堿類、 69個苯丙素類、43個酚類、醌類及其他類型等。相對含量占總化合物85%化學(xué)成分被認(rèn)為是橘荔散結(jié)丸主要化學(xué)成分,其中凍干粉91個,中成藥64個。主要化學(xué)成分凍干粉與中成藥6個樣本共有化合物22 個,包括水蘇堿、胍基丁酸、地芰普內(nèi)酯、原莪術(shù)烯醇、甜橙黃酮等。

圖1 橘荔散結(jié)丸正離子模式總離子流TIC圖

圖2 橘荔散結(jié)丸負(fù)離子模式總離子流TIC圖

2.2橘荔散結(jié)丸指紋圖譜的建立 將橘荔散結(jié)丸檢測所得化學(xué)成分質(zhì)譜原始數(shù)值,在正負(fù)離子條件下分別進(jìn)行排序,經(jīng)過多點(diǎn)較正、譜峰匹配,得到橘荔散結(jié)丸6批樣品指紋圖譜疊圖,見圖3及圖4。結(jié)果示指紋圖譜重疊較好,說明橘荔散結(jié)丸質(zhì)量穩(wěn)定。

圖3 橘荔散結(jié)丸正離子模式指紋圖譜

圖4 橘荔散結(jié)丸負(fù)離子模式指紋圖譜

2.3橘荔散結(jié)丸主成分分析PCA模型的建立 使用SIMCA軟件V16.0.2進(jìn)行自動建模分析,橘荔散結(jié)丸主成分分析PCA模型建立結(jié)果示橘荔散結(jié)丸凍干粉和橘荔散結(jié)片組內(nèi)重合較好,但由于制備工藝不同等因素,二者間存在一定差異。見圖5。

圖中橫坐標(biāo)PC[1]為排名第一主成分的得分;縱坐標(biāo)PC[2]為第二主成分得分;每個散點(diǎn)代表一個樣本,樣本全部處于95%置信區(qū)間內(nèi)

2.4子宮肌瘤細(xì)胞免疫組化鑒定結(jié)果 染色后鏡下顯示細(xì)胞漿內(nèi)為棕黃色絲狀結(jié)構(gòu)為陽性反應(yīng),證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為子宮平滑肌瘤細(xì)胞,陽性細(xì)胞數(shù)接近100%。見圖6。

圖6 人原代子宮肌瘤細(xì)胞免疫組化染色鏡下形態(tài)

2.5各組子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率比較 基質(zhì)組子宮肌瘤細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);米非司酮組和橘荔散結(jié)丸高、低濃度組子宮肌瘤細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于空白組和基質(zhì)組(P均<0.05);米非司酮組、橘荔散結(jié)丸高濃度組早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯高于橘荔散結(jié)丸低濃度組(P均<0.05);橘荔散結(jié)丸高濃度組早期凋亡率明顯高于米非司酮組(P<0.05),晚期凋亡率與米非司酮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率比較

2.6各組子宮肌瘤細(xì)胞中NF-κB信號通路炎癥因子蛋白表達(dá)量比較 各組間IKBα蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05);橘荔散結(jié)丸低濃度組子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、p65、TNF-α、IL-6蛋白相對表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05),p-IKBα蛋白相對表達(dá)量與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);橘荔散結(jié)丸高濃度組、米非司酮組子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、p-IKBα、p65、TNF-α蛋白相對表達(dá)量均明顯高于空白組和橘荔散結(jié)丸低濃度組(P均<0.05);橘荔散結(jié)丸高濃度組和米非司酮組子宮肌瘤細(xì)胞中IL-6蛋白相對表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05);橘荔散結(jié)丸高濃度組子宮肌瘤細(xì)胞中p-IKBα、p65、IL-6蛋白相對表達(dá)量均明顯低于米非司酮組(P<0.05),IKKα、TNF-α蛋白相對表達(dá)量與米非司酮組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、IKBα、p-IKBα、p65、TNFα、IL-6蛋白相對表達(dá)量比較

2.7各組子宮肌瘤細(xì)胞中NF-κB信號通路炎癥因子mRNA表達(dá)量比較 米非司酮組、橘荔散結(jié)丸高濃度組、橘荔散結(jié)丸低濃度組子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、IKBα、p65、IL-6 mRNA相對表達(dá)量和米非司酮組、橘荔散結(jié)丸高濃度組TNF-α mRNA相對表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05);橘荔散結(jié)丸高濃度組和米非司酮組IKBα、p65、IL-6 mRNA相對表達(dá)量及米非司酮組TNF-α mRNA相對表達(dá)量均明顯高于橘荔散結(jié)丸低濃度組(P<0.05);米非司酮組、橘荔散結(jié)丸高濃度組、橘荔散結(jié)丸低濃度組IKKα mRNA相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),橘荔散結(jié)丸高濃度組IKBα、p65、TNF-α、IL-6 mRNA相對表達(dá)量與米非司酮組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、IKBα、p65、TNFα、IL-6 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

