基于慢病毒介導的NLRP3過表達對艾灸調控實驗性RA家兔關節(jié)滑膜液anti-CCP、RF水平的影響*

楊馨，王燚，楊慎峭，馬文彬，吳菲，席東來，路曉清，陳俊，周海燕**

（1.成都中醫(yī)藥大學養(yǎng)生康復學院 成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院 成都 610075；3.成都中醫(yī)藥大學外語學院 成都 610075）

類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是以關節(jié)滑膜持續(xù)慢性炎癥、進行性軟骨和骨破壞、自身抗體產生為特征的自身免疫性疾病[1]，炎癥就是劇烈免疫反應的結果?，F(xiàn)代研究證實，機體的固有免疫和適應性免疫均在RA發(fā)病中起著重要作用[2]。RA是一種嚴重的慢性疾病，發(fā)病率在0.4%-1.3%之間[3]。在RA中，持續(xù)性滑膜炎癥的存在最終導致肌腱、關節(jié)囊、軟骨和骨出現(xiàn)進行性和不可逆性破壞以及功能障礙[4]。艾灸作為一種無明顯毒副作用的中醫(yī)外治療法，被廣泛用于RA的治療并取得較好的臨床效果[5-8]。NOD樣受體相關蛋白3（NOD-like receptor associated protein 3，NLRP3）炎癥小體是先天性免疫的主要組成，而抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體（anti-cyclic citrulline peptide，anti-CCP)和類風濕因子（Rheumatoid factor，RF）的產生是RA自身免疫失常的特征之一[9]；NLRP3作為炎性細胞因子的觸發(fā)器，與其下游的白細胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）的活化與釋放相關，而IL-18對RA的發(fā)生發(fā)展具有全局性的影響。我們的前期研究已經證實艾灸能夠抑制NLRP3 mRNA的表達和炎性細胞因子的釋放，從而減輕滑膜的炎癥。因此，鑒于NLRP3炎癥小體在“炎癥-免疫”反應中的紐帶作用，在人體先天性免疫中的關鍵調節(jié)作用，本實驗通過慢病毒載體來介導NLRP3在實驗性RA家兔體內的過表達，居于艾灸的抗炎效應，觀察其對膝關節(jié)滑膜液免疫效應因子anti-CCP、RF，炎性細胞因子IL-18含量的影響，討論NLRP3在艾灸調整RA免疫，實現(xiàn)其抗炎效應中的作用，探索艾灸對實驗性RA異常免疫功能的影響，進一步探討其NLRP3調控機制。

1 實驗材料與實驗方法

1.1 實驗動物

1.1.1 動物

日本大耳白兔30只，2.0 kg≤體質量≤3 kg，雌雄各半，成都中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心（許可證編號：SYXK（川）2019-049）提供。動物于實驗前進行適應性馴養(yǎng)，時長為1周。普通動物飼養(yǎng)條件。

1.1.2 分組

原則：按體質量、性別分層，30只家兔隨機分為空白對照組（簡稱空白組）、RA模型組（簡稱模型組）、艾灸治療組（簡稱艾灸組）、艾灸+NLRP3過表達組（簡稱NLRP3過表達組）、艾灸＋NLRP3陰性對照組（簡稱NLRP3陰性對照組），6只/組。

1.1.3 動物處置

遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》（國科發(fā)財字〔2006〕398號）；成都中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心批準，倫理審核申請備案編號為2018-22。

1.2 主要試劑藥品及儀器

1.2.1 試劑

①福氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA），美國Sigma公司，批號：F5881；②NLRP3過表達慢病毒載體LV-NLRP3（22143-1）：2E+8TU·mL-1，上海吉凱基因公司，批號：GCD0220715；③Rabbit CCPAb ELISA KIT/ Rabbit RF ELISA KIT/Rabbit IL-18 ELISA KIT，上海茁彩生物科技有限公司，批號：ZC-54615/ZC-54611/ZC-52384。

1.2.2 藥品

小艾柱（4×10 mm），濟南歐脈醫(yī)療器械有限公司，批號：09000314471。

1.2.3 儀器

①SpectraMAX Plus384酶標儀，美谷分子儀器有限公司；②UPH-Ⅱ-10T優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，成都超純科技有限公司；③移液槍，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；④槍頭，美國Axygen公司；⑤EP管，美國Axygen公司；⑥軟皮尺，精度：1MM。

1.3 造模方法

1.3.1 RA模型塑造

模型組、艾灸組、NLRP3過表達組、NLRP3陰性對照組各家兔雙后腿膝關節(jié)剃毛、消毒后，將FCA平均注入兔雙膝關節(jié)腔內（0.5 mL·kg-1，穿刺點：髕骨下緣、臏韌帶外側凹陷），空白組同法注入等量無菌生理鹽水作對照。該模型為實驗性RA的經典模型[10]，課題組在既往研究中反復多次塑造獲得成功，并觀察到實驗性RA動物模型在造模后滑膜組織發(fā)生明顯的炎性反應。

