基于緊密連接通路探討芍藥苷改善膽汁淤積的作用機制

章方玲，謝 進(jìn)，吳和霏，李煜兵，鄧昕雨，陳 沅，胡啟超，馬 驍*

?藥理與臨床?

基于緊密連接通路探討芍藥苷改善膽汁淤積的作用機制

章方玲1，謝 進(jìn)2#，吳和霏1，李煜兵1，鄧昕雨1，陳 沅1，胡啟超1，馬 驍1*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心 藥劑科，北京 100039

基于蛋白組學(xué)和實驗驗證探討芍藥苷通過緊密連接通路改善膽汁淤積的作用。SD大鼠隨機分為對照組、模型組、熊去氧膽酸（60 mg/kg）組和芍藥苷高、中、低劑量（200、100、50 mg/kg）組，每組8只。連續(xù)7 d ig相應(yīng)藥物，于第4天給藥2 h后ig α-萘異硫氰酸酯（60 mg/kg）誘導(dǎo)肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型。末次給藥后，采用試劑盒測定大鼠血清中肝功能指標(biāo)；蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠肝臟組織病理變化；蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)篩選芍藥苷改善膽汁淤積的關(guān)鍵通路；分子對接確定芍藥苷與相關(guān)靶點的結(jié)合能；qRT-PCR和Western blotting驗證大鼠肝組織中關(guān)鍵靶點閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）、密封蛋白1/2/3（Claudin 1/2/3）和連接黏附分子-A（junctional adhesion molecule-A，JAM-A）的表達(dá)。藥效學(xué)結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）活性及總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）水平均顯著升高（＜0.01），肝組織可見大量炎性細(xì)胞浸潤，伴隨著肝細(xì)胞變性壞死，而經(jīng)芍藥苷治療后上述指標(biāo)得到顯著改善（＜0.05、0.01）。蛋白組學(xué)結(jié)果表明芍藥苷主要通過凋亡途徑、免疫炎癥過程、代謝通路、細(xì)胞周期通路、膽汁酸分泌通路與緊密連接通路等發(fā)揮改善膽汁淤積的作用。選擇緊密連接通路進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果表明，與對照組比較，模型組大鼠肝組織、、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），ZO-1、Occludin和Claudin 3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），經(jīng)芍藥苷干預(yù)后以上緊密連接通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01）。芍藥苷可以多途徑、多靶點緩解大鼠膽汁淤積，是治療膽汁淤積的潛在藥物，緊密連接通路可能是芍藥苷改善膽汁淤積的關(guān)鍵通路。

芍藥苷；膽汁淤積；肝損傷；蛋白組學(xué)；緊密連接

膽汁淤積是指肝內(nèi)膽汁形成和排泄障礙，或肝外膽道受阻，導(dǎo)致膽汁酸或膽鹽潴留的一種病理狀態(tài)[1]。臨床上，膽汁淤積的早期表現(xiàn)為堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）活性升高，隨著疾病的發(fā)展會出現(xiàn)黃疸、瘙癢等癥狀。膽汁淤積與原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cholangitis，PBC）、原發(fā)性硬化性膽管炎（primary sclerotic cholangitis，PSC）等多種嚴(yán)重性肝病緊密相關(guān)。熊去氧膽酸（ursodesoxycholic acid，UDCA）可以減緩PBC的進(jìn)展，被廣泛應(yīng)用于膽汁淤積的治療。然而，臨床研究發(fā)現(xiàn)部分患者對UDCA反應(yīng)不佳，且UDCA的治療并不能提高PSC患者的生存率[2]。奧貝膽酸同樣在臨床上常被用于膽汁淤積的治療，但是奧貝膽酸被報道會引起患者嚴(yán)重的瘙癢[3]。由于這種有限的治療，尋找和挖掘更多的替代療法與潛在藥物顯現(xiàn)出極大的必要性。

