基于UPLC-Q-Exactive/MS技術整合網絡藥理學探討柴胡桂枝湯治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的作用機制*

韓雨秀，張靜，羅竣瑜，賈艷鋌，許金珂，孫啟慧，王旭，楊勇，容蓉**

（1.山東中醫(yī)藥大學藥學院 濟南 250355；2.山東省疾病預防控制中心 濟南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學實驗中心 濟南 250355；4.中醫(yī)藥經典理論教育部重點實驗室 濟南 250355；5.中醫(yī)藥基礎研究山東省重點實驗室濟南 250355；6.山東省中醫(yī)藥抗病毒工程研究中心 濟南 250355）

流感是一種因流感病毒感染引起的呼吸道傳染性疾病，會在全球流行，極易出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率[1]，流感病毒感染導致的高死亡率往往與其流行期間的繼發(fā)細菌感染密切相關[2]。1918年的“西班牙流感”是歷史上最嚴重的流感大流行，近5000萬患者死亡，其中90%以上存在由肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等引起的繼發(fā)細菌感染[3]。流感繼發(fā)細菌性肺炎臨床表現(xiàn)為反復感冒、咳嗽、痰喘、哮鳴[3]，病情時緩時著，中醫(yī)認為該病為表未盡而正已虛，樞機失利，病在少陽兼及太陽，可采用柴胡桂枝湯（CGD）和解表里，調和營衛(wèi)，疏利樞機法論治[4]。CGD由小柴胡湯和桂枝湯加減而來，由柴胡、桂枝、芍藥、黃芩、半夏、甘草、大棗、黨參、生姜等9種藥材組成[5]，臨床常用于治療太少同感[6-7]、發(fā)熱[8]、咳嗽[9]等?，F(xiàn)代藥理學研究表明CGD具有抗呼吸道病毒[10]、抗炎退熱[11]、免疫調節(jié)[12]等作用，現(xiàn)代臨床研究也證實CGD對治療呼吸道感染引起的肺炎有效，用于治療反復呼吸道感染的患者，可使其臨床癥狀減輕[13]。戴思思等[14]采用CGD治療呼吸道病毒感染患者，結果治療組的總有效率為98.20%，優(yōu)于對照組的88.00%。于小紅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CGD聯(lián)合替加環(huán)素對鮑曼不動桿菌肺炎有一定的干預效果，可以減少大鼠肺組織炎性損傷程度及細菌數(shù)量。然而CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的作用機制和物質基礎尚不清楚。網絡藥理學從系統(tǒng)生物學和多向藥理學演變而來，將“一個藥物、一個靶標、一種疾病”的模式轉變?yōu)椤熬W絡靶標-多組分治療”的模式，從而使揭秘活性成分與靶點之間的復雜關系成為可能[16-17]，但未見中醫(yī)藥治療流感繼發(fā)細菌性肺炎相關研究報道。

本研究通過UPLC-Q-Exactive/MS分析鑒定CGD中的主要化學成分，結合網絡藥理學探究其干預流感繼發(fā)細菌性肺炎的可能機制，并采用分子對接及動物實驗進行驗證。

1 實驗材料

1.1 藥材

柴胡（批號：17090609）；桂枝（批號：17092603）；黃芩（批號：17041516）；黨參（批號：17071565），均產自山西；白芍（批號：17072801產地安徽）；姜半夏（批號：17071501產地貴州）；炙甘草（批號：17082005產地內蒙）；大棗（批號：17081603產地新疆維吾爾自治區(qū)）；生姜（批號：17030803產地云南）。

1.2 試劑

肉桂酸（≥98%，批號AA0807DA14）；芍藥苷（≥98%，批號27F8C0162）；黃芩苷（≥98%，批號D23S7F21640）；甘草苷（≥98%，批號D25J7F18328）；沒食子酸（≥98%，批號Y19M8C36143）；芍藥內酯苷（≥98%，批號Y25F8H30152）；苯甲酸（≥98%，批號Z18S7H21155）；香豆素（≥98%，批號Y24O7C23495）；(-)-甘草素（≥98%，批號W22A7K13544）；槲皮素（≥98%，批號C20J6Y1722）；黃芩素（≥98%，批號1209A022）；甘草酸（≥98%，批號P04N7F24311）；鄰甲基肉桂醛（≥98%，批號P04S7F23015）；千層紙素（≥98%，批號Q-020-161121）；漢黃芩素（≥98%，批號P04A7F18933）以上標準品均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈色譜級購自Merck，Germany；甲酸色譜級購自Tedia，USA；無水乙醇購自中國醫(yī)藥集團化學試劑公司。甲型流感病毒H1N1/PR8株（于山東中醫(yī)藥大學抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心-80℃保存），尿囊液（在9日齡SPF雞胚中擴增得到，以測定血凝效價）；金黃色葡萄球菌（保存于山東中醫(yī)藥大學抗病毒創(chuàng)新中心）；達菲（上海羅氏制藥有限公司，批號：M1050）。

