人眼表微生物群與眼表疾病研究進(jìn)展

王 丹,楊瑞波

0 引言

近年來,干眼、過敏性結(jié)膜炎等非感染性眼表疾病的發(fā)病率越來越高,而疾病的確切病因及病理生理機(jī)制尚有待闡明。2014年,隨著人類微生物組計(jì)劃的實(shí)施,對(duì)包括皮膚、胃腸道和泌尿生殖道等身體許多部位進(jìn)行微生物特征分析,并評(píng)估其在人類健康和疾病中的作用,眼表微生物群在眼表疾病中作用的探索也逐漸進(jìn)入研究者們的視野[1]。眼表黏膜暴露于外部環(huán)境,有特定的微生物群定植于眼表,與眼表組織、細(xì)胞及細(xì)胞因子共同構(gòu)成穩(wěn)定的眼部微環(huán)境[2]。正常情況下,眼表中各種微生物處于相對(duì)平衡狀態(tài),組成正常微生物群的細(xì)菌種類可通過競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制抑制致病菌生長(zhǎng)[3],但當(dāng)眼表屏障的防御功能損傷時(shí)會(huì)引起微生物失調(diào),使致病菌過度繁殖,加重眼表?yè)p害。因此,了解眼表微生物群的組成、疾病中微生物的變化將有助于更好地了解眼表疾病的致病機(jī)制。

1 正常眼表核心微生物群

回顧國(guó)內(nèi)外基于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)對(duì)眼表微生物群的研究[4-8],發(fā)現(xiàn)正常眼表分離出來的細(xì)菌主要是凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌、棒狀桿菌等。隨著人類微生物組學(xué)研究的進(jìn)展,對(duì)于眼表是否與人體其他部分一樣存在核心微生物群的疑問被研究者們提出[1]。但是細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果并不能包含眼表所有的微生物群,高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用逐漸解決了該問題(表1[4,7-15])。

表1 正常眼表核心微生物

2011年,Dong等[9]第一次采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4位受試者的結(jié)膜囊細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)了變形菌門、放線菌門、厚壁菌門3個(gè)主要菌門和假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、丙酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、棒狀桿菌屬5個(gè)主要菌屬,但由于樣本量太小,未表明其穩(wěn)定性就直接定義“核心”微生物群還為時(shí)尚早。為了更好地確定眼表核心微生物群及眼表微生物的穩(wěn)定性,Ozkan等[8]對(duì)45位健康受試者在3mo內(nèi)的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行結(jié)膜采樣,發(fā)現(xiàn)每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的主要菌屬是棒狀桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、鏈球菌屬,并且由于存在1位或多位受試者受檢的所有時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)的菌屬,分析認(rèn)為可能存在針對(duì)個(gè)體的微小核心微生物群。與上述研究一致,2021年,Kang等[12]采用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)健康人眼表微生物組分析,發(fā)現(xiàn)屬水平主要有鏈球菌屬、葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、棒狀桿菌屬,而個(gè)體在物種水平上存在菌株異質(zhì)性,這進(jìn)一步驗(yàn)證了個(gè)體微小核心微生物群的存在。

同年Delbeke等[13]對(duì)已發(fā)表的11篇文獻(xiàn)中的可用原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,將至少在5個(gè)已發(fā)表隊(duì)列研究中存在且相對(duì)豐度大于1%的菌屬定義為健康成年人的核心微生物群——棒狀桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、丙酸桿菌屬、鏈球菌屬。

目前對(duì)于眼表核心微生物群的研究主要集中在細(xì)菌方面,但眼表微生物群并不是只有細(xì)菌,還包括真菌、病毒[12]。Wang等[15]使用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)測(cè)序的方法對(duì)健康人眼表的真菌進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌門和子囊菌門2個(gè)主要門類及馬拉色菌屬、紅酵母菌屬、Davidiella、曲霉菌屬和鏈格孢屬5個(gè)主要屬類,并且這些微生物在80%以上的樣本中發(fā)現(xiàn),與Shivaji等[14]研究發(fā)現(xiàn)的馬拉色菌屬和曲霉菌屬在所有檢測(cè)到真菌的樣本中均存在的結(jié)果一致。真菌微生物的確定將有助于更全面地定義正常眼表核心微生物群,但相關(guān)研究還較少,未來應(yīng)加強(qiáng)對(duì)眼表真菌、病毒等的鑒定以更好地了解疾病的發(fā)病機(jī)制。

