基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

殷春燕,董占軍,陳江魁

1(邯鄲學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院,河北 邯鄲,056005)2(河北美臨多維糧油貿(mào)易有限公司,河北 邯鄲,056600)

花生是油脂和蛋白質(zhì)的主要來(lái)源,是世界上第二大重要的谷類(lèi)豆類(lèi)作物,也是第四大食用油料作物。花生紅衣是花生加工業(yè)的副產(chǎn)品,約占整個(gè)花生種子質(zhì)量的3%,全世界每年生產(chǎn)約100萬(wàn)t花生紅衣。但目前花生紅衣利用率較低,除了一部分用于提取花生衣紅作為食品著色劑,大部分用于飼料或被舍棄,經(jīng)濟(jì)價(jià)值很低[1]。大量研究表明,花生紅衣中多酚數(shù)量豐富、種類(lèi)繁多,含量約為90～150 mg/g(以花生紅衣干重記)[2],主要包括酚酸類(lèi)(如咖啡酸、阿魏酸、香豆酸)、黃烷-3-醇單體及其聚合物(如兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、原花青素)、二苯乙烯類(lèi)(如白藜蘆醇)和類(lèi)黃酮[2-3]。研究發(fā)現(xiàn),花生紅衣多酚具有抑菌、抗氧化、降血脂等生理功能[4]。

動(dòng)脈粥樣硬化是大動(dòng)脈中脂質(zhì)和纖維元素積累的一種慢性進(jìn)行性疾病,是大多數(shù)心血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制[5]。動(dòng)脈粥樣硬化的致病因素多樣,如內(nèi)皮細(xì)胞受損、細(xì)胞外脂質(zhì)堆積、慢性炎癥、氧化應(yīng)激損傷以及泡沫細(xì)胞的形成和死亡[6]。動(dòng)脈粥樣硬化早期癥狀不明顯,然而一旦斑塊破裂進(jìn)入到血液,則會(huì)對(duì)生命健康造成威脅。近年來(lái),植物源膳食多酚對(duì)心血管疾病的預(yù)防作用及其機(jī)制引起了人們的廣泛關(guān)注[7-8]。通過(guò)改變飲食提高多酚等物質(zhì)的攝入或可成為預(yù)防和控制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的途徑之一。TOOMER等[9]的研究表明添加花生紅衣多酚至小鼠飲食后,小鼠的肝臟膽固醇和脂質(zhì)貯存減少。XU等[10]發(fā)現(xiàn)花生紅衣提取物可顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,降低血清中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇含量,緩解脂質(zhì)代謝紊亂,并通過(guò)降低促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表達(dá)水平、增加抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用。然而,動(dòng)脈粥樣硬化的致病因素多樣,花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的活性成分及其機(jī)制尚未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以廣泛的數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),已成為系統(tǒng)揭示復(fù)雜生物系統(tǒng)功能和行為的有力工具,可全面揭示多成分藥物植物中多成分-多靶點(diǎn)-多通路的作用機(jī)制[11-12]。本研究為進(jìn)一步探索花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制,基于網(wǎng)絡(luò)藥理分析預(yù)測(cè)了花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的活性成分、靶點(diǎn)和通路,然后將花生紅衣多酚的活性成分與篩選的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接模擬,從而為花生紅衣抗動(dòng)脈粥樣硬化功能健康食品的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 花生紅衣多酚活性成分與靶點(diǎn)的獲取

在TCMSP平臺(tái)中以“花生衣”進(jìn)行搜索以及相關(guān)文獻(xiàn)檢索,得到花生紅衣所含的多酚類(lèi)物質(zhì)(表1)。利用TCMSP平臺(tái)根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類(lèi)藥性指數(shù)(drug-likeness, DL)≥0.18篩選花生紅衣的活性成分[12],并利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)得到活性成分的2D結(jié)構(gòu)的SDF文件。根據(jù)活性成分的名稱(chēng)在TCMSP平臺(tái)中進(jìn)行靶點(diǎn)收集[12],利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)的基因名稱(chēng),同時(shí)在SwissTargetPridiction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),設(shè)置可能性>0.1[11];將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的靶點(diǎn)合并,去重,得到花生紅衣多酚類(lèi)活性成分的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