1.3.2 慢病毒介導NLRP3炎癥小體過表達模型塑造

在體操作之前，先進行感染效率驗證（體外分離、培養(yǎng)兔滑膜細胞并轉導NLRP3過表達慢病毒載體Lv-NLRP3-GFP，Western blot和RT-PCR檢測NLRP3蛋白及mRNA表達情況-由上海吉凱基因化學技術有限公司完成）。根據(jù)文獻[11]，造模后第3天和開始治療后第10天共進行兩次NLRP3過表達慢病毒載體在體操作，應用微量注射器將NLRP3過表達慢病毒載體溶液0.34 mL（Lv-NLRP3-GFP（滴度5.0×1011TU·mL-1）10 μL+生理鹽水）平均注入NLRP3過表達組兔雙后膝關節(jié)腔內，在關節(jié)處用手輕揉5 min，幫助注入慢病毒的擴散。LvGFP同法等量注入NLRP3陰性對照組作對照，無菌生理鹽水同法等量注入空白組、模型組、艾灸組作對照。

1.4 治療方法

造模后第7天，用兔架固定艾灸組、NLRP3過表達組、NLRP3陰性對照組家兔，小艾柱灸雙側“腎俞”、“足三里”（定位：《實驗針灸學》[12]=）穴各五壯/1次/日（治療穴位部位剃毛2 cm×2 cm），6天為1個療程，總共3療程，每療程之間停1天?？瞻捉M和模型組動物同法固定作參照。

1.5 指標及檢測方法

1.5.1 膝關節(jié)周長測定

測定各組家兔后腿左、右膝關節(jié)周長（時間節(jié)點：造模前，治療后第6、12、18、21天）。

1.5.2 滑膜液抽取

實驗結束后，耳緣靜脈空氣注射處死實驗動物，同法取雙側滑膜液：膝關節(jié)腔注入1 mL生理鹽水（輕微活動膝關節(jié)混勻滑膜液）并回抽0.4 mL注入Eppendorf管，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 anti-CCP、RF、IL-18檢測操作

將CCP-Ab、RF、IL-18抗體包被于微孔板中，制成固相載體后，進行加樣、配液、洗滌、顯色、終止，最后用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，方差齊，選用LSD檢驗；方差不齊，選用Tamhane’s T2檢驗。統(tǒng)計學意義標準：P＜0.05為有差異。

2 結果

2.1 艾灸對實驗性RA家兔膝關節(jié)周長的影響

結果參照表1、表2及圖1、圖2。根據(jù)結果可以看出，各組家兔左、右后膝關節(jié)周長在造模前無明顯差異（P＞0.05），提示各組實驗動物可以進行比較；模型組較空白組家兔左、右后膝關節(jié)周長在治療后第6、12、18、21天均顯著增長（P＜0.01），炎癥反應持續(xù)存在，提示實驗性RA模型塑造成功；艾灸組較模型組在治療后第6、12、18、21天測得左、右后膝關節(jié)周長明顯下降（P＜0.01）；NLRP3過表達組較艾灸組在治療后第6、12、18、21天測得左、右后膝關節(jié)周長明顯增長（P＜0.05），NLRP3過表達陰性組較艾灸組在治療后各個時間點左、右膝關節(jié)周長無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功，在NLRP3炎癥小體過表達的情況下，艾灸治療RA的抗炎消腫作用有明顯抑制。

圖1 各組家兔在造模前及治療后各個時間段左膝關節(jié)周長變化圖

圖2 各組家兔在造模前及治療后各個時間段右膝關節(jié)周長變化圖

表1 各組家兔左后膝關節(jié)周長比較（±s，n=6）

表1 各組家兔左后膝關節(jié)周長比較（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組造模前（cm）9.870±0.216 9.830±0.206 9.913±0.146 10.000±0.245 9.900±0.200治療后第6天（cm）9.960±0.232 10.960±0.288·10.300±0.107◆10.811±0.136▼10.330±0.164治療后第12天（cm）10.010±0.166 10.970±0.258·10.263±0.200◆10.767±0.16▼10.050±0.127治療后第18天（cm）10.020±0.199 11.100±0.249·10.100±0.131◆10.544±0.230▼10.060±0.212治療后第21天（cm）9.990±0.145 10.910±0.160·10.025±0.175◆10.333±0.166▼10.040±0.217

表2 各組家兔右后膝關節(jié)周長比較（±s，n=6）

表2 各組家兔右后膝關節(jié)周長比較（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組造模前（cm）9.990±0.173 9.930±0.183 9.925±0.191 9.989±0.242 9.860±0.178治療后第6天（cm）9.920±0.193 11.050±0.259·10.263±0.160◆10.800±0.166▼10.320±0.175治療后第12天（cm）9.990±0.223 11.070±0.245·10.250±0.160◆10.767±0.1942▼10.050±0.143治療后第18天（cm）10.030±0.164 11.370±0.221·10.163±0.119◆10.511±0.169▼10.100±0.194治療后第21天（cm）10.070±0.125 11.210±0.179·10.013±0.113◆10.311±0.190▼10.010±0.202