2 眼部及全身性疾病與眼表微生物群的變化

2.1干眼與眼表微生物群的變化干眼為多因素引起的慢性眼表疾病,是由淚液的質(zhì)、量及動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜不穩(wěn)定或眼表微環(huán)境失衡,可伴有眼表炎性反應(yīng)、組織損傷及神經(jīng)異常,造成眼部多種不適癥狀和(或)視功能障礙[16],主要分為水液缺乏型、脂質(zhì)異常型、黏蛋白異常型、淚液動(dòng)力學(xué)異常型及混合型干眼。

在干眼的發(fā)病及病理?yè)p傷機(jī)制研究中,眼表微生物失調(diào)近年來備受關(guān)注。基于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方式在干眼中檢測(cè)出的細(xì)菌主要為凝固酶陰性葡萄球菌[17]。2007年,Graham等[18]通過PCR技術(shù)檢測(cè)出了相當(dāng)數(shù)量的非典型的紅平紅球菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、歐文氏菌屬,這些細(xì)菌菌群的檢出表明干眼患者眼表微生物群構(gòu)成的變化。2019年,Li等[19]使用16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)35例干眼患者和瞼板腺功能障礙(meibomian gland dysfunction, MGD)是脂質(zhì)異常型干眼的主要類型。通過傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方式在MGD患者眼表中檢測(cè)到的主要細(xì)菌與健康人眼表一致,均是凝固酶陰性葡萄球菌,但MGD患者的細(xì)菌分離率及檢測(cè)出的細(xì)菌種類卻顯著高于健康人[21],提示MGD患者存在微生物的失調(diào)主要反映在細(xì)菌的量及種類的變化。隨后研究者基于更精確的16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)MGD患者眼表微生物的變化進(jìn)行分析,試圖尋找出對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義的微生物群。2019年,Dong等[22]利用16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬和鞘氨醇單胞菌屬為MGD中的標(biāo)志性微生物,且瞼板腺的萎縮程度隨葡萄球菌屬的相對(duì)豐度增加而加重,這表明葡萄球菌屬在MGD的發(fā)病過程中有著重要作用:(1)瞼板腺分泌過多的膽固醇酯和游離脂肪酸酯,刺激金黃色葡萄球菌生長(zhǎng),導(dǎo)致眼表菌群紊亂;(2)葡萄球菌屬產(chǎn)生的酯酶可顯著改變眼表及瞼板腺周圍游離脂肪酸的分布,使淚膜不穩(wěn)定,加重眼表不適癥狀[23]。 2020年,Zhao等[24]采用宏基因測(cè)序技術(shù)對(duì)代謝途徑進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在MGD樣本中微生物參與碳水化合物和脂質(zhì)代謝的酶豐度增加,這種改變似乎降低了微生物對(duì)環(huán)境中能量的要求,使其在低能量的環(huán)境中也可以更好地生存。

54例非干眼患者結(jié)膜囊拭子進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)干眼患者的α、β多樣性與非干眼患者存在顯著差異,并且非干眼患者微生物群落聚集性更好且優(yōu)勢(shì)物種更多。與此研究一致,Andersson等[20]對(duì)于水液缺乏型干眼的研究表明干眼患者的α多樣性顯著降低,β多樣性與健康人之間存在顯著差異。

上述研究表明,干眼患者存在眼表微生物群的失衡,并且在不同類型干眼中對(duì)疾病有影響的微生物群可能存在差異,但具體微生物的改變及具體的作用機(jī)制還需要更多的樣本及更加精準(zhǔn)的研究方法來確定。

2.2過敏性結(jié)膜炎與眼表微生物群的變化過敏性結(jié)膜炎(allergic conjunctivitis,AC)是最常見的眼表疾病之一,包括以抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)和輔助型T細(xì)胞2(Th2)介導(dǎo)的超敏反應(yīng)為特征的一系列疾病。