表1 花生紅衣多酚成分[1,3-4,10]Table 1 Chemical constituents of peanut skin polyphenols

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)的獲取

通過(guò)OMIM、Disgenet和Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù),輸入 “atherosclerosis”檢索相關(guān)靶點(diǎn),去重匯總后得到動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)作用靶點(diǎn)。將花生紅衣多酚活性成分作用靶點(diǎn)和動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)利用Venny 2.1.0 作韋恩圖[12],獲得交集靶點(diǎn)。

1.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks,PPI)構(gòu)建

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置high confidence(0.700)。在Cytoscape 3.9.1構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。使用CytoNCA插件分析,計(jì)算靶點(diǎn)的連接度(degreecentrality,DC)、介度(betweenness,BC)和緊密度(closeness,CC)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)[11]。

1.4 GO和KEGG富集分析

采用DAVID平臺(tái),將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入進(jìn)行GO和KEGG富集分析,設(shè)置P<0.05。將結(jié)果利用微生信在線繪圖軟件制作條形圖和氣泡圖。利用Cytoscape 3.9.1軟件,構(gòu)建“花生紅衣酚類(lèi)活性成分-作用靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 分子對(duì)接

利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)得到活性成分的2D結(jié)構(gòu)的SDF文件,并通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)得到靶點(diǎn)的.pdb格式結(jié)構(gòu)。使用Pymol和AutoDockTools 1.5.7軟件對(duì)活性成分和蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、加氫、分子對(duì)接、計(jì)算結(jié)合能以及對(duì)接結(jié)果可視化操作[11]。

1.6 所用數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)地址

本文研究所用數(shù)據(jù)庫(kù)及在線繪圖軟件網(wǎng)址如參考文獻(xiàn)[11]中所論述。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生紅衣多酚活性成分與靶點(diǎn)

經(jīng)在TCMSP平臺(tái)和文獻(xiàn)搜索共獲得39種花生紅衣多酚成分(表1)。按1.1節(jié)所述,經(jīng)篩選后得到13個(gè)活性成分,如表2所示,編號(hào)分別為P1～P13。且獲得花生紅衣酚類(lèi)活性成分作用靶點(diǎn)384個(gè)。

表2 花生紅衣多酚活性成分Table 2 The main active components of peanut skin polyphenols

2.2 動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)獲取結(jié)果

以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞,在OMIM、Disgenet和Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)靶點(diǎn),經(jīng)合并去重后,得到疾病靶點(diǎn)5 317個(gè)。將其與384個(gè)活性成分的作用靶點(diǎn)構(gòu)建韋恩圖取交集(圖1),得到304個(gè)交集靶點(diǎn)。

圖1 花生紅衣多酚活性成分和動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.1 Venn diagrams of active components of peanut skin polyphenols and atherosclerosis targets

2.3 花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用String平臺(tái),對(duì)304個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用分析(圖2)。隱藏10個(gè)斷開(kāi)無(wú)連接節(jié)點(diǎn),經(jīng)分析共涉及到294個(gè)節(jié)點(diǎn),2 791條邊,平均節(jié)點(diǎn)度為18.4。靶點(diǎn)之間的大量相互作用說(shuō)明它們可能具有生物學(xué)上的相關(guān)性,并且花生紅衣多酚活性成分抗動(dòng)脈粥樣硬化可能涉及多個(gè)靶點(diǎn)。經(jīng)Cytoscape可視化分析,PPI網(wǎng)絡(luò)中DC、BC、CC均值分別為18.99、460.46、0.22。以三者均大于均值作為篩選條件,得到TP53、AKT1等核心靶點(diǎn)共65個(gè),根據(jù)DC排名前15的靶點(diǎn)如表3所示。

圖2 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of protein-protein interaction

