基于AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬流探討電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

尹 俠,李宏玉,,朱路文,唐 強(qiáng)

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué), 黑龍江 哈爾濱 150040;2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150001)

冠心病和急性心肌梗死(AMI)是人類(lèi)死亡的主要原因,經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)、溶栓治療是目前最有效的治療措施,但在恢復(fù)心肌血氧供應(yīng)的同時(shí),可能會(huì)引起心肌缺血再灌注損傷[1]。目前研究認(rèn)為,缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制包括活性氧產(chǎn)生增加、鈣超載、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細(xì)胞凋亡、內(nèi)皮細(xì)胞激活和損傷以及自噬等,這些有害影響導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡、心肌梗死范圍擴(kuò)大、心律失常和血流動(dòng)力學(xué)受損[2-5]。既往研究證實(shí),缺血預(yù)適應(yīng)在再灌注早期可激活自噬并促進(jìn)受損的自噬流,發(fā)揮抗心肌缺血再灌注損傷的作用,而腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) 作為調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)自噬/溶酶體途徑的上游信號(hào)通路,一直以來(lái)都是人們關(guān)注的熱點(diǎn)[6-7]。課題組前期研究證實(shí),運(yùn)動(dòng)預(yù)處理和電針預(yù)處理均可通過(guò)調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮心肌保護(hù)作用[8-9],但聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制尚未闡明。本研究基于AMPK信號(hào)通路及通路下游的相關(guān)自噬蛋白的表達(dá)變化,探討了電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)大鼠離體心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)SD雄性大鼠,體重250～300 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,保持室內(nèi)濕度(50±10)%,溫度控制在(22±2)℃,自然晝夜節(jié)律,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲食、飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 -80 ℃超低溫冰箱和-4 ℃冰箱(青島海爾特種電器有限公司);Langendorff離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(江蘇賽昂斯生物技術(shù)有限公司); WB凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司);石蠟切片機(jī)[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司];熒光正置顯微鏡(Carl Zeiss)。 Compound C(AMPK抑制劑,ABMOLE中國(guó),M2238);山羊抗兔IgG-HRP、DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);內(nèi)參GAPDH (Affinity);RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司);多聚甲醛(天津光科密歐有限公司); 肝素鈉注射液(天津生物化學(xué)制藥有限公司,規(guī)格:1萬(wàn)IU/mL);LC3Ⅱ抗體(武漢三鷹,14600-1-AP)、p62(武漢三鷹,18420-1-AP)、AMPK(Antibody-AF6423)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR,武漢三鷹,66888-1-Ig)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)將90只SD大鼠分為對(duì)照組、模型組、電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組、電針+運(yùn)動(dòng)+ Compound C組,每組18只。各預(yù)處理組先接受3周電針干預(yù)及運(yùn)動(dòng)干預(yù),然后采用Langendorff灌流系統(tǒng)對(duì)除對(duì)照組外的其他4組大鼠進(jìn)行心肌缺血再灌注損傷造模,其中電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組、電針+運(yùn)動(dòng)+ Compound C組分別在造模前1～2 h腹腔注射生理鹽水和 Compound C 2 mmol/L(3.0 mg/200 g)。

1.3.1預(yù)處理方法 ①電針?lè)桨?參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]取雙側(cè)心俞穴(第5胸椎棘突下,雙側(cè)各旁開(kāi)約7 mm)、神門(mén)穴(前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣);用華佗牌0.25 mm×25 mm毫針直刺,連接G6805-1電針儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)。電針參數(shù):頻率2 Hz,電壓3 V,連續(xù)波。每日1次,每次20 min/10 min,每周連續(xù)干預(yù)6 d。取雙側(cè)心俞穴,并在穴位下方2 cm各刺一針作為參考電極、神門(mén)穴(在大鼠尾部針刺一處作為參考電極)。負(fù)極連接心俞穴、神門(mén)穴,正極接參考電極處。②運(yùn)動(dòng)方案:進(jìn)行電動(dòng)跑臺(tái)梯度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,跑臺(tái)起始速度為20 m/min,第1天運(yùn)動(dòng)時(shí)間為20min,每2d運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加5 min,直至運(yùn)動(dòng)時(shí)間60 min/d,每周連續(xù)干預(yù)6 d。