橘荔散結(jié)丸為羅元愷教授借鑒《普濟(jì)方》荔核散及《濟(jì)生方》橘核丸加減化裁而成。方中橘核、荔枝核行氣散結(jié),烏藥、小茴香、川楝子理氣活血、散結(jié)止痛,莪術(shù)破血消癥,益母草活血化瘀通經(jīng),海藻、風(fēng)粟殼軟堅(jiān)散結(jié)消腫,牡蠣、崗稔根散結(jié)收斂止血,黨參、續(xù)斷、制首烏補(bǔ)益脾腎正氣。全方以行氣活血、消癥散結(jié)攻伐為主,然不忘固復(fù)患者正氣。本實(shí)驗(yàn)基于UHPLC-QE-MS技術(shù)對橘荔散結(jié)丸化學(xué)成分快速高效鑒定,建立橘荔散結(jié)丸總離子流圖和指紋圖譜,分離出橘荔散結(jié)丸663個化合物,主要包括萜類、黃酮類、生物堿類、苯丙素類、酚類等。其中萜類化合物地芰普內(nèi)酯能抑制一氧化氮、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生[10];黃酮類成分如柚皮苷能下調(diào)環(huán)氧化酶2(COX-2)的表達(dá), 抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外增殖,有明顯抗腫瘤作用[11];羽扇烯酮可調(diào)控p65和NF-κB信號通路相關(guān)蛋白[12];橙皮苷能抑制NF-κB激活和IKB磷酸化[13];莪術(shù)醇可通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。本研究進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),橘荔散結(jié)丸能夠誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡,分析與橘荔散結(jié)丸中上述成分的作用有關(guān)。

細(xì)胞凋亡在生理環(huán)境中主要作用是清除有害的、損壞的或不需要的細(xì)胞[15],組織正常發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)需要細(xì)胞凋亡和增殖平衡。一些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子可影響細(xì)胞分裂增殖和凋亡。細(xì)胞周期調(diào)控受細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑CDKI調(diào)節(jié),包括p21WAF1、p27、p57。其中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子p21WAF1能夠抑制乳腺癌組織中成體干細(xì)胞的增殖[16]。NF-κB信號通路與自發(fā)性炎癥性疾病與組織的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。TNF-α是NF-κB信號通路下游因子,也是炎癥和腫瘤的關(guān)鍵中介,可通過干預(yù)腫瘤微環(huán)境中內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),從而影響腫瘤細(xì)胞凋亡與增殖[17-18]。腫瘤基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子如IL-6,能夠吸引和募集炎癥細(xì)胞進(jìn)入腫瘤微環(huán)境。研究表明IL-6在炎癥性自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)病中有重要作用[19],平滑肌瘤患者肌瘤組織和血清中IL-6水平和TNF-α水平高于正常平滑肌組織[20]。筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用NF-κB通路抑制劑PDTC干預(yù)人子宮肌瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)肌瘤細(xì)胞中IKKα、p-IKBα、p65、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)降低,提示NK-κB信號通路影響子宮肌瘤細(xì)胞增殖,且通路抑制劑能夠抑制肌瘤細(xì)胞炎癥反應(yīng)[21]。米非司酮有縮小肌瘤體積作用,其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,機(jī)制與降低NF-κB表達(dá)、抑制細(xì)胞遷移和新血管生成有關(guān)[22]。故本研究以米非司酮為陽性對照藥物,圍繞NF-κB信號通路,探討了橘荔散結(jié)丸誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡的炎癥機(jī)制。結(jié)果表明,橘荔散結(jié)丸能夠上調(diào)子宮肌瘤細(xì)胞中IKKα、p-IKBα、p65蛋白表達(dá),說明橘荔散結(jié)丸可以干預(yù)NF-κB信號通路傳導(dǎo),抑制炎癥反應(yīng),阻斷了肌瘤進(jìn)一步發(fā)展。

綜上所述,基于UHPLC-QE-MS技術(shù)驗(yàn)證了中藥復(fù)方橘荔散結(jié)丸化學(xué)成分眾多,分離出主要成分能起到抗炎免疫調(diào)節(jié)作用;橘荔散結(jié)丸治療子宮肌瘤的分子機(jī)制與干預(yù)肌瘤細(xì)胞微環(huán)境炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。