飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)來(lái)源的角膜基質(zhì)透鏡保存方法的研究進(jìn)展

熊素雅, 王 寧, 白夢(mèng)天, 康海軍, 林 莉,

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)眼科學(xué)院, 四川 成都, 610075; 2. 四川省遂寧市中心醫(yī)院 眼科中心, 四川 遂寧, 629000)

角膜盲發(fā)病率高居中國(guó)致盲性眼病第2位,角膜移植手術(shù)是治療角膜盲的有效方法,但因角膜供體嚴(yán)重匱乏,許多角膜盲患者缺少重獲光明的機(jī)會(huì),因此尋找新的角膜供體材料成為眼科界的關(guān)注熱點(diǎn)[1]。角膜基質(zhì)透鏡是角膜組織的一部分,由有序排列的膠原纖維和角膜基質(zhì)細(xì)胞組成,沒(méi)有血管和淋巴組織,可作為一種免疫排斥反應(yīng)較小的角膜移植材料應(yīng)用。研究[2-3]發(fā)現(xiàn),飛秒激光小切口角膜基質(zhì)透鏡取出術(shù)(SMILE)來(lái)源的角膜基質(zhì)透鏡最大程度地保留了角膜組織的理化特性,學(xué)者們將其用來(lái)治療角膜潰瘍、圓錐角膜、角膜營(yíng)養(yǎng)不良等眼科疾病,并證實(shí)其安全有效。因角膜移植術(shù)前需進(jìn)行傳染病篩查、供體和受體需在同一天完成手術(shù)等因素限制,致使大多新鮮透鏡不能及時(shí)應(yīng)用于臨床而被丟棄。故如何保存角膜基質(zhì)透鏡,維持其膠原纖維結(jié)構(gòu)完整性、透明度和降低免疫原性并延長(zhǎng)其保存時(shí)間等,成為了研究熱點(diǎn)。本文就SMILE來(lái)源的角膜基質(zhì)透鏡的保存方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 超低溫冷凍保存

超低溫冷凍保存技術(shù)是指在活細(xì)胞、角膜組織或其他生物樣本中添加冷凍保護(hù)劑(如二甲亞砜、丙二醇和聚乙二醇等),使其在冷凍過(guò)程中免受或減少一系列低溫?fù)p傷(冰晶損傷、滲透損傷和溶質(zhì)損傷等)的影響,并通過(guò)緩慢冷凍、快速冷凍或玻璃化方法將樣本降至超低溫(-80 ℃或-196 ℃)進(jìn)行保存,在需要的時(shí)候,以適當(dāng)?shù)姆椒◤?fù)溫、解凍,并去除冷凍保護(hù)劑進(jìn)行使用[4-5]。在超低溫環(huán)境中,細(xì)胞生長(zhǎng)活動(dòng)及物質(zhì)代謝幾乎停止,可避免代謝產(chǎn)物積聚所帶來(lái)的毒性作用,也可抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖,故超低溫冷凍保存法在醫(yī)學(xué)上運(yùn)用廣泛[4]。有研究證實(shí),超低溫冷凍保存角膜基質(zhì)透鏡有效可行, MOHAMED-NORIEGA K等[6]將-80 ℃下保存1個(gè)月的透鏡和新鮮透鏡進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)2組的膠原纖維都保存完好,且存在有活性的角質(zhì)細(xì)胞,2組中分離出的角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)和增殖率沒(méi)有顯著差異,證實(shí)-80 ℃冷凍保存1個(gè)月的透鏡與新鮮角膜組織相似。韋琦等[7]對(duì)比觀察-80 ℃中保存1、24、60及84個(gè)月的透鏡,發(fā)現(xiàn)隨著保存時(shí)間延長(zhǎng),膠原排列逐漸紊亂、細(xì)胞變形皺縮明顯,但各組的透光率及凋亡率無(wú)顯著差異,說(shuō)明-80 ℃可長(zhǎng)期保存透鏡。不過(guò)該研究尚未明確透鏡膠原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的時(shí)間節(jié)點(diǎn),以及缺乏將長(zhǎng)期保存的透鏡用于臨床治療的相關(guān)研究。RIAU A K等[8]發(fā)現(xiàn)在-196 ℃下,短期(3個(gè)月)和長(zhǎng)期保存(12個(gè)月)的透鏡較新鮮透鏡透明度顯著降低,之后將冷凍保存的透鏡植入兔角膜中,隨訪(fǎng)觀察16周發(fā)現(xiàn)2組均未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)及炎癥反應(yīng),且角膜透明度均接近術(shù)前,提示-196 ℃長(zhǎng)期冷凍保存透鏡可行。研究[9-11]表明,植入經(jīng)超低溫冷凍保存的透鏡或新鮮透鏡,在后期的傷口愈合過(guò)程并無(wú)顯著差異,證實(shí)再植入超低溫冷凍保存的透鏡治療部分眼部疾病安全有效。高穎等[12]將-80 ℃下保存30 d以上的透鏡用于治療3例角膜變性和2例角膜潰瘍患者,術(shù)后隨訪(fǎng)6個(gè)月,發(fā)現(xiàn)透鏡植片與植床均貼合良好,且植片保持透明,無(wú)感染及排斥反應(yīng)等并發(fā)癥發(fā)生。上述研究均表明,將超低溫冷凍保存的角膜透鏡組織用于臨床安全可行,且能夠保持角膜組織的透明性。