芍藥苷是1963年首次從芍藥Pall.中提取的一種水溶性單帖化合物[4]。已經(jīng)有大量研究表明，芍藥苷具有廣泛的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。此外，芍藥苷還具有抗氧化、抗抑郁、抗血栓、抗驚厥、抗腫瘤等藥理活性[5]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可以通過線粒體依賴途徑抑制細(xì)胞凋亡；可以抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，上調(diào)膽汁淤積中膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白2（multidrug resistance protein 2，MRP2）、牛磺膽酸鈉轉(zhuǎn)運蛋白（Na+taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）等轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)；可以激活沉默調(diào)節(jié)蛋白1（sirtuin 1，SIRT1）-法尼醇受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）信號通路，多途徑地改善大鼠膽汁淤積性肝損傷[6-8]。然而，肝內(nèi)膽汁淤積的病理機制復(fù)雜，涉及多種因素。因此，基于分子生物學(xué)的單因素研究可能無法系統(tǒng)、準(zhǔn)確地解釋肝內(nèi)膽汁淤積的發(fā)病機制。

高通量分子生物技術(shù)被廣泛應(yīng)用于揭示復(fù)雜的生物學(xué)過程和表型。蛋白組學(xué)旨在識別和理解組織或細(xì)胞中特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，有助于在翻譯水平上確定基因表達(dá)、了解蛋白修飾以及蛋白之間相互作用，可以深層次地挖掘藥物作用的關(guān)鍵因子，為藥物的作用提供更全面的理解[9]。因此，本研究基于蛋白組學(xué)分析，構(gòu)建生物體機制調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選具備潛在研究價值的顯著性作用通路，并進(jìn)一步利用分子生物學(xué)手段對潛在通路進(jìn)行驗證，旨在為芍藥苷治療膽汁淤積的生物學(xué)機制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠48只，6周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010，使用許可證號SYXK（川）2020-124。動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，環(huán)境溫度（25±3）℃，相對濕度（50±5）%，12 h/12 h光暗周期。所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，并可自由獲得足夠的標(biāo)準(zhǔn)飲食。動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2020-0312）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷（批號CHB-S-016，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；α-萘異硫氰酸酯（α-naphthylisothiocyanate，ANIT，批號STBH7289）購自美國Sigma公司；UDCA（批號L21056A）購自德國Losan Pharma GmbH；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、ALP和γ-GT試劑盒（批號分別為C009-2-1、E003-2-1、C010-2-1、C019-1-1、C019-2-1、A059-2-2、C017-2-1）購自南京建成生物工程研究所；蘇木素染液（批號517-28-2）、伊紅染液（批號17372-87-1）購自北京中科萬邦生物科技有限公司；胰蛋白酶購自美國Promega公司；串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）同量異序質(zhì)量標(biāo)簽試劑盒（批號WF322713）、三色預(yù)染蛋白Marker（批號26619）、增強型化學(xué)發(fā)光底物（批號34579）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號G3337）、核酸擴增試劑盒（批號G3326）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0012）購自碧云天生物技術(shù)；兔源β-actin抗體（批號AC026）、兔源二抗（批號AS014）購自武漢愛博泰克生物技術(shù)有限公司；兔源連接黏附分子-A（junctional adhesion molecule-A，JAM-A）抗體（批號DF6373）、兔源閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）抗體（批號AF5145）、兔源密封蛋白3（Claudin 3）抗體（批號AF0129）購自美國Affinity公司；兔源閉合蛋白（Occludin）抗體（批號27260-1-AP）購自美國Proteintech公司；引物序列由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計合成。

1.3 儀器

THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；DG5032型酶標(biāo)儀（南京華東電子集團有限公司）；JB-P7型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2235型病理切片機（德國Leica公司）；CI-S型倒置顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；nanoUPLC EASYnLC1200型高效液相色譜儀、Q Exactive HFX質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XBridge BEH C18XP色譜柱（美國Waters公司）；ReprosilPur 120 C18-AQ色譜柱（德國Dr. Maisch）；JY96 IIN型細(xì)胞超聲破碎儀（上海凈信科技有限公司）；1600R型低溫離心機（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；KZ-Ⅱ高速組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；CFX96型實時熒光定量PCR系統(tǒng)、ChemiDoc型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；VE-180B型垂直電泳槽、VE-586型轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

