高效薄層色譜、薄層質(zhì)譜和HPLC指紋圖譜聯(lián)用技術(shù)鑒定杜仲不同部位的化學(xué)成分差異

劉 星，王 玲，姚 帥，張建青，果德安*

高效薄層色譜、薄層質(zhì)譜和HPLC指紋圖譜聯(lián)用技術(shù)鑒定杜仲不同部位的化學(xué)成分差異

劉 星1, 2，王 玲2，姚 帥2，張建青2，果德安1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)國(guó)家工程研究中心，上海 201203

建立杜仲不同部位的高效薄層色譜（high performance thin layer chromatography，HPTLC）、高效薄層質(zhì)譜鑒別方法（TLC/MS）和高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，比較杜仲皮、葉、雄花、種子的差異，尋找差異性成分，并互相驗(yàn)證，用于杜仲的質(zhì)量控制。通過(guò)優(yōu)化供試品制備、展開劑和顯色劑等條件，建立杜仲皮的HPTLC，并將該方法應(yīng)用于杜仲皮、葉、雄花、種子的區(qū)分，尋找差異性斑點(diǎn)；利用QTOF/MS對(duì)4個(gè)部位的HPTLC斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定，明確差異性成分；采用HPLC建立杜仲皮、葉、雄花、種子的指紋圖譜，采集多批次數(shù)據(jù)，利用偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）篩選對(duì)4個(gè)部位區(qū)分貢獻(xiàn)較大的差異性成分，與薄層色譜和薄層質(zhì)譜鑒定結(jié)果互相驗(yàn)證。自建HPTLC鑒別方法優(yōu)于各國(guó)藥典，可清晰地實(shí)現(xiàn)4個(gè)部位的區(qū)分；利用QTOF/MS對(duì)主要斑點(diǎn)進(jìn)行分析，共鑒定27個(gè)成分，其中10個(gè)成分通過(guò)對(duì)照品確認(rèn)；基于HPLC的PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析篩選出14個(gè)差異性成分（VIP＞1）。松脂醇二葡萄糖苷在HPTLC、TLC/MS和HPLC檢測(cè)技術(shù)下均鑒定為杜仲皮的特異性成分；ulmoidoside A、ulmoidoside B、ulmoidoside C、ulmoidoside D是種子中穩(wěn)定的差異性標(biāo)志物；對(duì)于葉和花的鑒別，3種鑒別方式所得到的差異性標(biāo)志物差別較大，葉中共找到7個(gè)標(biāo)志物，花中共找到9個(gè)標(biāo)志物。建立的高效薄層色譜、薄層質(zhì)譜和HPLC指紋圖譜方法均可實(shí)現(xiàn)杜仲皮、葉、雄花、種子的區(qū)分，聯(lián)用技術(shù)尋找到的差異性成分為杜仲及其中成藥質(zhì)量控制指標(biāo)的選擇奠定基礎(chǔ)。

杜仲；不同部位；薄層色譜；薄層質(zhì)譜；指紋圖譜；多元統(tǒng)計(jì)分析；松脂醇二葡萄糖苷

杜仲Oliv.為杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，是我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物。其干燥樹皮是名貴中藥杜仲，干燥葉是另一味中藥杜仲葉。2者都被收載于《中國(guó)藥典》2020年版中，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，用于治療肝腎不足、腰膝酸痛等[1]。杜仲樹需生長(zhǎng)15年以上其樹皮方可做藥用，藥用資源緊張[2]。近年來(lái)，人們對(duì)杜仲非傳統(tǒng)藥用部位葉、雄花、種子的化學(xué)成分和藥理作用開展了系統(tǒng)的研究[3-6]。杜仲皮、葉、雄花、種子化學(xué)成分相似，主要為木脂素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯丙素類[7-8]。市場(chǎng)上植物提取物、中藥制劑、保健品中存在藥用部位與非藥用部位相互摻雜的現(xiàn)象。因此有必要建立區(qū)分杜仲不同部位的質(zhì)量控制方法。