但也有學(xué)者[13]提出,該技術(shù)本身會(huì)影響組織的微觀結(jié)構(gòu),對(duì)將超低溫冷凍保存的透鏡用于眼科疾病的治療存在疑慮,目前還缺乏關(guān)于移植角膜基質(zhì)透鏡的遠(yuǎn)期并發(fā)癥的相關(guān)研究。RIAU A K等[14]使用與MOHAMED-NORIEGA K等[6]相同的方法保存透鏡,發(fā)現(xiàn)1個(gè)月后透鏡出現(xiàn)組織水腫及清晰度降低,認(rèn)為可能與透鏡內(nèi)的液體平衡改變有關(guān),同時(shí)將其植入靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物眼中,出現(xiàn)短期角膜水腫,推測(cè)人類(lèi)也可能會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似情況,故為避免此現(xiàn)象影響透鏡臨床應(yīng)用,建議超低溫保存的時(shí)間盡量控制在1個(gè)月以?xún)?nèi)。此外,超低溫冷凍保存法所需設(shè)備昂貴、存儲(chǔ)過(guò)程復(fù)雜以及對(duì)技術(shù)人員要求高,導(dǎo)致該方法在基層醫(yī)院開(kāi)展受限,因此需要優(yōu)化透鏡的保存,以便提高透鏡的利用率。

2 介質(zhì)保存

為降低保存透鏡的成本并優(yōu)化存儲(chǔ)過(guò)程,有研究嘗試用角膜活性中期保存液(DX液)、甘油、硅油和變色硅膠等不同介質(zhì)來(lái)保存角膜基質(zhì)透鏡,并取得了良好效果,但不同保存介質(zhì)各有優(yōu)缺點(diǎn),實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)不同需求進(jìn)行選擇。DX液由山東省眼科研究所自主研制,以細(xì)胞培養(yǎng)基為基礎(chǔ)液,添加了皮質(zhì)類(lèi)固醇,與Optisol液相比,配制簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,可以降低角膜組織保存過(guò)程中的代謝,但有效期短(為配制后1周)[15]。甘油具有優(yōu)異的脫水和抗菌特性,聯(lián)合低溫保存時(shí),可維持組織的膠原板層結(jié)構(gòu)并去除生物源性[16], 因此被認(rèn)為是一種理想的透鏡保存介質(zhì),但較適合1個(gè)月內(nèi)的短期保存。硅油具有無(wú)毒、不揮發(fā)、疏水性和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等一系列優(yōu)異的理化性質(zhì),可以與外界環(huán)境達(dá)到很好的隔離效果,因此有研究[17]用硅油作為介質(zhì)來(lái)保存透鏡,但存在從硅油取出透鏡洗滌時(shí)不易洗凈的問(wèn)題。變色硅膠可去除角膜組織中的水分、防止細(xì)胞酶失活和抑制細(xì)胞自溶,從而保持角膜組織的完整性[18]。ROMANO V等[19]將在室溫下用硅膠保存2周的角膜基質(zhì)復(fù)水后,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)透鏡仍保留其分子和生物力學(xué)特性,建議用此方法保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)低的供體或角膜內(nèi)皮移植術(shù)等手術(shù)后剩余的角膜組織,以便后期用于深板層角膜移植術(shù),從而增加角膜供體數(shù)量。