48只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組、UDCA（60 mg/kg）組和芍藥苷高、中、低劑量（200、100、50 mg/kg）組，每組8只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。于第4天給藥2 h后造模，造模前禁食不禁水12 h，模型組和各給藥組ig ANIT（60 mg/kg），對照組ig等體積橄欖油。末次給藥后，采用20%烏來糖麻醉大鼠，收集大鼠血液及肝臟樣本。血液樣本3000 r/min離心10 min，分離血清，于?80 ℃保存。肝臟樣本一部分固定于4%多聚甲醛溶液中，用于進(jìn)行后續(xù)組織病理學(xué)觀察，另一部分分裝于無酶凍存管，?80 ℃保存，用于蛋白組學(xué)檢測。

2.2 肝功能指標(biāo)檢測

按照試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT活性和TBA、TBIL、DBIL水平。

2.3 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理變化

各組大鼠肝組織用4%多聚甲醛固定后，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切成4 μm切片。隨后，脫蠟切片水洗后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察各組肝臟組織病理變化。

2.4 蛋白質(zhì)提取與TMT標(biāo)記

分別取對照組、模型組和芍藥苷高劑量組5份肝組織樣本，每份樣本稱取40 mg肝組織，加入適量RIPA裂解液充分混勻，經(jīng)低溫研磨、冰浴超聲后充分裂解樣本。樣本于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，使用BCA法測定蛋白含量。每個樣品中收集100 μg總蛋白，丙酮沉淀。將蛋白沉淀溶解，加入5 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），在55 ℃下振蕩孵育20 min，還原二硫鍵。隨后將樣品冷卻至室溫，加入碘乙酰胺至15 mmol/L，避光反應(yīng)30 min，將已還原的二硫鍵烷基化。用重懸緩沖液將胰蛋白溶解至0.5 g/L，室溫孵育5 min，然后將胰蛋白酶與蛋白按1∶50的比例充分混勻。樣品于37 ℃振蕩孵育過夜。最后，按照TMT標(biāo)記試劑盒說明書對樣品進(jìn)行標(biāo)記。

2.5 Nano-UP LC-MS/MS檢測

利用Nano-UPLC液相系統(tǒng)分離樣本中多肽，再聯(lián)用質(zhì)譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。采用Reprosil-Pur 120 C18-AQ色譜柱（150 mm×100 μm，1.9 μm）進(jìn)行色譜分離。質(zhì)譜分析采用數(shù)據(jù)依賴采集模式和正離子檢測模式，一級掃描范圍/350～1600，分辨率120 000@/200；AGC為3E6，最大離子注入時間為30 ms。二級掃描固定最小/為110，分辨率為45 000。根據(jù)色譜峰峰寬，將動態(tài)排除時間設(shè)定為45 s。

2.6 搜庫鑒定和蛋白定量

原始數(shù)據(jù)文件利用Proteome Discoverer軟件及內(nèi)置的Sequest HT搜索引擎進(jìn)行搜庫分析。數(shù)據(jù)庫匹配參數(shù)設(shè)置見表1。

表1 蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫匹配參數(shù)

2.7 差異表達(dá)蛋白的篩選與分析

2組間顯著性差異表達(dá)蛋白的篩選條件為＜0.05、FC≥1.2或FC≤0.83。火山圖分析與聚類分析分別由ggplot2（R package，version 3.3.6）與pheatmap（R package，version 1.0.12）軟件完成。利用String（https://cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作關(guān)系。利用基因本體（gene ontology，GO，http://www.geneontology.org/）功能富集分析對組間差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能注釋。利用基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG，（https://www.kegg.jp/kegg/）通路富集分析篩選組間差異表達(dá)蛋白顯著富集的通路，當(dāng)＜0.05時認(rèn)為差異表達(dá)蛋白在該GO條目或KEGG通路中顯著富集。