目前報(bào)道的文獻(xiàn)大多是針對(duì)杜仲皮建立薄層色譜鑒別[9-10]或指紋圖譜鑒別方法[11-13]，尚未有文獻(xiàn)建立薄層色譜質(zhì)譜或指紋圖譜鑒別方法對(duì)杜仲皮、葉、雄花、種子4個(gè)部位同時(shí)進(jìn)行區(qū)分，本研究從高效薄層色譜（high performance thin layer chromatography，HPTLC）、薄層質(zhì)譜（thin layer chromatography-mass spectrometry，TLC/MS)、HPLC指紋圖譜3個(gè)層面建立杜仲不同部位的分析方法，并結(jié)合偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等化學(xué)模式識(shí)別方法，揭示杜仲不同部位間的差異，為杜仲藥材質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPTLC系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司），包括薄層自動(dòng)點(diǎn)樣儀ATS4、薄層成像儀VISUALIZER、薄層自動(dòng)展開儀ADC2、薄層自動(dòng)浸漬器、薄層板加熱器III和visionCATS工作站；Waters ACQUITY Arc高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），配有二元泵、柱溫箱、樣品管理器、PDA 2998檢測(cè)器；UPLC-QTOF/MS系統(tǒng)由Waters ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀和Waters Xevo G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀組成；Quintix 224-1CN-1型電子天平（賽多利斯北京有限公司）；Milli-Q Integral型超純水系統(tǒng)（美國(guó)默克公司）；P180H超聲波水浴鍋（德國(guó)埃爾瑪公司）。

1.2 藥物與試劑

對(duì)照品松脂醇二葡萄糖苷（批號(hào)8963）、松脂醇單葡萄糖苷（批號(hào)9285）、丁香樹脂醇雙葡萄糖苷（批號(hào)8792）、京尼平苷（批號(hào)8598）、京尼平苷酸（批號(hào)1241）、車葉草苷酸（批號(hào)9614）、桃葉珊瑚苷（批號(hào)7683）均購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；杜仲樹脂酚雙葡萄糖苷（批號(hào)PS012113）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；綠原酸（批號(hào)110753-202018，96.1%）、蘆?。ㄅ?hào)100080-202012，91.6%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；液相分析試劑用乙腈為色譜純（美國(guó)霍尼韋爾公司）；磷酸為分析純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；樣品制備及薄層展開用甲醇、二氯甲烷、冰醋酸等溶劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司）。

1.3 樣品

共收集15批杜仲皮、9批杜仲葉、10批杜仲雄花、9批杜仲種子，樣品產(chǎn)地見表1。藥材均由上海藥物研究所中藥現(xiàn)代化中心姚帥高級(jí)實(shí)驗(yàn)師通過(guò)性狀、顯微等鑒定為杜仲.Oliv.。

表1 杜仲皮、葉、雄花、種子樣品信息

2 方法

2.1 TLC/MS分析

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取對(duì)照品松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香樹脂醇雙葡萄糖苷、京尼平苷酸、車葉草苷酸、桃葉珊瑚苷適量，加甲醇溶解配成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.25、0.25、0.50、0.50、0.50 mg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.1.2 薄層色譜供試品溶液的制備 精密稱取杜仲皮、葉、雄花、種子粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，加甲醇5 mL，超聲處理（功率1130 W，頻率37 kHz）15 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.1.3 質(zhì)譜供試品溶液的制備 取已展開的高效薄層板，沿展開方向剪取部分條帶，經(jīng)顯色后置可見光下檢視定位斑點(diǎn)，未顯色部分按定位結(jié)果刮取對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，加50%甲醇1 mL超聲處理30 min，14 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.1.4 薄層色譜條件 采用超高效薄層色譜板G60 F254（20 cm×10 cm，Merck，Darmstadt，德國(guó)）。吸取對(duì)照品、供試品溶液各10 μL，以條帶狀方式點(diǎn)樣于高效薄層板上，以二氯甲烷-冰醋酸-甲醇-水（15∶6∶2∶2）為展開劑，展開，取出，晾干；以10%硫酸乙醇為顯色劑，浸10%硫酸乙醇之后105 ℃加熱5 min顯色，置可見光下檢視。