田樂(lè)等[16]對(duì)比觀察4 ℃ DX液與-20 ℃甘油保存透鏡的效果,發(fā)現(xiàn)DX液保存1周的透鏡膠原纖維排列規(guī)則致密、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,而甘油中保存1 d就出現(xiàn)基質(zhì)組織水腫、細(xì)胞核裸露,1周后細(xì)胞分布稀疏、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,說(shuō)明在保存時(shí)間為1周內(nèi)時(shí),DX液在維持透鏡組織結(jié)構(gòu)的完整性方面優(yōu)于甘油。但以上研究?jī)H進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)且保存時(shí)間較短,在眼科疾病治療中的研究仍需進(jìn)一步完善。LIANG G等[18]探索無(wú)水甘油、變色硅膠和Optisol培養(yǎng)基保存透鏡的效果,發(fā)現(xiàn)2周后, Optisol培養(yǎng)基組在保持基質(zhì)細(xì)胞活性、透鏡透明度和結(jié)構(gòu)完整性上優(yōu)于無(wú)水甘油和變色硅膠,但Optisol培養(yǎng)基成本顯著高于無(wú)水甘油、變色硅膠,因而限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。XIA F等[17]比較無(wú)水甘油、硅油和變色硅膠對(duì)透鏡透光率和超微結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)3種保存介質(zhì)均可用于透鏡保存,4周后硅膠在維持透鏡透光率方面效果更好,這與李文娟等[20]研究結(jié)果一致。然而該研究?jī)H探索了透光率和超微結(jié)構(gòu)變化,缺乏免疫原性和生物力學(xué)特性的相關(guān)研究。LIU Y C等[21]將透鏡分別在磷酸鹽緩沖液、DMEM、Optisol GS和無(wú)水甘油共4種介質(zhì)中保存48 h,結(jié)果顯示,各組透鏡均保持較高的透明度、結(jié)構(gòu)完整性和低免疫原性,說(shuō)明在無(wú)法立即將透鏡進(jìn)行長(zhǎng)期儲(chǔ)存于大型實(shí)驗(yàn)設(shè)備前,或轉(zhuǎn)運(yùn)至基層醫(yī)院應(yīng)用時(shí),可用此法進(jìn)行臨時(shí)保存48 h。研究[17-18]發(fā)現(xiàn),甘油保存的透鏡表現(xiàn)出更嚴(yán)重的水腫和更稀疏的膠原排列,但LIU Y C等[21]將透鏡在甘油中保存時(shí),發(fā)現(xiàn)透鏡仍保持良好膠原纖維排列,XIA F等[17]認(rèn)為這可能與其研究中相對(duì)較短的保存時(shí)間有關(guān)。

Optisol液因成本、來(lái)源和保存期等因素限制,目前在中國(guó)難以廣泛應(yīng)用,而甘油成本低且室溫保存時(shí)能保持透鏡透明度和超微結(jié)構(gòu)特征,在低溫下比Optisol液更具優(yōu)勢(shì)[22]。

3 超低溫冷凍聯(lián)合介質(zhì)保存

盡管角膜被認(rèn)為是相對(duì)免疫赦免的器官,但角膜基質(zhì)透鏡移植仍存在排斥風(fēng)險(xiǎn),為探索降低抗原性的有效保存方法,許多學(xué)者借助角膜保存液、硅油、甘油等不同介質(zhì)聯(lián)合超低溫冷凍技術(shù)來(lái)保存透鏡[23]。SHANG Y F等[24]將透鏡分為新鮮組、-78 ℃無(wú)水甘油保存組和0.1%十二烷基硫酸鈉脫細(xì)胞組進(jìn)行免疫組化、透光率檢測(cè)及透射電鏡觀察,結(jié)果表明,-78℃無(wú)水甘油保存是減少抗原性而不破壞透鏡結(jié)構(gòu)和光學(xué)性能的理想方法。相關(guān)研究[25]將透鏡置于室溫和4、-20、-80 ℃的無(wú)水甘油中保存3個(gè)月,發(fā)現(xiàn)-80 ℃組的透光率接近于新鮮透鏡且抗原性減少,而其他組的透光率均顯著降低,提示-80 ℃無(wú)水甘油中保存為最佳方法。薛春燕等[26]用-80 ℃無(wú)水甘油中保存的透鏡治療5例角膜潰瘍穿孔患者,發(fā)現(xiàn)僅1例真菌性角膜潰瘍患者在術(shù)后1個(gè)月因植片融解壞死,而更換了新的植片,其余患者創(chuàng)面均愈合良好; 此外,劉嫻[27]用-80 ℃無(wú)水甘油中保存的透鏡聯(lián)合羊膜移植治療14例真菌性角膜潰瘍患者,其術(shù)后潰瘍炎癥消退、前房形成良好,雖然隨訪(fǎng)時(shí),此研究中多數(shù)植片處于半透明狀,但其可有效控制炎癥進(jìn)展,并為后期光學(xué)性角膜移植創(chuàng)造條件。上述研究表明, -80 ℃下無(wú)水甘油保存的透鏡單獨(dú)或聯(lián)合羊膜應(yīng)用治療角膜潰瘍的短期療效是安全可靠的。雖然許多研究證實(shí),超低溫冷凍聯(lián)合介質(zhì)保存法較單純超低溫冷凍保存及介質(zhì)保存法能有效降低透鏡的免疫原性,并在維持透鏡透光率和膠原纖維結(jié)構(gòu)完整性方面具有優(yōu)勢(shì),但這些研究存在樣本量較小且隨訪(fǎng)時(shí)間較短等局限,還需擴(kuò)大樣本量及延長(zhǎng)隨訪(fǎng)時(shí)間觀察遠(yuǎn)期療效,以為臨床應(yīng)用提供參考。