2.8 分子對接驗證芍藥苷與相關(guān)靶點的親和力

對于蛋白組學(xué)篩選出的關(guān)鍵通路，利用分子對接技術(shù)進(jìn)一步預(yù)測芍藥苷與關(guān)鍵靶點的結(jié)合能力。從PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）下載芍藥苷的3D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件將結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)化成PDB文件格式，從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載相關(guān)靶點的3D結(jié)構(gòu)PDB文件，并去除靶點蛋白中的小配體、水分子和氫鍵。運用AutoDuckTools 4.2軟件進(jìn)行對接后將結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2.9 qRT-PCR檢測肝組織相關(guān)靶點mRNA表達(dá)

利用TRIzol試劑提取肝組織總RNA，微量分光光度計檢測總RNA的濃度、純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR的擴增。擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參基因，利用2?ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表2。

2.10 Western blotting檢測肝組織相關(guān)蛋白表達(dá)

稱取大鼠肝組織約50 mg，加入500 μL含PMSF和蛋白酶抑制劑的裂解液，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液后，沸水浴加熱使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉、洗膜后，分別加入β-actin（1∶100 000）、Occludin（1∶1000）、ZO-1（1∶1000）、Claudin 3（1∶1000）、JAM-A（1∶1000）一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶6000），室溫孵育90 min，ECL法顯色。利用Image J軟件分析條帶灰度值。

表2 引物序列

2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 藥效學(xué)考察

3.1.1 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝功能的影響 如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT活性和TBA、TBIL、DBIL水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血清中ALT、AST、ALP、γ-GT活性和TBA、TBIL、DBIL水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.1.2 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝組織病理變化的影響 如圖2所示，對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索狀排列整齊，肝細(xì)胞間肝竇明顯，無明顯組織病理學(xué)損傷。模型組大鼠肝組織匯管區(qū)及肝竇可見大量炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)伴隨大面積肝細(xì)胞腫脹、壞死，部分肝細(xì)胞質(zhì)中可見大小不等的空泡樣脂滴，提示肝細(xì)胞變性。各給藥組大鼠肝組織中匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤及小葉間膽管破壞明顯減弱。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

3.2.1 火山圖分析與聚類分析 火山圖分析以灰色代表非顯著性差異蛋白，紅色和藍(lán)色代表顯著性差異蛋白，其中紅色表示上調(diào)蛋白，藍(lán)色表示下調(diào)蛋白。聚類分析選取值最小的Top50差異蛋白，顏色由藍(lán)色→白色→紅色表示表達(dá)量從低到高，紅色表示高表達(dá)蛋白，藍(lán)色表示低表達(dá)蛋白。分析結(jié)果表明，與對照組比較，模型組有96個蛋白上調(diào)，111個蛋白下調(diào)（圖3-A）。與模型組比較，芍藥苷高劑量組有224個蛋白上調(diào)，704個蛋白下調(diào)（圖3-B）。對照組與模型組2組內(nèi)聚類關(guān)系相近，組間基因的差異表達(dá)明顯；芍藥苷高劑量組與模型組聚類分析中存在個別離群值，整體上2組間的蛋白表達(dá)模式仍有顯著差異（圖3-C、D）。

3.2.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 利用String數(shù)據(jù)庫對芍藥苷高劑量組與模型組的差異表達(dá)蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定最小互作分為0.400。結(jié)果顯示與凋亡途徑相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，Casp3）蛋白度值最高。此外，度值較高的節(jié)點還涉及免疫炎癥途徑的整合素β2（integrinβ2，Itgb2）、整合素αM（integrin subunit alpha M，Itgam），膽汁酸分泌過程的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白C3（ATP-binding cassette sub-family C member 3，Abcc3）、細(xì)胞色素P450家族成員7A1（cholesterol 7α-hydroxylase，Cyp7a1），緊密連接途徑的連接黏附分子-A（Junctional adhesion molecule A，F(xiàn)11r）、密封蛋白3（Claudin-3，Cldn3），見圖4-B。