2.4 GO和KEGG通路富集分析

以“P<0.05”為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)304個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。GO包括生物過(guò)程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組成(cell component, CC)。結(jié)果表明共得到GO功能富集條目1 205條,其中917個(gè)條目與生物過(guò)程方面相關(guān),194個(gè)條目與分子功能方面相關(guān),其余的94個(gè)條目與細(xì)胞組成相關(guān)。P值越小表征富集程度越高,對(duì)GO富集條目根據(jù)P值進(jìn)行排序,分別選取BP、MF和CC排名前10的條目繪制條形圖,如圖3所示。在生物過(guò)程方面,花生紅衣多酚主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、DNA為模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、基因表達(dá)的正向調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)向調(diào)控、對(duì)藥物的反應(yīng)、蛋白磷酸化等過(guò)程。在細(xì)胞組成方面,花生紅衣多酚主要作用于細(xì)胞液、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核漿、細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)等。同時(shí),分子功能結(jié)果表明,花生紅衣多酚的靶點(diǎn)主要富集于蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白同質(zhì)二聚體活性、蛋白激酶結(jié)合、蛋白激酶活性等。綜上可知,花生紅衣多酚可能通過(guò)以上眾多生物過(guò)程而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

圖3 GO功能富集分析圖Fig.3 GO function enrichment analysis注:response to drug:對(duì)藥物的反應(yīng);positive regulation of gene expression:基因表達(dá)的正向調(diào)控;negative regulation of apoptotic process:凋亡過(guò)程的負(fù)向調(diào)控;response to xenobiotic stimulus:對(duì)外源性刺激的反應(yīng);positive regulation of transcription, DNA-templated:DNA為模板轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控;positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter:RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控;protein phosphorylation:蛋白磷酸化;aging:老化;response to estradiol:對(duì)雌二醇的反應(yīng);peptidyl-serine phosphorylation:肽基-絲氨酸磷酸化;extracellular space:細(xì)胞外間隙;cytosol:細(xì)胞液;extracellular region:胞外區(qū);cytoplasm:細(xì)胞質(zhì);cell surface:細(xì)胞表面;macromolecular complex:大分子配合物;nucleoplasm:核漿;membrane raft:膜筏;nucleus:細(xì)胞核;extracellular exosome:細(xì)胞外外泌體;enzyme binding:酶結(jié)合;identical protein binding:相同蛋白結(jié)合;protein binding:蛋白結(jié)合;protein kinase activity:蛋白激酶活性;protein homodimerization activity:蛋白同質(zhì)二聚體活性;protein kinase binding:蛋白激酶結(jié)合;protein serine/threonine kinase activity:蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性;transcription factor binding:轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合;protein tyrosine kinase activity:蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性;RNA polymerase II transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding:RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性,配體激活序列特異性DNA結(jié)合。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,304個(gè)交集靶點(diǎn)共富集到相關(guān)通路176條。按照p值篩選排名前20的通路[11],并將其繪制成氣泡圖(圖4)。其中氣泡越大表示此信號(hào)通路富集的基因數(shù)目越多,氣泡顏色越紅表示此信號(hào)通路越顯著。結(jié)果顯示,花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用靶點(diǎn)主要富集在癌癥通路(101個(gè)靶點(diǎn))、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路(61個(gè)靶點(diǎn))、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化(56個(gè)靶點(diǎn))、卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(48個(gè)靶點(diǎn))、人巨細(xì)胞病毒感染(48個(gè)靶點(diǎn))、化學(xué)致癌-受體激活(45個(gè)靶點(diǎn))、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(40個(gè)靶點(diǎn))、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化(39個(gè)靶點(diǎn))、IL-17信號(hào)通路(33個(gè)靶點(diǎn))等。其中PI3K-Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑通路與動(dòng)脈粥樣硬化較為密切[13]。