2.1.5 質(zhì)譜條件 電噴霧ESI源，負(fù)離子模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓1.0 kV；錐孔電壓40 V；source offset 80 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑溫度450 ℃；脫溶劑體積流量800 L/h；質(zhì)譜掃描方式為Fast DDA，掃描范圍為100～1500，掃描時(shí)間0.20 s；碰撞能設(shè)置為低質(zhì)量端裂解能量10～20 V，高質(zhì)量端裂解能量40～50 V。

2.2 HPLC分析

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香樹脂醇雙葡萄糖苷、杜仲樹脂酚雙葡萄糖苷、京尼平苷、京尼平苷酸、綠原酸、蘆丁適量，加甲醇溶解配成質(zhì)量濃度分別為50、50、100、50、50、100、100、100 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取杜仲皮、葉、雄花、種子細(xì)粉（過(guò)3號(hào)篩）0.6 g，加50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率1130 W，頻率37 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，14 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 色譜條件 采用Waters HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～48 min，5%～21% A；48～60 min，21%～36% A）。柱溫為30 ℃，體積流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPTLC方法的優(yōu)化

對(duì)HPTLC供試品制備方式、展開劑和顯色劑進(jìn)行了優(yōu)化。以杜仲皮為對(duì)象，比較了《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《韓國(guó)藥典》和《歐洲藥典》中的供試品制備方式以及4種自建的制備方法，具體見表2。

不同迭代下,3種算法的MAPE的性能對(duì)比如圖2所示。由圖2可知,隨著迭代次數(shù)的增加,3種模型的錯(cuò)誤率都逐漸下降,這是由于隨著訓(xùn)練次數(shù)增加網(wǎng)絡(luò)參數(shù)的分布越來(lái)越接近最小值點(diǎn)。但是BP網(wǎng)絡(luò)在達(dá)到一定的訓(xùn)練次數(shù)后錯(cuò)誤率出現(xiàn)震蕩并且有逐漸增加的趨勢(shì),而SVM和高斯過(guò)程回歸的錯(cuò)誤率穩(wěn)定下降,這間接的證明了這兩種算法可以使網(wǎng)絡(luò)初始參數(shù)的分布區(qū)域更加接近最小值點(diǎn),并且有效地避免了局部震蕩。對(duì)比這兩類算法,高斯過(guò)程回歸算法錯(cuò)誤率更低,效率更高。

表2 供試品制備方法

結(jié)果表明，不同提取方式在不同顯色劑下得到的圖譜輪廓具有較大差異，其中方法《韓國(guó)藥典》、自建方法1、2得到成分較為豐富，自建方法1（甲醇超聲處理15 min）相比于其他制備方法操作簡(jiǎn)便省時(shí)，背景干擾較小，因此作為最終供試品制備方式。色譜條件方面考察二氯甲烷-甲醇-甲酸（30∶10∶1）、三氯甲烷-甲醇-水（10∶5∶1）、甲苯-乙酸乙酯-甲酸（65∶35∶1）、二氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（15∶2∶6∶2）4種展開劑對(duì)杜仲薄層分離的影響，結(jié)果表明展開劑三氯甲烷-甲醇-水（10∶5∶1）和二氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（15∶2∶6∶2）獲得的薄層斑點(diǎn)較多，斑點(diǎn)細(xì)窄。進(jìn)一步考察了硫酸-水（2∶8）、稀硫酸試液、茴香醛試液、10%硫酸乙醇試液等顯色劑，結(jié)果表明，采用10%硫酸乙醇試液顯色劑獲得條帶清晰、斑點(diǎn)分離度好，因此最終選擇二氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（15∶2∶6∶2）用于杜仲藥材的薄層分析，結(jié)果見圖1。