A-模型組與對照組比較的差異表達(dá)蛋白火山圖 B-芍藥苷高劑量組與模型組比較的差異表達(dá)蛋白火山圖 C-模型組與對照組比較的差異表達(dá)蛋白熱圖 D-芍藥苷高劑量組與模型組比較的差異表達(dá)蛋白熱圖

3.2.3 GO富集分析 進(jìn)一步對芍藥苷高劑量組與模型組的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，GO分析包括細(xì)胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）3個部分，共富集得到2613個條目。取BP中值最小的前15的條目，展開相關(guān)信息。如圖4-A所示，與模型組比較，芍藥苷高劑量組差異蛋白主要富集于小分子代謝、羧酸代謝、有機酸代謝等多種生物代謝過程，富集程度最高的為肌動蛋白細(xì)胞骨架組織，與緊密連接途徑相關(guān)。

3.2.4 KEGG富集分析 對芍藥苷高劑量組與模型組的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到71個條目。取值最小的Top10的通路，以氣泡圖的形式進(jìn)行展示。如圖4-C所示，與模型組比較，芍藥苷高劑量組在代謝通路富集蛋白數(shù)目最多，且富集程度最高，代謝通路涉及范圍極為寬泛，涵蓋了初級膽汁酸生物合成、次級膽汁酸生物合成、淀粉和蔗糖新陳代謝等多種生物過程。在代謝通路以外，2組間差異蛋白顯著富集的通路還包括緊密連接通路、細(xì)胞周期通路、膽汁酸分泌通路等。

3.3 芍藥苷與相關(guān)緊密連接蛋白的分子對接

基于蛋白組學(xué)結(jié)果的綜合分析，結(jié)合現(xiàn)有的研究現(xiàn)狀，選擇對藥物作用貢獻(xiàn)較大，并且在膽汁淤積上游病理發(fā)生途徑中發(fā)揮重要功能的緊密連接通路進(jìn)行驗證。將芍藥苷與緊密連接通路重要靶點進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測，結(jié)果顯示芍藥苷與ZO-1、Occludin、Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3及JAM-A的結(jié)合能為?10～?40 kJ/mol，均＜0，表明芍藥苷與上述靶點具有相對良好的結(jié)合能力（表3）。利用PyMOL軟件對芍藥苷與各個靶點的對接結(jié)果進(jìn)行可視化（圖5）。

表3 芍藥苷與相關(guān)緊密連接蛋白的對接結(jié)合能

圖5 芍藥苷與相關(guān)緊密連接蛋白的分子對接可視化

3.4 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝組織ZO-1、Occludin、Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3和JAM-A mRNA表達(dá)的影響

如圖6所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中、、、、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，芍藥苷各劑量組、和mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01），芍藥苷高劑量組、和mRNA表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖6 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝組織ZO-1、Occludin、Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3和JAM-A mRNA表達(dá)的影響(, n = 4)

3.5 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝組織ZO-1、Occludin、Claudin 3和JAM-A蛋白表達(dá)的影響

根據(jù)上述結(jié)果，芍藥苷高劑量組在藥效與qRT-PCR考察中均表現(xiàn)出顯著的影響，因此，選擇高劑量組進(jìn)一步考察芍藥苷對肝組織關(guān)鍵緊密連接蛋白表達(dá)的影響。如圖7所示，與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Claudin 3、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），JAM-A蛋白表達(dá)呈降低趨勢；與模型組比較，芍藥苷高劑量組大鼠肝組織中Claudin 3、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.05），JAM-A蛋白表達(dá)呈升高趨勢。