越來越多的證據(jù)表明,皮膚、腸道和呼吸道的微生物群在過敏性疾病(如特應(yīng)性皮炎、食物過敏和哮喘)中起著重要作用[25]。近年來對(duì)AC中結(jié)膜微生物群變化的研究逐漸增多。2015年,Al-Hakami等[26]通過常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)在春季角結(jié)膜炎患者眼表可分離出更多的金黃色葡萄球菌,而性別、年齡匹配的健康對(duì)照組眼表可分離出更多的表皮葡萄球菌,認(rèn)為金黃色葡萄球菌定植在春季角結(jié)膜炎發(fā)生中具有潛在加重作用。2021年,Vishwakarma等[27]發(fā)現(xiàn),雖然春季角結(jié)膜炎患者和健康對(duì)照組眼表細(xì)菌組成上相似,但春季角結(jié)膜炎患者的細(xì)菌負(fù)荷增加且金黃色葡萄球菌的分離率較高。既往認(rèn)為金黃色葡萄球菌來源的外毒素對(duì)于特應(yīng)性皮炎具有促進(jìn)作用,其是否在AC的發(fā)生發(fā)展中也有類似的作用還需要未來更多的研究探索。通過16S rDNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),AC患者存在結(jié)膜囊微生物失調(diào),其中卡他莫拉氏菌在AC中富集,并且對(duì)于不同類型的AC患者,其眼表微生物群組成存在顯著差異[28],提示與研究不同類型干眼的發(fā)病機(jī)制一樣,對(duì)AC的不同類型也要進(jìn)行細(xì)分,或許能從微生物群組成的角度進(jìn)一步挖掘其發(fā)病機(jī)制。多項(xiàng)關(guān)于AC的研究采用了ITS測(cè)序技術(shù)對(duì)真菌的組成變化進(jìn)行分析,幾乎均發(fā)現(xiàn)馬拉色菌的相對(duì)豐度顯著增高[27-28]。這種真菌還可以產(chǎn)生多種免疫球蛋白引起特異性IgE抗體的產(chǎn)生,并可以誘導(dǎo)促炎因子釋放及T細(xì)胞反應(yīng),從而促進(jìn)特應(yīng)性皮炎的發(fā)生[29]。值得注意的是,季節(jié)和常年AC主要是由IgE介導(dǎo)的反應(yīng),因此這種真菌在其中的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

2.3全身性疾病與眼表微生物群的變化近年研究發(fā)現(xiàn),眼表微生物群的變化不僅與眼表疾病有關(guān),全身性疾病也可通過一定的機(jī)制途徑影響眼表微生態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致眼表微生物失調(diào)。

Sj?gren綜合征(Sj?gren’s syndrome,SS)是一種自身免疫性疾病,腸道微生物失調(diào)在該病中的作用已被證實(shí)。2020年,Moon等[30]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性Sj?gren綜合征(primary Sj?gren’s syndrome,pSS)患者腸道微生物中厚壁菌門/擬桿菌門比值下降,這一比例的偏移被認(rèn)為是微生態(tài)失調(diào),厚壁菌門/擬桿菌門比值降低與腸道的炎癥狀態(tài)有關(guān),而該比值增加與肥胖癥有關(guān)[31]。2022年,Yang等[32]比較了30例pSS患者和20例健康人的腸道微生物群,發(fā)現(xiàn)pSS患者腸道中促炎微生物豐度升高,而抗炎微生物豐度降低。SS除了腸道微生物群的失調(diào),在局部如口腔[33]、陰道[34]微生物群也有變化,因該病在眼部也有相應(yīng)干眼表現(xiàn),研究者對(duì)眼表微生物群的失調(diào)也進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)SS患者眼表微生物的多樣性下降,門屬層面上也存在細(xì)菌的顯著性差異,其中厚壁菌門/擬桿菌門的比值升高,這與在腸道中的比值相反,而兩個(gè)方向的比值變化均是微生物失調(diào)的標(biāo)志,因此推測(cè)被擾亂的微生物組成可能會(huì)激活不同的免疫調(diào)節(jié)和炎癥途徑,從而導(dǎo)致或加重淚膜不穩(wěn)定和眼部損傷[31,35]。