1.3.2心肌缺血再灌注造模方法 腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液40～50 mg/kg麻醉大鼠,同時(shí)給予肝素鈉注射液100 IU/100 g腹腔注射抗凝。固定大鼠,開(kāi)胸后快速取出心臟,將其放入4 ℃ K-H營(yíng)養(yǎng)液中并充分?jǐn)D壓心臟內(nèi)血液,然后用動(dòng)脈夾將心臟固定在裝置上,用1號(hào)線結(jié)扎,采用KH液(含95%O2和5% CO2)于37 ℃下恒溫恒壓灌流。 對(duì)照組大鼠心臟灌注180 min;各造模組大鼠灌注20 min后,在無(wú)氧和無(wú)灌流液的條件下,于37 ℃下缺血40 min,后復(fù)灌120 min。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1線粒體ATP含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,用PBS對(duì)心臟進(jìn)行沖洗,濾紙吸干水分,放在玻璃皿內(nèi)置于冰上。用手術(shù)刀切取0.1 g心肌組織,用鑷子移至離心管中,加入PBS進(jìn)行清洗;棄掉PBS溶液,將盛有組織的離心管置于冰上,用小研磨棒進(jìn)行均勻研磨,加入1 mL PBS,冰浴3 min,離心、棄上清;加入800 μL 4 ℃胰酶消化液,置于冰上20 min,離心、棄上清;加入20 μL線粒體分離試劑,移液槍混勻;離心、棄上清,加入80 μL 4 ℃線粒體分離試劑,在冰上進(jìn)行研磨,離心后小心把上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,離心、棄上清,余下的沉淀即為分離得到的心肌線粒體;用40 μL相應(yīng)的線粒體儲(chǔ)存液重懸線粒體,置于冰上,根據(jù)ATP ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算出ATP含量。

1.4.2心肌組織超微結(jié)構(gòu) 切取約1 mm×1 mm×1 mm大小心肌組織,放入4 ℃的2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定24～48 h,然后進(jìn)行漂洗、梯度丙酮脫水、浸透、包埋、切片(厚度50～70 nm)、染色,透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞內(nèi)自噬小體和自噬溶酶體等結(jié)構(gòu)。

1.4.3心肌組織中轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)表達(dá)情況切片常規(guī)脫蠟至水,進(jìn)行抗原修復(fù),將檸檬酸抗原修復(fù)液(100×)稀釋至1×,將切片放入塑料染色缸,倒入配好的抗原修復(fù)液(九分滿(mǎn),蓋子放在上面不要蓋嚴(yán)),微波爐中火加熱15 min,冷卻至室溫。PBS洗3 min×5次;加入適量的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑,室溫孵育10 min; PBS緩沖液沖洗3 min×5次;滴加山羊血清,37 ℃孵育40 min以封閉非特異性的背景染色;甩掉山羊血清,滴加一抗工作液(可以PBS稀釋抗體或PBS配制的3%BSA稀釋抗體), 37 ℃孵育1 h或4 ℃過(guò)夜;PBS緩沖液沖洗3 min×5次;滴加酶標(biāo)兔抗山羊IgG聚合物(二抗),在室溫下孵育20 min;PBS緩沖液沖洗3 min×5次;加入適量新鮮配制的DAB顯色液,室溫孵育5～8 min;自來(lái)水充分沖洗,蘇木素染色液復(fù)染20 s,分化、沖洗返藍(lán);脫水、透明、封片,鏡下觀察。