3.2 杜仲不同部位的HPTLC及區(qū)分

采用上述供試品制備和色譜條件，對(duì)杜仲皮、葉、雄花、種子進(jìn)行分析，代表性樣品結(jié)果如圖2所示。從整體上看，杜仲皮和種子的斑點(diǎn)較少，葉和花的斑點(diǎn)較多。薄層板底部的斑點(diǎn)（Rf＝0.10、0.14、0.17，棕色）以及Rf＝0.36處的紅褐色斑點(diǎn)在皮、葉中均可觀察到；在杜仲皮中，Rf＝0.32處的棕色斑點(diǎn)在葉、雄花、種子中觀察不到，可作為區(qū)分皮與其他部位的特征斑點(diǎn)；在杜仲葉中，除了Rf值在0.1～0.2的棕色斑點(diǎn)以及Rf＝0.36的斑點(diǎn)外，還可以觀察到Rf＝0.27（棕色），Rf＝0.54（紅褐色），Rf＝0.85（紅褐色）處幾個(gè)顏色較深的主斑點(diǎn)，說(shuō)明這些成分在葉中的含量較高，其中Rf＝0.85處的紅褐色斑點(diǎn)僅存在于杜仲葉中可作為其特征斑點(diǎn)。在杜仲雄花中，斑點(diǎn)Rf＝0.1（黑色），Rf＝0.24（紅褐色），Rf＝0.36（紅褐色），Rf＝0.45（紫色）為主要斑點(diǎn)，但杜仲種子在Rf＝0.1和Rf＝0.24，杜仲皮和葉在Rf＝0.36存在與花顏色相近的斑點(diǎn)，因此將Rf＝0.45的紫色斑點(diǎn)作為花的特征斑點(diǎn)。此外，Rf＝0.38處的細(xì)藍(lán)棕色斑點(diǎn)，Rf＝0.63處的黃色斑點(diǎn)以及Rf＝0.67和Rf＝0.71處的2個(gè)紫色斑點(diǎn)僅存在于杜仲雄花中，也可以作為其特征斑點(diǎn)。在種子中，斑點(diǎn)較少且顏色相近，主要集中于薄層板的下三分之一處，與其他部位的條帶輪廓差異較大。各個(gè)薄層斑點(diǎn)通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行鑒別并用對(duì)照品進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，見表3。

A-展開劑為二氯甲烷-甲醇-甲酸（30∶10∶1），顯色劑為硫酸-水（2∶8） B-展開劑為三氯甲烷-甲醇-水（10∶5∶1），顯色劑為稀硫酸試液 C-展開劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸（65∶35∶1），顯色劑為茴香醛試液 D-展開劑為二氯甲烷-甲醇-冰醋酸：水（15∶2∶6∶2），顯色劑為10%硫酸乙醇試液；條帶1、2、3、4、5、6、7的供試品制備方式分別對(duì)應(yīng)文中所述的《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《韓國(guó)藥典》《歐洲藥典》及4種自建方法