1.3 儀器

Thermo Fisher UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)（美國，Thermo fisher公司）；Thermo Fisher Q Exactive高分辨質譜儀（美國，Thermo fisher公司）；十萬分之一電子分析天平（BT125D，賽多利斯科學儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（EYELAN-1100，日本東京理化器械株式會社），熒光定量PCR儀（伯樂公司，型號：CFX Connect，美國）。

1.4 數(shù)據(jù)庫與軟件

Swiss Target Prediction平臺（http://www.swiss target prediction.ch/）；DisGeNET平臺（https://www.disgenet.org/）；OMIM平臺（https://www.omim.org）；Cytoscape3.8.0軟件；Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html）；Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org），Xcalibur3.0軟件。

1.5 實驗動物

雄性BALB/c小鼠32只，體重（19±1）g。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心【SYXK（魯）2017-0022】。飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司【SCXK（魯）2018-0003】提供。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22-25℃。所有操作山東中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理審查委員會審查通過。

2 方法

2.1 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的療效

2.1.1 CGD樣品制備

分別稱取桂枝、黃芩、黨參、白芍、生姜、大棗各4.5 g，甘草3 g，柴胡12 g，姜半夏7.5 g，加入水，30 min浸泡，（每次40 min，3次）煎煮，過濾后，濃縮至生藥材0.5 g·mL-1，冷凍干燥，得CGD凍干粉相當于生藥材10 g·g-1。

2.1.2 動物造模、分組及給藥

將小鼠按體重隨機分成4組，為正常組、模型組、達菲組、CGD組，每組8只。各組小鼠在異氟烷麻醉下，第0天正常組滴鼻生理鹽水，其余組滴鼻0.25 TCID50的H1N1/PR8，每只20 μL并移至另室飼養(yǎng)。第3天模型組、達菲組、CGD組滴鼻金黃色葡萄球菌2.5×107CFU，每只20 μL。第1天達菲組（達菲，19.5 mg·kg-1），柴胡桂枝湯組（6.2 g·kg-1）灌胃給藥。觀察實驗動物狀態(tài)、每天記錄生存率、體重。取肺、脾、胸腺，計算臟器指數(shù)。取20 mg肺組織采用涂布法對細菌載量進行檢測。

2.1.3 RT-qPCR檢測肺組織中M mRNA的相對表達量

15-20 mg肺組織加入300 μL RL裂解液，研磨成勻漿，按照動物組織總RNA提取試劑盒方法操作，測定總RNA濃度，反轉錄得到cDNA。建立20 μL的RT-qPCR反應體系，放入熒光定量PCR儀中擴增，95℃預變性15 min，95℃變性10 s，40個循環(huán)，66℃退火/延伸32 s，40個循環(huán)。實驗后記錄Ct值，通過計算2-ΔΔCt得到mRNA的相對表達量。流感病毒M基因引物序列F：5’-CTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3’，R：5’-CGTCTACGCTGCAGTCCTC-3’，產物長度227 bp。內參基因PPIA引物序列F：5’-CGCTTGCTGCAGCCA TGGTC-3’，R：5’-CAGCTCGAAGGAGACGCGGC-3’，產物長度86 bp。

2.2 基于網絡藥理學CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的機制

2.2.1 CGD的化學成分表征

色譜條件：Halo C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，2.7 μm），流動相A：0.1%甲酸水，流動相B：乙腈，梯度洗脫條件：0-3 min，5% B；3-10 min，12% B；10-18 min，23% B；18-23 min，23% B；23-50 min，28% B；50-60 min，62% B；60 min，100%B；進樣體積：5.0 μL；流速：0.3 mL·min-1，柱溫：35℃。

質譜條件：離子源：ESI，毛細管溫度：350℃，毛細管電壓：3500 V，鞘氣45 arb，輔助氣10 arb，源內溫度350℃，分辨率為70 000，質譜采集范圍50-1500 m·z-1。

通過文獻檢索，建立復方中生物堿、皂苷、有機酸、黃酮等類型化學成分數(shù)據(jù)庫。使用Xcalibur3.0軟件，結合本實驗已有對照品的LC-MS數(shù)據(jù)，對獲取的質譜數(shù)據(jù)進行分析。