1.4.4心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p62、LC3蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取各組液氮速凍后的相同位置心肌組織,每0.1 g組織中加入1 mL裂解液,研磨后低溫勻漿,離心取上清,BCA法進(jìn)行蛋白定量,采用酶標(biāo)記法進(jìn)行檢測(cè)。樣本中的蛋白質(zhì)含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。按照先前所算出的溶酶體溶液中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行制樣;根據(jù)蛋白分子量制備分離膠(6%,8%)、濃縮膠(5%),上樣,在恒定電壓100 V的條件下進(jìn)行電泳,電泳器調(diào)節(jié)到恒流200 mA,薄膜旋轉(zhuǎn)120 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,使用5%脫脂奶封閉液在室溫條件下封閉1 h,加入一抗搖床孵育過(guò)夜,棄掉一抗稀釋液,用TBST緩沖液沖洗,加入兔二抗稀釋液(1∶5 000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBST中)室溫孵育1 h,棄掉二抗稀釋液,在TBST中沖洗。ECL反應(yīng)顯色、曝光成像,用凝膠處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度值計(jì)算。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,所有數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗(yàn)后均符合正態(tài)分布,多組間比較采用ANOVA單因素方差分析,若方差齊,兩兩差異比較采用LSD-t檢驗(yàn);若方差不齊,則采用塔姆黑尼T2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌線粒體中ATP含量 模型組大鼠心肌線粒體中ATP含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05);電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組大鼠心肌線粒體中ATP含量均明顯高于模型組和電針+運(yùn)動(dòng)+Compound C組(P均<0.05),電針+運(yùn)動(dòng)組與電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和心肌缺血再灌注各組大鼠心肌線粒體中ATP含量

2.2各組大鼠心肌組織透射電鏡下表現(xiàn) 對(duì)照組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)正常,肌節(jié)排列整齊,線粒體結(jié)構(gòu)完整,散在分布于肌纖維之間,心肌間質(zhì)未見(jiàn)明顯異常改變;模型組大鼠心肌細(xì)胞中肌絲模糊,部分溶解變性,胞質(zhì)中度水腫,線粒體腫脹呈圓形,基質(zhì)間隙變寬;電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組大鼠心肌細(xì)胞中見(jiàn)自噬小體與散在分布的溶酶體,胞質(zhì)輕度水腫,線粒體輕度腫脹;電針+運(yùn)動(dòng)+ Compound C組大鼠心肌肌原纖維排列稍整齊,少部分肌絲間隙發(fā)生水腫,肌絲斷裂,線粒體輕度水腫,嵴密度降低。見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照組和心肌缺血再灌注各組大鼠透射電鏡下心肌組織超微結(jié)構(gòu)(2 μm)

2.3各組大鼠心肌組織中TFEB陽(yáng)性表達(dá)情況

TFEB被染成棕黃色,與對(duì)照組比較,模型組TFEB陽(yáng)性表達(dá)顯著增多;與模型組比較,電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組TFEB陽(yáng)性表達(dá)明顯減少;與電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組比較,電針+運(yùn)動(dòng)+ Compound C組TFEB陽(yáng)性表達(dá)明顯增多。見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照組和心肌缺血再灌注各組大鼠心肌組織中轉(zhuǎn)錄因子EB陽(yáng)性表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)

2.4各組大鼠心肌組織中p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p62、LC3蛋白表達(dá)情況 與模型組比較,電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組p-AMPK/AMPK比值與LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05),p-mTOR/mTOR比值與p62蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);與電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組比較,電針+運(yùn)動(dòng)+ Compound C組p-AMPK/AMPK比值與LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),p-mTOR/mTOR比值與p62蛋白表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05);電針+運(yùn)動(dòng)組各指標(biāo)與電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖4及圖5。

3 討 論

目前預(yù)處理已成為防治心肌缺血再灌注損傷的重要手段,其中缺血預(yù)適應(yīng)的心肌保護(hù)作用已得到證實(shí)[11-12],但由于缺血是一個(gè)不可預(yù)測(cè)的因素,這限制了其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。因此,探索一種安全、有效、低不良反應(yīng)的治療方法已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