3.3 杜仲不同部位的TLC/MS鑒定及區(qū)分

通過(guò)質(zhì)譜對(duì)薄層色譜得到的主要斑點(diǎn)和差異性斑點(diǎn)進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步明確杜仲皮、葉、雄花、種子所含成分的差異。取“2.1.3”項(xiàng)下制備的4個(gè)部位斑點(diǎn)的供試品溶液，進(jìn)行UPLC-QTOF/MS分析，共檢測(cè)到31個(gè)成分，杜仲皮的薄層斑點(diǎn)檢測(cè)到7個(gè)成分（圖3），主要是木脂素類；杜仲葉、雄花的薄層斑點(diǎn)各檢測(cè)到17個(gè)成分（圖4、5），主要是黃酮類；杜仲種子的薄層斑點(diǎn)檢測(cè)到9個(gè)成分（圖6），主要是環(huán)烯醚萜類。從4個(gè)部位共鑒定了27個(gè)成分，舉例說(shuō)明具體鑒定過(guò)程：斑點(diǎn)p4（Rf＝0.32），一級(jí)質(zhì)譜圖可見加和離子峰727.242 0（[M－H＋HCOOH]?）和準(zhǔn)分子離子峰681.240 8（[M－H]?），二級(jí)質(zhì)譜圖中可見519.186 3（[M－H－Glc]?）、357.133 6（[M－H－2Glc]?）、151.038 7（[M－H－C24H34O13]?）等碎片，151.038 7是四氫呋喃環(huán)裂解后形成的特征離子，根據(jù)這些碎片信息初步將斑點(diǎn)p4（Rf＝0.32）鑒定為松脂醇二葡萄糖苷，用該對(duì)照品進(jìn)行驗(yàn)證，薄層板上相同Rf值處出現(xiàn)顏色相同的斑點(diǎn)（圖2），鑒定結(jié)果可靠準(zhǔn)確。斑點(diǎn)p3（Rf＝0.36）的TIC圖中可見3個(gè)色譜峰，對(duì)應(yīng)的母離子分別為373.114 1（[M－H]?），787.267 3（[M－H＋HCOOH]?），520.179 4（[M－H]?），根據(jù)它們的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息，推測(cè)該斑點(diǎn)可能含有京尼平苷酸、丁香樹脂醇雙葡萄糖苷、eucomoside B，用對(duì)照品進(jìn)行驗(yàn)證（圖2），斑點(diǎn)p3（Rf＝0.34）含有丁香樹脂醇雙葡萄糖苷、京尼平苷酸，由于沒(méi)有eucomoside B對(duì)照品，所以該成分未進(jìn)行驗(yàn)證。鑒定的27個(gè)成分中共有6個(gè)成分用對(duì)照品在薄層板上進(jìn)行了驗(yàn)證（圖2）。

表3 杜仲不同部位斑點(diǎn)的質(zhì)譜信息

*表示與對(duì)照品比對(duì)確認(rèn) “＋”-檢測(cè)到 “?”-未檢測(cè)到

“*” refers to the compound identified by comparing with reference standard “+”- detected “-”-not detected

圖3 杜仲皮的TLC/MS圖譜

圖4 杜仲葉的TLC/MS圖譜

圖5 杜仲雄花的TLC/MS圖譜

圖6 杜仲種子的TLC/MS圖譜

京尼平苷酸是4個(gè)部位的共有成分，eucomoside B是皮、葉、花的共有成分，桃葉珊瑚苷、191.054 8、387.112 5是葉、花、種子的共有成分?；衔颩1：松脂醇單葡萄糖苷、M3：丁香樹脂醇雙葡萄糖苷、M6：松脂醇二葡萄糖苷、M7：1-羥基松脂醇雙葡萄糖苷僅存在于杜仲皮中?；衔颩9：285--Glc（447.094 0）、M10：301--Glc（463.087 7）、M11：285--Glc-Rha（593.148 7）、M16：301--Glc-Mal（549.084 2）、M18：285--Glc-Glc-Mal（695.147 8）僅存在于杜仲葉中?；衔颩23：車葉草苷酸、M24：285--Rha-Glc（593.153 6）、M25：301--Glc-Glc（625.138 7）、M26：301--Glc-Rha（609.147 2）僅存在于杜仲雄花中?；衔颩27：ulmoidoside B、M28：729.2250、M29：ulmoidoside D、M30：ulmoidoside A、M31：ulmoidoside C僅存在于杜仲種子。這些差異性成分對(duì)應(yīng)的薄層斑點(diǎn)體現(xiàn)在杜仲皮中p1（Rf＝0.51），p3（Rf＝0.36），p4（Rf＝0.32），p5（Rf＝0.17），杜仲葉中y2：（Rf＝0.40），y4：（Rf＝0.32），y5：（Rf＝0.24），y7：（Rf＝0.14），杜仲雄花中h2：（Rf＝0.38），h4：（Rf＝0.24），h5：（Rf＝0.20），杜仲種子中z2：（Rf＝0.27），z3：（Rf＝0.24），z4：（Rf＝0.19），z5：（Rf＝0.14），z6：（Rf＝0.10）。這些差異性的斑點(diǎn)及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜信號(hào)可作為杜仲不同部位薄層質(zhì)譜區(qū)分的特征。