2.2.2 網絡藥理學研究CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的機制

（1）CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的潛在作用靶點的篩選

基于LC/MS分析鑒定出的化學成分作為目標成分，利用Swiss Target Prediction平臺預測出CGD的靶點。以“Pneumonia, Viral”，“Pneumonia and influenza”，“Secondary bacterial pneumonia”，“Staphylococcus Aureus Pneumonia”，“Pneumonia due to influenza”，“Pneumonia”，“Pneumonia caused by influenza”作為關鍵詞，通過DisGeNET平臺進行檢索，以“influenza”為關鍵詞，通過OMIM平臺檢索流感繼發(fā)細菌性肺炎相關靶點。

（2）PPI網絡的構建

利用string平臺將共有靶點進行拓撲，設置蛋白最低置信度為0.400，將下載的TSV文件利用CytoScape3.7.2軟件構建蛋白相互作用的PPI網絡并進行拓撲分析。

（3）KEGG富集分析

采用Metascape數(shù)據(jù)庫，以P＜0.01、最小計數(shù)為3且富集因子＞1.5為篩選條件對潛在靶點進行KEGG通路富集分析，對排名前19的KEGG條目進行可視化處理。

（4）GO富集分析

采用Metascape數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進行GO功能富集分析，以P＜0.01、最小計數(shù)為3且富集因子＞1.5為篩選條件，對排名前10的GO條目進行可視化處理。

（5）“成分-靶點-通路”網絡的構建

利用CytoScape 3.7.2軟件將“成分-靶點-通路”圖可視化。

2.3 靶點驗證

2.3.1 CGD主要成分-流感繼發(fā)細菌性肺炎靶點的分子對接

利用AutoDockTools-1.5.6軟件將“成分-靶點-通路”網絡Degree值最高的3個成分：千層紙素A-7-Oβ-D-葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素與TNF、PTGS2、EGFR靶點逐一進行對接。

2.3.2 RT-qPCR檢測肺組織中核心靶點mRNA的相對表達量

實驗方法如3.1.3所示，EGFR基因引物序列F：5’-TCCTGATTGGTGCTGTGCGATTC-3’，R：5’-CAACTG CTCGGATGGCTCTGTAAG-3’，產物長度133 bp。PTGS2基因引物序列F：5’-CTGGTGCCTGGTCTGATG ATGTATG-3’，R：5’-GGATGCTCCTGCTTGAGTATGT CG-3’，產物長度83 bp。TNF-α基因引物序列F：5’-AAGCATGATCCGAGATGTG-3’，R：5’-CCGAAGTTC AGTAGACAGAA-3’，產物長度150 bp。

2.4 數(shù)據(jù)處理

以平均值±標準誤（xˉ±SEM）表示各樣本數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析及LSD組間比較。以P＜0.05表示差異具有顯著性。

3 結果

3.1 CGD對流感-金黃色葡萄球菌的干預作用

正常組的小鼠飲水量和飲食量正常，毛發(fā)光滑，反應靈敏，體重持續(xù)上升；模型組小鼠在第4天體重開始下降，蜷臥懶動、反應遲鈍、毛色黯淡、體形消瘦；CGD組小鼠表現(xiàn)出一定的回調。模型組生存率為50%，達菲組和CGD組生存率為87.5%。與模型組相比CGD組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），與模型組相比CGD組小鼠肺指數(shù)、MmRNA的相對表達量、細菌載量顯著降低（P＜0.05）表明CGD對流感繼發(fā)細菌性肺炎有較好的治療作用（圖1-3）。

圖1 各組小鼠生存率和體質量變化

圖2 各組小鼠臟器指數(shù)變化

圖3 各組小鼠M基因相對表達量和細菌載量變化

3.2 基于網絡藥理學CGD治療流感-金黃色葡萄球菌的機制

3.2.1 CGD的UPLC-Q-Exactive/MS分析結果

采用UPLC-Q-Exactive/MS技術，檢測得到CGD復方中各化學成分的總離子流圖見圖4；結合對照品及建立的化學成分庫進行化學成分表征，鑒定了51個化合物，結果見表1。

圖4 CGD UPLC-Q-Exactive/MS分析的負離子模式總離子流圖

3.2.2 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的潛在作用靶點

利用Swiss Target Prediction平臺預測出CGD靶點463個。通過DisGeNET平臺檢索流感繼發(fā)細菌性肺炎相關靶點，得到1042個疾病靶基因，Venn對成分和疾病靶點進行分析，共獲得107個交集靶點，為CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的潛在作用靶點。

構建PPI網絡并進行拓撲分析，結果見圖5，排名前10位的為核心靶點：TNF、AKT1、ALB、VEGFA、MAPK3、PTGS2、STAT3、EGFR、TLR4、PPARG。

圖5 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的PPI網絡

3.2.3 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的潛在作用通路

采用Metascape數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，結果見圖6，節(jié)點越大，排名越靠前，表明存在該通路上潛在靶點數(shù)越多。排名前10通路有3條炎癥、免疫相關通路：Fc epsilon RI信號通路、GnRH信號通路、NF-κB信號通路。