圖4 KEGG通路富集分析圖Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis注:Pathways in cancer:癌癥通路;Prostate cancer:前列腺癌;Lipid and atherosclerosis:脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化;AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications:糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGE)-糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of AGEs,RAGE)信號(hào)通路;Hepatitis B:乙型肝炎;Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection:卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染;PI3K-Akt signaling pathway:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號(hào)通路;Human cytomegalovirus infection:人巨細(xì)胞病毒感染;Fluid shear stress and atherosclerosis:流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化;IL-17 signaling pathway:白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)信號(hào)通路;Pancreatic cancer:胰腺癌;Chemical carcinogenesis-receptor activation:化學(xué)致癌-受體激活;Hepatitis C:丙型肝炎;Bladder cancer:膀胱癌;Proteoglycans in cancer:癌癥蛋白多糖;EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance:EGFR 酪氨酸激酶抑制劑;Non-small cell lung cancer:非小細(xì)胞肺癌;Melanoma:黑色素瘤;Hepatocellular carcinoma:肝細(xì)胞癌(下同)。

2.5 花生紅衣多酚活性成分-靶點(diǎn)-通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

為了系統(tǒng)的闡述作用機(jī)制,利用Cytoscape軟件,構(gòu)建“花生紅衣多酚活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。其中紅色正方形代表花生紅衣多酚活性成分,綠色圓形代表靶點(diǎn),橙色三角形代表通路。每條邊代表花生紅衣多酚活性成分與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與通路之間的相互作用關(guān)系。結(jié)果表明,度值較高(高于平均值)的活性成分有槲皮素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、木犀草素、山奈酚、漆黃素、異鼠李素、白楊素,為花生紅衣多酚的主要活性成分。靶點(diǎn)AKT1、PIK3R1、MAPK1、EGFR和TP53顯示出較高的關(guān)聯(lián)度,是此關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。由圖5可知,花生紅衣多酚中每個(gè)活性成分均作用于多靶點(diǎn),如槲皮素作用于191個(gè)靶點(diǎn),表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯作用于141個(gè)靶點(diǎn)。此外,結(jié)果還表明,絕大部分靶點(diǎn)可與多個(gè)組分相互作用,且參與多條通路。如靶點(diǎn)HSP90AA1可與山奈酚、表兒茶素、兒茶素、原花青素B1、木犀草素、白楊素、漆黃素等多成分作用,參與PI3K-Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化以及IL-17信號(hào)通路。靶點(diǎn)AKT1能與山奈酚、漆黃素、木犀草素、白楊素、槲皮素、異鼠李素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯作用,參與PI3K-Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路。表明花生紅衣多酚是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行干預(yù)。

圖5 花生紅衣多酚活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 The network of “active components of peanut skin polyphenols-target-pathway”

3 分子對(duì)接

為進(jìn)一步明確花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合效能,選取花生紅衣酚類(lèi)主要7個(gè)活性成分與“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中前5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)分別為:AKT1(4EKL)、PIK3R1(4WAF)、MAPK1(4G6 N)、EGFR(2ITX)、TP53(5AOJ)。通常認(rèn)為,分子對(duì)接結(jié)合能<0時(shí)說(shuō)明兩分子具有自發(fā)結(jié)合能力,分子對(duì)接結(jié)合能<-5.0 kJ/mol(-1.2 kcal/mol)時(shí)則表明兩分子結(jié)合良好[14]。分子對(duì)接結(jié)合能越低,表明兩分子結(jié)合活性越好。分子對(duì)接結(jié)果如表4所示,所有的花生紅衣多酚活性成分與靶點(diǎn)都能良好的結(jié)合。山奈酚與靶點(diǎn)AKT1的結(jié)合能最低,為-8.52 kcal/mol;其次為表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯與靶點(diǎn)EGFR,為-8.46 kcal/mol。將每個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合最穩(wěn)定的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化,分別為山奈酚-AKT1、漆黃素-PIK3R1、木犀草素-MAPK1、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯-EGFR、木犀草素-TP53。由圖6可看出,所選活性成分與靶點(diǎn)均可通過(guò)氫鍵結(jié)合,如山奈酚與AKT1于GLU228、ALA230、ASP439處共形成4個(gè)氫鍵,其中作為氫鍵供體與GLU228形成2個(gè)氫鍵。漆黃素與PIK3R1在GLY451、LEU452和ARG574處形成氫鍵。表兒茶素沒(méi)食子酸酯則與EGFR于ARG776、VAL774、VAL769、ASP770、ASN771、LYS852、ASP1014、GLU1015、ILE1018多處形成氫鍵。