3.4 杜仲不同部位的HPLC色譜及差異性區(qū)分

按照“2.2.3”項(xiàng)方法，采用建立的HPLC指紋圖譜方法，對(duì)15批杜仲皮、9批杜仲葉、10批杜仲雄花、9批杜仲種子的指紋圖譜進(jìn)行采集。為檢測(cè)儀器穩(wěn)定性，每隔6針進(jìn)1針QC溶液。各部位疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜如圖7所示。15批杜仲皮標(biāo)定了13個(gè)共有峰，9批杜仲葉標(biāo)定了15個(gè)共有峰，10批杜仲雄花標(biāo)定了14個(gè)共有峰，9批杜仲種子標(biāo)定了13個(gè)共有峰。4個(gè)部位指紋圖譜的輪廓圖表明杜仲皮中的峰7，杜仲葉中的峰5、6，杜仲雄花中的峰8、9，杜仲種子中的峰10、11、12、13是明顯有差異的色譜峰。

皮：1-京尼平苷酸 5-京尼平苷 7-松脂醇二葡萄糖苷 10-杜仲樹脂酚雙葡萄糖苷 11-丁香樹脂醇雙葡萄糖苷 13-松脂醇單葡萄糖苷；葉： 2-京尼平苷酸 5-綠原酸 10-蘆?。恍刍ǎ?-京尼平苷酸 4-綠原酸 6-京尼平苷 9-蘆丁

為了全面、科學(xué)、客觀地找尋區(qū)分4個(gè)部位的差異性成分，將15批杜仲皮，9批杜仲葉，10批杜仲雄花，9批杜仲種子的各色譜峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-14.1軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用PLS-DA模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，標(biāo)度化方法為Par，自變量累積解釋能力參數(shù)（2）為0.934，因變量累積解釋能力參數(shù)（2）為0.972，預(yù)測(cè)能力參數(shù)（2）為0.934，均大于0.5，說(shuō)明建立模型有較好的解析能力和預(yù)測(cè)能力。對(duì)該模型進(jìn)行擾動(dòng)測(cè)試，200次驗(yàn)證結(jié)果顯示，2和2在縱軸的截距分別為0.248，?0.529，說(shuō)明PLS-DA沒(méi)有過(guò)擬合情況，預(yù)測(cè)結(jié)果可靠（圖7-C）。由PLS-DA得分圖（圖7-B）可知杜仲皮、葉、花、種子樣品能夠?qū)崿F(xiàn)很好的區(qū)分，說(shuō)明4個(gè)部位之間的化學(xué)成分存在差異。以VIP值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到14個(gè)差異性成分，分別為皮：峰7（松脂醇二葡萄糖苷，R＝34.424 min）；葉：峰5（綠原酸，R＝23.388 min），峰6（R＝24.588 min），峰l4（R＝51.752 min），峰12（R＝45.667 min）；雄花：峰3（京尼平苷酸，R＝11.768 min），峰8（R＝36.423 min），峰6（京尼平苷，R＝27.728 min），峰9（蘆丁，R＝39.801 min），峰13（R＝51.988 min）；種子：峰10（ulmoidoside A，R＝50.433 min），峰11（ulmoidoside C，R＝55.286 min），峰12（ulmoidoside D，R＝56.351 min），峰13（ulmoidoside B，R＝57.781 min）。綜合考慮4個(gè)部位指紋圖譜的輪廓圖中差異明顯的色譜峰以及VIP值篩選出的差異性成分，將皮中峰7（松脂醇二葡萄糖苷）作為皮的特征峰；葉中峰6（R＝24.588 min）作為葉的特征峰；雄花中峰8（R＝36.423 min）作為雄花的特征峰；種子中峰10（ulmoidoside A），峰11（ulmoidoside C），峰12（ulmoidoside D），峰13（ulmoidoside B）作為種子的特征峰。