圖7 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝組織ZO-1、Occludin、Claudin 3和JAM-A蛋白表達(dá)的影響(, n = 4)

4 討論

基于中醫(yī)理論，膽汁淤積歸屬中醫(yī)“黃疸”“淤黃”范疇。膽汁淤積發(fā)病機制復(fù)雜，《傷寒雜病論》指出膽汁淤積的病因包括寒濕、濕熱、火邪與淤血，濕邪被認(rèn)為是膽汁淤積的主要誘因?，F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，寒濕內(nèi)停，日久而生痰，陰盛陽偏虛，致郁阻中焦，肝失疏泄，膽內(nèi)瘀阻，繼而引發(fā)黃疸[10]?；凇皾瘛薄盁帷薄梆觥钡牟∫虿C或可有效干預(yù)膽汁淤積的發(fā)展。中藥赤芍酸苦性寒，有清熱涼血、散瘀止痛之功。在近代臨床實踐中，重用赤芍已經(jīng)被大量研究證實可有效治療重癥膽汁淤積性肝炎[11-13]。芍藥苷是赤芍的主要活性成分，是赤芍防治肝病的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)[14-15]。課題組前期已經(jīng)充分探討了赤芍及赤芍有效成分芍藥苷對于膽汁淤積的療效[16]，然而，芍藥苷對膽汁淤積的作用機制尚不完全清楚。本研究在確證芍藥苷治療膽汁淤積的藥效學(xué)基礎(chǔ)上，首次利用蛋白組學(xué)技術(shù)，預(yù)測芍藥苷在ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積模型中的關(guān)鍵作用機制。

目前臨床對于膽汁淤積的診斷標(biāo)準(zhǔn)及療效標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，膽汁淤積最具特征性的早期表現(xiàn)是血清ALP及γ-GT活性的升高，這2項指標(biāo)對于膽汁淤積診斷的靈敏性和特異性較高，在表現(xiàn)為同時升高的時候可以判斷存在肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞的損傷[17]。黃疸是膽汁淤積的臨床表現(xiàn)之一，對于血清TBIL與DBIL的檢測便于對肝細(xì)胞性、溶血性及阻塞性黃疸進(jìn)行判斷[18]。另外，膽汁淤積發(fā)生時，膽汁的分泌會下降，膽汁酸貯存量的分布迅速發(fā)生改變，造成血清、尿液中膽汁酸濃度顯著升高，所以血清TBA水平的測定是對于膽汁淤積的一種靈敏、特異的檢測方法[17]。此外，血清ALT、AST是藥物性肝損傷以及肝衰竭前期的重要檢測指標(biāo)，對于肝損傷的診斷極為關(guān)鍵[18-20]。故本研究對各組大鼠血清ALT、AST、ALP、γ-GT活性及TBA、TBIL、DBIL水平進(jìn)行檢測，并結(jié)合肝臟病理組織的觀察，以形成完整的藥效學(xué)考察體系。藥效學(xué)結(jié)果表明，芍藥苷可顯著改善大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT活性和TBA、TBIL、DBIL水平的異常升高，減輕大鼠匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死情況，提示芍藥苷的干預(yù)可有效緩解大鼠膽汁淤積中的肝功能障礙，改善膽汁淤積大鼠肝臟病理損傷。蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示，芍藥苷對于膽汁淤積的調(diào)控主要涉及凋亡途徑、免疫炎癥過程、代謝通路、緊密連接通路、膽汁酸分泌通路與細(xì)胞周期通路。