既往研究表明,電針預(yù)處理對(duì)冠心病、心律失常和心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[13-16]。本課題組前期研究證實(shí),單獨(dú)電針和運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可通過(guò)調(diào)控自噬以及炎性通路來(lái)減輕心肌缺血再灌注損傷[8-9,17]。但單純從自噬體的數(shù)量以及標(biāo)志性自噬蛋白的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)自噬變化,嚴(yán)格意義上是不準(zhǔn)確的,因?yàn)樽允杀旧硎且粋€(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)生的過(guò)程,自噬流是否通暢能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)自噬的發(fā)生發(fā)展[18]。故本實(shí)驗(yàn)基于AMPK介導(dǎo)的自噬流,探討了電針和運(yùn)動(dòng)聯(lián)合預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響。

在調(diào)控自噬的過(guò)程中,AMPK作為細(xì)胞內(nèi)調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶和細(xì)胞能量感受器,其可以對(duì)低 ATP水平作出應(yīng)答,并且被激活之后,能夠正向調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而來(lái)補(bǔ)充細(xì)胞的ATP供給,是經(jīng)典的自噬途徑蛋白。mTOR是AMPK下游的一個(gè)底物,活化的AMPK能夠通過(guò)抑制mTOR來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)自噬水平,當(dāng)AMPK信號(hào)通路受到抑制時(shí),細(xì)胞內(nèi)的自噬水平隨之下降[19]。TFEB作為自噬和溶酶體生物合成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,能夠被mTORC1直接進(jìn)行磷酸化修飾,其被認(rèn)為是自噬-溶酶體基因轉(zhuǎn)錄的主要激活劑。LC3作為自噬標(biāo)志性的蛋白定位于自噬體膜[20],分為Ⅰ型和Ⅱ型。當(dāng)自噬受激活啟動(dòng)時(shí),泛素化的LC3Ⅰ與自噬膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,形成 LC3Ⅱ。LC3Ⅱ的早期積聚預(yù)示自噬體的形成增加,成為自噬體的標(biāo)志物[21]。但是單純的自噬水平升高究竟是上游自噬通量的增加引起,還是下游自噬體與溶酶體融合或溶酶體的降解受阻導(dǎo)致的,需要進(jìn)行驗(yàn)證明確。p62作為一種自噬特異性底物,它能夠與 LC3相互作用,在自噬溶酶體的促進(jìn)下滲透入自噬細(xì)胞,并對(duì)其發(fā)生過(guò)程進(jìn)行進(jìn)一步的監(jiān)測(cè)。當(dāng)LC3Ⅱ升高而p62降低時(shí),表明自噬流通暢;如果LC3Ⅱ和p62均升高,表明自噬起始正常,但下游不通,自噬體和溶酶體不能融合,自噬流受阻。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組p-AMPK/AMPK比值與LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組,p-mTOR/mTOR比值與p62蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組,TFEB陽(yáng)性表達(dá)明顯少于模型組,提示電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可激活 AMPK 的磷酸化并抑制mTOR,mTOR的下調(diào)使TFEB 啟動(dòng),TFEB可以促使自噬體的數(shù)量增加,并促進(jìn)了溶酶體的產(chǎn)生,說(shuō)明自噬體與溶酶體融合通暢,這與透射電鏡的觀察結(jié)果是相一致的。為了進(jìn)一步證實(shí)電針聯(lián)合運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可調(diào)控AMPK所在通路,本實(shí)驗(yàn)加入了AMPK抑制劑來(lái)進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果顯示與電針+運(yùn)動(dòng)組、電針+運(yùn)動(dòng)+生理鹽水組比較,電針+運(yùn)動(dòng)+ Compound C組p-AMPK/AMPK比值與LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量均明顯降低,p-mTOR/mTOR比值與p62蛋白表達(dá)量均明顯增高,提示Compound C可能通過(guò)AMPK-mTOR 途徑部分抵消掉電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)預(yù)處理對(duì)AMPK通路調(diào)控自噬的促進(jìn)作用。因此本研究認(rèn)為電針結(jié)合運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可通過(guò)調(diào)控AMPK信號(hào)通路促進(jìn)自噬流發(fā)揮了對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌保護(hù)作用,其更深入的關(guān)系有待繼續(xù)進(jìn)行研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。