3.5 HPTLC、TLC/MS和HPLC指紋圖譜對(duì)杜仲不同部位差異性成分闡述

4 討論

HPTLC方法是《中國(guó)藥典》2020年版法定的鑒別手段，尤其隨著自動(dòng)點(diǎn)樣儀、自動(dòng)展開儀、薄層自動(dòng)浸漬器等全自動(dòng)儀器的普及，使得傳統(tǒng)的薄層色譜也能夠?qū)崿F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的操作，增加了薄層色譜的重現(xiàn)性。但薄層色譜仍面臨需要主觀判斷、斑點(diǎn)鑒定難、共流出嚴(yán)重的困境。TLC/MS聯(lián)用技術(shù)很大程度上可以改善這種劣勢(shì)，在薄層保留時(shí)間和斑點(diǎn)顏色的基礎(chǔ)上，提供了精確的相對(duì)分子質(zhì)量和碎片信息，增加了新維度的信息，使得鑒定結(jié)果更為可靠。

表4 高效薄層色譜、薄層質(zhì)譜和液相指紋圖譜檢測(cè)到的差異性成分

在杜仲不同部位的鑒定中，利用薄層質(zhì)譜在葉中找到了5個(gè)特征成分，同時(shí)檢測(cè)這5個(gè)特征成分，比薄層的1個(gè)斑點(diǎn)，液相的1個(gè)特征峰的鑒定結(jié)果更為客觀、可靠。在本研究中，也存在薄層色譜尋找到的差異性斑點(diǎn)未在質(zhì)譜中檢測(cè)到的情況，可能是由于該成分質(zhì)譜響應(yīng)較差，如葉中Rf＝0.85（紅褐色）的斑點(diǎn)。

本研究中，由于客觀原因，采用的是離線的薄層質(zhì)譜聯(lián)用，操作較為復(fù)雜，但當(dāng)薄層和質(zhì)譜在線聯(lián)用的時(shí)候，則有可能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作。考慮到高分辨質(zhì)譜費(fèi)用比較昂貴，可以將薄層色譜與低分辨質(zhì)譜聯(lián)用，也可以取得類似的結(jié)果。薄層質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥，尤其是在中成藥的鑒別方面是一種非常有潛力且容易推廣的技術(shù)，一方面能夠在復(fù)雜體系和共流出嚴(yán)重的情況下監(jiān)控目標(biāo)化合物，另一方面可實(shí)現(xiàn)多味藥的同時(shí)鑒別，改變《中國(guó)藥典》中成藥中“一味藥一薄層方法”現(xiàn)狀，縮短檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1]中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 173.

[2]郭姝, 劉杰, 李娜, 等. 指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)杜仲葉代替杜仲皮的可行性 [J]. 中藥材, 2020, 43(4): 896-902.

[3]Luo L F, Wu W H, Zhou Y J,. Antihypertensive effect ofOliv. extracts in spontaneously hypertensive rats [J]., 2010, 129(2): 238-243.

[4]He M Z, Jia J, Li J M,. Application of characteristic ion filtering with ultra-high performance liquid chromatography quadrupole time of flight tandem mass spectrometry for rapid detection and identification of chemical profiling inOliv [J]., 2018, 1554: 81-91.

[5]雒曉梅, 宿美鳳, 常曉燕, 等. 基于LC-MS聯(lián)用的杜仲主要化學(xué)成分定性及定量分析 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2019, 21(8): 1029-1040.