在膽汁淤積中，膽汁流動受損導(dǎo)致膽汁酸在肝臟中積聚，引起肝細(xì)胞、膽道損傷和炎癥反應(yīng)。膽汁酸穩(wěn)態(tài)失衡是導(dǎo)致膽汁淤積的核心因素[21-[22]。緊密連接被認(rèn)為在多種疾病中都起著關(guān)鍵作用。在肝臟中，緊密連接蛋白在肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞及包括內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的非實質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，具有多種功能[23-24]。一方面，它們作為黏附肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞之間的細(xì)胞旁擴散的“守門員”，形成血-膽屏障并維持組織穩(wěn)態(tài)，防止膽道膽汁反流；另一方面，在非連接定位中，它們通過招募信號蛋白來響應(yīng)細(xì)胞外刺激，參與細(xì)胞分化、增殖和遷移等關(guān)鍵的細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[25]。肝膽緊密連接在膽道穩(wěn)態(tài)和肝臟疾病領(lǐng)域的研究還比較少，但已有研究證明在膽汁淤積等慢性肝臟和膽道疾病中伴有緊密連接結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)和定位紊亂[26-27]。此外，近期一項研究表明膽汁酸受體Takeda G蛋白偶聯(lián)受體5（Takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）可以通過影響緊密連接蛋白JAM-A的表達(dá)和磷酸化，調(diào)節(jié)膽汁淤積小鼠膽道上皮屏障功能，保護(hù)小鼠免受膽汁淤積引起的肝損傷[28]，揭示了緊密連接在膽汁淤積中的重要功能。在膽汁淤積過程中，肝膽細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞，血-膽屏障受損，毒性膽汁酸可進(jìn)入導(dǎo)管周區(qū)域，破壞膽汁酸穩(wěn)態(tài)，同時促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致炎癥驅(qū)動肝損傷進(jìn)展。因此，緊密連接通路在膽汁酸穩(wěn)態(tài)的上游靶點調(diào)控中至關(guān)重要。介于此，本研究選擇了蛋白組學(xué)篩選結(jié)果中的緊密連接通路進(jìn)行了后續(xù)驗證。

首先利用分子對接技術(shù)確定芍藥苷與幾種關(guān)鍵緊密連接蛋白的結(jié)合能力，在確定芍藥苷與ZO-1、JAM-A、Occludin、Claudin 1、Claudin 2、Claudin 3緊密連接靶點具有良好的親和力后，進(jìn)一步利用qRT-PCR、Western blotting技術(shù)驗證在藥物作用下，這些靶點在ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積模型中的變化。結(jié)果顯示，芍藥苷可以顯著升高ANIT誘導(dǎo)的、、、、和mRNA的低表達(dá)。介于芍藥苷高劑量組在前期實驗測定中都呈現(xiàn)出比芍藥苷中、低劑量組更顯著的效果，所以在藥物治療組中，僅選擇芍藥苷高劑量組進(jìn)行蛋白表達(dá)量的測定，結(jié)果顯示，模型組ZO-1、Occludin、Claudin 3蛋白表達(dá)較對照組均明顯降低，而芍藥苷高劑量組ZO-1、Occludin、Claudin 3蛋白表達(dá)較模型組明顯升高。這些結(jié)果表明，在ANIT作用下，大鼠肝臟內(nèi)細(xì)胞旁屏障功能被損害，芍藥苷可有效調(diào)控緊密連接的表達(dá)，維持細(xì)胞旁屏障功能的完整性以維持組織穩(wěn)態(tài)。

綜上，芍藥苷可以顯著改善膽汁淤積大鼠血清中肝功能指標(biāo)異常，緩解肝臟病理損傷，可能是有效治療膽汁淤積的潛在藥物。芍藥苷可以通過調(diào)節(jié)緊密連接通路以增強膽汁淤積中細(xì)胞旁屏障功能，維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而緩解肝內(nèi)膽汁淤積大鼠的肝損傷。緊密連接通路可能是芍藥苷治療膽汁淤積的關(guān)鍵上游通路。然而，膽汁淤積是一個動態(tài)過程，本研究目前沒有對膽汁酸穩(wěn)態(tài)進(jìn)行監(jiān)控，后續(xù)研究可以結(jié)合藥動學(xué)，進(jìn)一步觀察在芍藥苷作用下，藥物與膽汁酸池之間所反映的量-時-效的動態(tài)變化。此外，本研究所取樣本為肝組織樣本，肝臟中有豐富的毛細(xì)膽管，因此本研究關(guān)注的緊密連接為肝膽混合表達(dá)的緊密連接，初步對肝膽屏障功能進(jìn)行了考察。然而，肝、膽不同部位的緊密連接，尤其是膽管緊密連接在芍藥苷作用下的具體變化還有待進(jìn)一步研究。后續(xù)研究有必要在細(xì)胞層面，聚焦芍藥苷對于膽管上皮屏障功能的影響，以深入探討芍藥苷調(diào)控膽汁酸穩(wěn)態(tài)的路徑。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of paeoniflorin on alleviating cholestasis based on tight junction pathway