4 去細(xì)胞化保存

有研究利用物理、化學(xué)和輻射等方法去除透鏡的細(xì)胞成分,消除其免疫原性的同時(shí)保留細(xì)胞外基質(zhì),然后在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存于角膜基質(zhì)透鏡庫(kù)特定介質(zhì)中,在需要時(shí)運(yùn)送至醫(yī)院使用,另有研究表明在透鏡移植后受體自身的細(xì)胞會(huì)逐漸遷移植入透鏡中,進(jìn)一步揭示了去細(xì)胞化法在臨床應(yīng)用中的可行性[28-29]。去細(xì)胞化法因可降低透鏡免疫原性和便于長(zhǎng)期保存等優(yōu)勢(shì)極大提高了透鏡的臨床應(yīng)用潛力,可能是透鏡保存的研究熱點(diǎn)。但該方法過(guò)程復(fù)雜,設(shè)備要求高,暫未廣泛使用而且在中國(guó)一些患者無(wú)法負(fù)擔(dān)其費(fèi)用。盡管如此,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的更迭,未來(lái)去細(xì)胞化法保存透鏡仍將有廣闊的發(fā)展前景。

5 營(yíng)養(yǎng)膠囊保存

近期, ZHAO J等[30]受天然人類(lèi)淚膜成分的啟發(fā),構(gòu)建了1種能夠維持淚膜穩(wěn)態(tài)的營(yíng)養(yǎng)水凝膠膠囊,用于中期保存角膜基質(zhì)透鏡,最長(zhǎng)保存長(zhǎng)28 d后,營(yíng)養(yǎng)膠囊組活細(xì)胞比例、透光率及膠原纖維數(shù)量均高于傳統(tǒng)甘油組,且膠原纖維排列更為整齊規(guī)律,目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于臨床。在人類(lèi)同種異體移植研究中,植入的透鏡無(wú)排斥反應(yīng)且保持透明,術(shù)后70%的患者矯正遠(yuǎn)視力有所提高,營(yíng)養(yǎng)膠囊保存為透鏡及其他活體組織的保存與臨床再利用帶來(lái)了新的可能。

6 總結(jié)與展望

人角膜基質(zhì)透鏡的再利用為角膜疾病的治療提供了新思路。研究表明,當(dāng)條件允許時(shí),可選擇超低溫冷凍聯(lián)合介質(zhì)保存法,其可降低透鏡免疫原性并可長(zhǎng)期保存。在設(shè)施不完善的情況下,介質(zhì)保存(如DX液、甘油、硅膠等)仍是首選方法,去細(xì)胞化法及營(yíng)養(yǎng)膠囊保存法目前未能廣泛使用,但隨著制備工藝的精進(jìn)與簡(jiǎn)化,去細(xì)胞化法及營(yíng)養(yǎng)膠囊保存法有望成為透鏡保存的理想方法。目前,尚無(wú)可以完全滿(mǎn)足臨床需求的保存方法,因此需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)研究,探討可長(zhǎng)期保存且能維持角膜透鏡特性及運(yùn)輸方便、技術(shù)簡(jiǎn)單且費(fèi)用低廉,并適合中國(guó)現(xiàn)階段角膜基質(zhì)透鏡庫(kù)和醫(yī)療情況的保存方法。相信隨著更全面、深入的研究和更多規(guī)范化角膜基質(zhì)透鏡庫(kù)的運(yùn)行, SMILE來(lái)源的角膜基質(zhì)透鏡將會(huì)得到更好的再利用,從而為角膜病患者帶來(lái)光明與希望。