圖6 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的KEGG富集分析

GO功能富集分析，結果見圖7。BP主要包括防御反應的調節(jié)、免疫效應過程等。MF主要涉及絲氨酸型肽酶活性、磷酸轉移酶活等。CC主要涉及囊泡腔、膜面等。分析表明CGD可能通過增強免疫功能、提高防御能力、降低細菌的粘附、抵抗炎癥反應等治療流感繼發(fā)細菌性肺炎。

圖7 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的GO分析

3.2.4 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的潛在成分

構建“成分-靶點-通路”網絡。圖8顯示千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（degree：34）、漢黃芩素（degree：33）、黃芩素（degree：33）、5,7,2’-Trihydroxyflavone（degree：32）、去甲漢黃芩素（degree：30），degree值大于30可能為CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的關鍵成分。

圖8 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的“中藥成分-靶點-通路”

3.3 CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的潛在成分和靶點的驗證

3.3.1 基于分子對接驗證CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的成分

千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素與PTGS2、EGFR有強親和活性，可能為CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎潛在成分，作用于關鍵疾病靶點PTGS2和EGFR而發(fā)揮作用。其中千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷也作用于TNF靶點發(fā)揮治療作用。具體對接結果如表2、圖9所示。

表2 TNF、PTGS2、EGFR與CGD中關鍵活性成分分子對接結果表

圖9 分子對接結果示意圖

3.3.2 基于RT-qPCR驗證CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的靶點

與正常組相比，模型組TNF-α顯著升高，EGFR、PTGS2顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，CGD干預后TNF-α顯著降低，EGFR、PTGS2顯著升高（P＜0.05）。上述結果表明CGD可能通過調節(jié)TNF-α、EGFR、PTGS2靶點來發(fā)揮治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的作用（圖10）。

圖10 各組小鼠TNF-α、EGFR、PTGS2的mRNA的相對表達量結果圖

4 討論

本研究建立了流感繼發(fā)細菌性肺炎模型，CGD干預共感染模型小鼠后，能改善小鼠的體重下降，提高小鼠的存活率，顯著降低了肺指數(shù)，病毒M mRNA的表達量和細菌載量，起到較好的治療作用。因此，采用UPLC-Q-Exactive/MS技術，定性了51種成分，并結合網絡藥理學得到了CGD可能通過千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩素、黃芩素、5,7,2’-Trihydroxyflavone、去甲漢黃芩素；TNF、AKT1、ALB、VEGFA、MAPK3、PTGS2、STAT3、EGFR、TLR4、PPARG靶點；Fc epsilon RI 信號通路、GnRH信號通路、NF-κB信號通路來發(fā)揮治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的作用。通過分子對接和RT-qPCR技術對上述成分和靶點進行驗證，對CGD中的成分千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩素、黃芩素與TNF-α、EGFR、PTGS2進行分子對接發(fā)現(xiàn)，上述成分和靶點有較強的親和活性。RT-qPCR結果發(fā)現(xiàn)CGD可以調節(jié)共感染小鼠TNF-α、EGFR、PTGS2 mRNA的相對表達量，上述結果表明CGD可能通過千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩素、黃芩素成分，TNF-α、EGFR、PTGS2來發(fā)揮治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的作用。

其中TNF-α、PTGS2是NF-κB信號通路的靶點。該通路是炎癥的中央信號傳導通路[18]、炎癥等生命過程[19]。PPAR家族調控參與細胞增殖、分化、炎癥和免疫相關蛋白的表達[20]。有報道[21]發(fā)現(xiàn)PPARγ能調控NF-κB表達，降低TNF-α水平，在流感和金黃色葡萄球菌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要調控作用。

CGD中千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩素、黃芩素成分可能為CGD治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的關鍵成分；其中黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一[22]，黃芩素廣泛的用于治療流感和金黃色葡萄球菌感染[23-25]。漢黃芩素是傳統(tǒng)中草藥黃芩的有效成分之一[26]，漢黃芩素能抑制NF-κB p65的表達,減輕炎癥反應[27]。千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的代謝物千層紙素A可以發(fā)揮抗菌及抗內毒素的作用[28]。

5 結論

本研究成功建立了流感繼發(fā)細菌性肺炎模型，采用CGD進行干預，發(fā)現(xiàn)CGD對其具有較好的治療作用，采用網絡藥理學對機制進行預測，采用分子對接和RT-qPCR技術和進行驗證，CGD可能通過千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩素、黃芩素成分，TNF-α、EGFR、PTGS2來發(fā)揮治療流感繼發(fā)細菌性肺炎的作用。