a-山奈酚-AKT1;b-漆黃素-PIK3R1;c-木犀草素-MAPK1;d-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯-EGFR;e-木犀草素-TP53圖6 花生紅衣多酚部分活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖Fig.6 Molecular docking map of some active components of peanut skin polyphenols and key targets注:淡紫色為靶點(diǎn)蛋白,綠色為活性成分,深紫色為形成氫鍵的氨基酸殘基,黃色為氫鍵,數(shù)值為氫鍵長(zhǎng)度。

4 討論

作為花生加工業(yè)的副產(chǎn)物,花生紅衣含有多種酚類(lèi)物質(zhì),可作為多酚化合物的膳食來(lái)源?；ㄉt衣多酚具有抑菌、抗氧化、降血脂等生理功能。近年來(lái),花生紅衣多酚類(lèi)物質(zhì)的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用引起了廣泛研究關(guān)注,但其活性成分及機(jī)制尚未完全闡明。為系統(tǒng)了解花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制,本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)其進(jìn)行研究。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及篩選后,共獲得13個(gè)花生紅衣多酚活性成分,分別為山奈酚、表兒茶素、漆黃素、兒茶素、木犀草素、槲皮素、原花青素B1、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯等。其中槲皮素具有廣泛的藥理學(xué)作用,如抗炎、抗氧化和抗增殖,可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)抑制高果糖喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化程度,降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大小[7]。表兒茶素可使ApoE*3-Leiden小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變面積減少,且可減弱主動(dòng)脈中由核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)調(diào)節(jié)的飲食誘導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化性的炎癥過(guò)程(如細(xì)胞趨化性、基質(zhì)重塑)[8]。在巨噬細(xì)胞模型中,木犀草素通過(guò)抑制活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生、促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-18和IL-1β)的表達(dá)、脂質(zhì)積累和NACHT-LRR-PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3(nacht,lrr and pyd domains-containing protein3,NLRP3)炎性小體的激活,從而減輕巨噬細(xì)胞極化、泡沫細(xì)胞的形成、凋亡和炎癥[15]。在巨噬細(xì)胞模型中,原花青素B1通過(guò)降低ROS水平,下調(diào)細(xì)胞表面膜分子中低親和力免疫球蛋白-γFc區(qū)受體Ⅲ/Ⅱ、腫瘤壞死因子受體超家族成員5、T淋巴細(xì)胞活化抗原CD86和Toll樣受體4的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用和抑制巨噬細(xì)胞凋亡[16]。由此可推測(cè),花生紅衣多酚通過(guò)多成分共同對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行干預(yù)。