ZHANG Fang-ling1, XIE Jin2, WU He-fei1, LI Yu-bing1, DENG Xin-yu1, CHEN Yuan1, HU Qi-chao1, MA Xiao1

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Department of Pharmacy, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China

To investigate the effect of paeoniflorin on cholestasis through tight junction pathway based on proteomics and experimental verification.SD rats were randomly divided into control group, model group, ursodesoxycholic acid (60 mg/kg) group and paeoniflorin high-, medium- and low-dose groups (200, 100, 50 mg/kg), with eight rats in each group. The rat model of intrahepatic cholestasis was induced by ig α-isothiocyanate (60 mg/kg) after 7 d of ig corresponding drugs for 2 h on 4th day. After the last administration, the indexes of liver function in serum of rats were determined by kit. HE staining was used to observe the pathological changes of rat liver. Proteomics and bioinformatics techniques were used to screen the key pathways of paeoniflorin on ameliorating the cholestasis. Molecular docking was used to determine the binding energy of paeoniflorin to the relevant targets. qRT-PCR and Western blotting were used to verify the expressions of key targets such as zonula occludin-1 (ZO-1), Occludin, Claudin 1/2/3 and junction adhesion molecule-A (JAM-A) in liver tissue.The pharmacodynamic results showed that compared with control group, activities of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT) and levels of total bile acid (TBA), total bilirubin (TBIL), direct bilirubin (DBIL) in serum of rats in model group were significantly increased (< 0.01). A large number of inflammatory cells infiltrated in liver tissue, accompanied by degeneration and necrosis of hepatocytes, and the above indexes were significantly improved after paeoniflorin treatment (< 0.05, 0.01). Proteomics results indicated that paeoniflorin mainly exerted its effects in improving cholestasis through apoptosis pathway, immune-inflammatory processes, metabolic pathways, cell cycle pathway, bile acid secretion pathway, and tight junction pathway. The tight junction pathway was selected for validation, and the results showed that compared with control group,,,,,andmRNA expressions in liver tissue of rats in model group were significantly decreased (< 0.01), ZO-1, Occludin and Claudin 3 protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01), after the intervention of paeoniflorin, the expressions of proteins and genes related to the tight junction pathway were significantly increased (< 0.05, 0.01).Paeoniflorin can relieve cholestasis in rats in multiple ways and multiple targets, and it is a potential drug for treating cholestasis. Tight junction pathway may be the key pathway for paeoniflorin to improve cholestasis.

paeoniflorin; cholestasis; liver injury; proteomics; tight junction

R285.5

A

0253 - 2670(2023)21 - 7055 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.21.014

2023-08-15

國家自然科學(xué)基金資助項目（82274187）；四川省自然科學(xué)基金項目（2023NSFSC0687）

章方玲，碩士研究生，研究方向為中藥理論與應(yīng)用。E-mail: fangzhang1112@163.com

通信作者：馬 驍，碩士生導(dǎo)師，副教授，研究方向為中藥理論與應(yīng)用。E-mail: tobymaxiao@cdutcm.edu.cn

謝 進(jìn)，副主任藥師，研究方向為臨床中藥學(xué)。E-mail: xiejin613@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]