3 微生物失調(diào)引起疾病的可能機(jī)制

眼表微生物防御屏障主要由生理防御、生化防御、免疫防御三部分組成,能夠?qū)⒀蹆?nèi)組織與一些有害微生物、炎癥因子等分隔開[36]。生理防御主要包括睫毛機(jī)械性遮擋和瞬目動(dòng)作,防止異物進(jìn)入眼內(nèi)并使淚液中的微生物通過淚道排入鼻腔,此外還包括眼表上皮細(xì)胞的屏障作用[36]。生化防御主要是淚液中的抗菌物質(zhì)[37]——溶菌酶(水解革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁)、乳鐵蛋白(結(jié)合Fe2+,剝奪細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))、淚液脂聯(lián)素(保護(hù)眼睛不受細(xì)菌半胱氨酸蛋白酶影響)等。免疫防御主要包括免疫細(xì)胞[38],如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及分泌型IgA、補(bǔ)體C3等,可以防御微生物侵入眼表。但在感染、配戴隱形眼鏡等一系列風(fēng)險(xiǎn)因素的作用下,微生物防御系統(tǒng)被破壞,這可能進(jìn)一步導(dǎo)致微生物在眼表的增殖,造成眼表微生物群構(gòu)成改變,破壞原有正常微生物群的保護(hù)作用[39]。

基于16S rDNA技術(shù),研究者對(duì)細(xì)菌性角膜炎患者的結(jié)膜拭子和角膜刮片進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)眼表微生物群發(fā)生顯著變化,α多樣性與健康人存在顯著差異,且一些致病菌屬如鏈球菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、甲基桿菌屬相對(duì)豐度顯著升高[40]。配戴隱形眼鏡已被認(rèn)為是干眼、巨乳頭型結(jié)膜炎等眼部疾病的危險(xiǎn)因素。Shin等[41]通過對(duì)隱形眼鏡配戴者的眼部微生物群檢測(cè),發(fā)現(xiàn)甲基桿菌屬、乳酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬豐度較高,而這些菌屬往往是感染性角結(jié)膜炎的致病菌。

雖然眼表微生物失調(diào)引起疾病的具體機(jī)制目前尚不明了,但腸道微生物失調(diào)引起炎性腸病[42]等疾病的機(jī)制已有可喜發(fā)現(xiàn)。在腸道微生物失調(diào)時(shí),導(dǎo)致某些細(xì)菌相對(duì)豐度的增加或減少,隨之這些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。一些重要的代謝產(chǎn)物在維持免疫系統(tǒng)的平衡方面具有重要作用,如短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)[43],其作為一類菌群的代謝產(chǎn)物,可與Ffar2編碼的GPR43受體結(jié)合,通過組蛋白去乙?；敢种苿┑淖饔?影響結(jié)腸Treg細(xì)胞(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)。Treg細(xì)胞是抑制腸道炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞,其可抑制異常激活的免疫反應(yīng)并維持腸道免疫耐受,但在炎性腸病患者中,Treg細(xì)胞水平明顯下降[44]。同樣的細(xì)菌代謝物也在肥胖癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[40]。此外,腸道微生物可以影響B(tài)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞而參與疾病進(jìn)程[38]。

雖然眼表疾病中發(fā)生失調(diào)的微生物類型與上述研究不同,但對(duì)于微生物失調(diào)如何導(dǎo)致疾病的機(jī)制或許在兩者中存在類似之處。因此未來對(duì)于眼表微生物失調(diào)的機(jī)制研究或許可以借鑒對(duì)腸道微生物的研究思路。

4 結(jié)語(yǔ)

健康眼表的微生物群有助于預(yù)防感染,具有刺激和調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫的能力,并為免疫系統(tǒng)提供了一種指示,使免疫屏障不斷得到加強(qiáng),為維持自身新陳代謝和阻止病原體的入侵提供了必要環(huán)境。雖然目前已有相當(dāng)多的研究對(duì)正常及各種眼表疾病中眼表微生物群的變化進(jìn)行描述,但仍有很多問題需要繼續(xù)探索。目前多數(shù)研究仍主要集中在細(xì)菌菌群的變化,對(duì)于眼表真菌菌群的研究只在AC中有部分體現(xiàn);同時(shí),對(duì)微生物失調(diào)與疾病發(fā)生發(fā)展之間關(guān)系的機(jī)制研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。為了揭示這些科學(xué)問題,今后仍需進(jìn)行包括更大樣本受試者、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與評(píng)價(jià)體系的多中心研究,從而推動(dòng)該領(lǐng)域研究以獲得更有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)。