通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?獲得花生紅衣多酚活性成分抗動(dòng)脈粥樣硬化的65個(gè)核心靶點(diǎn)。這些靶點(diǎn)主要包括TP53、STAT3、AKT1、EGFR、MAPK1、MAPK3、TNF等。EGFR屬于酪氨酸激酶型受體。研究發(fā)現(xiàn)EGFR參與血管病理生理過(guò)程和巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié),在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。在高脂飲食喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型中,小鼠血漿中EGFR磷酸化水平及其活性顯著增加;EGFR抑制劑能夠抑制氧化應(yīng)激、促炎細(xì)胞因子的誘導(dǎo)產(chǎn)生、泡沫細(xì)胞的形成以及平滑肌細(xì)胞增殖,從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的生成[17]。骨髓細(xì)胞EGFR的缺失能夠下調(diào)IL-6、TNF-α的表達(dá),減少脂質(zhì)的攝取和炎癥反應(yīng),從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[18]。SRC是SRC激酶家族中的一員,它在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞中內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的MAPK磷酸化和早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白-1的表達(dá)起著關(guān)鍵作用[19]。TAO等[20]的研究表明,SRC參與了形成泡沫細(xì)胞的信號(hào)通路Src/PI3K/Ras相關(guān)C3肉毒毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1),抑制SRC可降低PI3K的表達(dá)水平、Rac1的磷酸化和泡沫細(xì)胞的生成。作為PI3K-Akt信號(hào)通路的核心因子,AKT在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解、蛋白質(zhì)合成、脂肪生成、細(xì)胞增殖和凋亡等多種生物過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它可通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞凋亡[21]。在脂肪代謝過(guò)程中,活化AKT通過(guò)調(diào)控一系列與脂肪酸合成相關(guān)的基因表達(dá),增加細(xì)胞中脂肪酸和磷酸甘油酯的濃度[22]。MAPK1、MAPK3均屬于MAPKs家族,MAPKs調(diào)節(jié)基本的生物過(guò)程以及細(xì)胞對(duì)外部應(yīng)激信號(hào)的反應(yīng),并能夠調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)和凋亡介質(zhì)的合成[23]。TNF、IL-6與炎癥有關(guān),TNF可調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥、分化、增殖和凋亡等各種細(xì)胞過(guò)程[24]。IL-6通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞中的低密度脂蛋白受體和氧化脂蛋白受體-1的信使核糖核酸表達(dá),而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[25]。HSP90AA1屬于熱休克蛋白家族,可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、易位和轉(zhuǎn)錄[26]。有研究顯示,HSP90在動(dòng)脈粥樣硬化患者的斑塊中高度表達(dá),與斑塊不穩(wěn)定有關(guān)。HSP90也可通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖來(lái)減弱動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[27]。

KEGG富集的前20條通路中,與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的通路主要有 PI3K-Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑通路。脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化是主要的富集通路之一,共涉及56個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)活性成分-靶點(diǎn)-通路圖篩選的關(guān)鍵靶點(diǎn)TP53、PIK3R1、MAPK1、AKT1均富集于此通路中。PI3K-Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[7]。研究表明槲皮素能夠通過(guò)激活PI3K-Akt信號(hào)通路,使B細(xì)胞淋巴瘤因子2/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3信號(hào)通路失活,從而改善高果糖喂養(yǎng)引起的動(dòng)脈粥樣硬化[7]。流體剪切應(yīng)力是流動(dòng)血液與血管壁內(nèi)皮表面之間的一種摩擦力。動(dòng)脈粥樣硬化在一些特定區(qū)域形成病變,此區(qū)域的剪切應(yīng)力受到干擾[13]。內(nèi)皮細(xì)胞暴露受干擾的血流中時(shí),將激活MAPKs和NF-κB信號(hào)通路,進(jìn)而上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、CC類(lèi)趨化因子配體2(C-C motif chemokine 2,CCL2)、細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、TNF-α、IL-6的表達(dá),從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷、白細(xì)胞聚集和動(dòng)脈粥樣硬化[28-29]。IL-17信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)的研究表明,雖然IL-17在不同情況下可能起到促進(jìn)或抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,但可以肯定的是IL-17與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有著密切聯(lián)系[30]。因此,花生紅衣多酚可能是通過(guò)干預(yù)炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡、脂質(zhì)代謝等過(guò)程而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

綜上所述,本研究通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法,對(duì)花生紅衣多酚抗動(dòng)脈粥樣硬化的核心靶點(diǎn)和主要信號(hào)通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)。其中核心靶點(diǎn)有TP53、PIK3R1、MAPK1、AKT1、EGFR等,主要信號(hào)通路涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑通路。花生紅衣多酚是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)脂質(zhì)代謝、炎癥、細(xì)胞增殖和凋亡等多個(gè)生理過(guò)程而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,從而為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證花生紅衣抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制提供思路,同時(shí)也為花生紅衣抗動(dòng)脈粥樣硬化功能健康食品的開(kāi)發(fā)提供新的方向,后續(xù)還需進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等研究。