[6]Jia J, Liu M, Wen Q,. Screening of anti-complement active ingredients fromOliv. branches and their metabolismbased on UHPLC-Q-TOF/MS/MS [J]., 2019, 1124: 26-36.

[7]馮淼, 王超純, 凌偉紅, 等. 基于指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別評(píng)價(jià)杜仲葉質(zhì)量[J]. 中草藥, 2023, 54(9): 2931-2939.

[8]Wang C Y, Tang L, He J W,. Ethnobotany, phytochemistry and pharmacological properties of: A review [J]., 2019, 47(2): 259-300.

[9]韓磊, 鄧翀, 宋小妹. 杜仲生品及其炮制品的薄層色譜鑒別 [J]. 黑龍江科技信息, 2015(16): 121.

[10]劉玲, 鮑家科. 杜仲藥材薄層色譜鑒別研究 [J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥, 2014, 23(2): 8-9.

[11]范彥博, 袁明洋, 張義生. 四川產(chǎn)杜仲藥材高效液相色譜指紋圖譜的建立 [J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2016, 35(10): 1121-1124.

[12]劉星, 周欣, 周美, 等. 貴州產(chǎn)杜仲高效液相色譜指紋圖譜的建立與分析 [J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2015, 34(1): 84-88.

[13]資文, 劉韶, 彭應(yīng)枝. 基于指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)篩選張家界產(chǎn)杜仲的標(biāo)志性成分 [J]. 中藥材, 2015, 38(9): 1831-1834.

Chemical variance in different parts ofby HPTLC, TLC/MS and HPLC hyphenated techniques

LIU Xing1, 2, WANG Ling2, YAO Shuai2, ZHANG Jian-qing2, GUO De-an1, 2

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. National Engineering Laboratory for TCM Standardization Technology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

To establish the high performance thin layer chromatography (HPTLC), thin layer chromatography-mass spectrometry (TLC/MS) and high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint for the identification of bark, leaf, flower and seed of Duzhong (Oliv.) and differential components were filtrated and verified for the quality control of.HPTLC method was established by optimizing the sample preparation, mobile phase and derivatization reagent and applied to identify the bark, leaf, male flower, seed ofbased on the specific spots and/or peaks. HPTLC spots in four parts were then identified through quadrupole time of flight mass spectrometry (QTOF/MS) to find the differential components. HPLC was used to establish the fingerprints of bark, leaf, flower and seed of. Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) was used to screen the chemical markers that contributed greatly to the differentiation of the 4 parts based on multiple batches of data and the results were verified with TLC and TLC/MS.HPTLC identification method is the best compared to the method reported in pharmacopoeia from other countries, and can clearly distinguish the four parts. Additionally, the main spots were analyzed by QTOF/MS, and a total of 27 components were identified, 10 of which were confirmed by reference substances. Fourteen differential components (VIP > 1) were screened out by PLS-DA based on HPLC. According to the results obtained by HPTLC, TLC/MS and HPLC, pinoresinol diglucoside were selected as the characteristic component of bark, ulmoidoside A, ulmoidoside B, ulmoidoside C, ulmoidoside D as the robust markers in seed. The differential markers obtained by these three methods varied widely, with seven markers in leaf, nine markers in flower in total.HPTLC, TLC/MS, HPLC methods established could be used to effectively distinguish bark, leaf, flower and seed of, and the screened differential components lay a solid foundation for the selection of quality control indexes ofand its related Chinese patent medicines.

Oliv.; different parts; HPTLC; TLC/MS; HPLC fingerprint; multivariate statistical analysis; pinoresinol diglucoside

R286.2

A

0253 - 2670(2023)21- 7166 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.025

2023-03-06

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82003940）；岐黃工程首席科學(xué)家項(xiàng)目（2020）

劉 星，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橘|(zhì)量控制方法研究。E-mail: 15136456231@163.com

通信作者：果德安，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥分析與現(xiàn)代質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: (021)50271516 E-mail: daguo@simm.ac.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]