2.2 艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP含量的影響

結果見表3及圖3。根據(jù)結果可以看出，模型組較空白組anti-CCP含量明顯升高（P＜0.01）；艾灸組較模型組anti-CCP含量明顯降低（P＜0.01），NLRP3過表達組較艾灸組anti-CCP明顯升高（P＜0.05）；提示通過艾灸治療可降低RA家兔雙側膝關節(jié)滑膜液中anti-CCP的含量，但在NLRP3過表達的情況下其作用明顯降低；與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組anti-CCP含量無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功。

圖3 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影響

表3 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影響（±s，n=6）

表3 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液anti-CCP水平的影響（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3陰性對照組anti-CCP（ng·mL-1）8.898±3.000 14.370±2.837·9.897±2.223◆13.793±3.170▼9.395±1.786

2.3 艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF含量的影響

結果見表4及圖4。根據(jù)結果可以看出，模型組較空白組RF含量明顯升高（P＜0.01）；艾灸組較模型組RF含量明顯降低（P＜0.01），NLRP3過表達組較艾灸組RF含量明顯升高（P＜0.01），提示通過艾灸治療可降低RA家兔雙側膝關節(jié)滑膜液中RF的含量，但在NLRP3過表達的情況下其作用明顯降低；與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組RF含量無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功。

圖4 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF水平的影響

表4 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF含量的影響（±s，n=6）

表4 基于NLRP3過表達的艾灸對實驗性RA家兔滑膜液RF含量的影響（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組RF（ng·mL-1）0.322±0.122 0.587±0.108·0.320±0.115◆0.662±0.152▼0.495±0.091

2.4 艾灸對實驗性RA家兔IL-18含量的影響

結果見表5及圖5。根據(jù)結果可以看出，模型組較空白組IL-18含量明顯升高（P＜0.01）；艾灸組較模型組IL-18含量明顯降低（P＜0.01），NLRP3過表達組較艾灸組IL-18含量明顯升高（P＜0.01），提示通過艾灸治療可降低RA家兔雙側膝關節(jié)滑膜液中IL-18的含量，但在NLRP3過表達的情況下其作用明顯降低；與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組IL-18含量無顯著差異（P＞0.05），與艾灸組比較，NLRP3過表達陰性組IL-18含量無明顯差異（P＞0.05），提示僅有空病毒注射不會對實驗動物產生影響，慢病毒介導的NLRP3在體過表達塑造成功。

圖5 基于NLRP3過表達的艾灸治療對實驗性RA家兔滑膜液IL-18含量的影響

表5 基于NLRP3過表達的艾灸治療對實驗性RA家兔滑膜液IL-18含量的影響（±s，n=6）

表5 基于NLRP3過表達的艾灸治療對實驗性RA家兔滑膜液IL-18含量的影響（±s，n=6）

組別空白對照組RA模型組艾灸治療組NLRP3過表達組NLRP3過表達陰性組IL-18（ng·mL-1）10.278±0.899 13.360±1.246·10.087±0.683◆12.428±1.440▼9.877±0.502

3 討論

免疫反應與炎癥在組織、細胞、分子信號水平關系密切，適度的免疫反應對機體有利，但過度的免疫反應卻會對機體產生傷害，導致機體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)被破壞而致病[13]，免疫功能失調就是RA發(fā)病的主要原因。NLRP3炎癥小體是機體先天性免疫系統(tǒng)的關鍵調節(jié)者，是調控炎性細胞因子產生的最主要途徑[14-15]，近來研究發(fā)現(xiàn)，先天性免疫失調會促使大量炎性細胞因子的釋放[16]，而炎性細胞因子的分泌在NLRP3相關通路傳導受抑制的情況下可有效減少，RA的發(fā)展進程得到控制[17-18]。NLRP3作為炎癥小體的主要組成部分，能識別體內多種危險信號，通過結合ASC，形成具有促炎活性的Caspase-1，進而誘導IL-18的生成引起炎癥反應，在機體免疫炎癥中發(fā)揮關鍵作用[19]。IL-18是NLRP3炎性小體的下游效應分子，在RA的發(fā)病過程中十分關鍵，對RA的發(fā)生具有全局性影響，能誘導其它炎癥因子、黏附分子及炎癥介質的分泌與合成[20-21]。

研究表明NLRP3與RF等自身抗體具有顯著相關性[22]。anti-CCP、RF等免疫分子的異常增多與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關[23]?；赼nti-CCP在RA中的高度特異性[24-25]，RF在RA中的高度敏感性，2010年ACR和歐洲抗風濕聯(lián)盟（European League Against Rheumatism，EULAR）制定的新RA分類標準增加了anti-CCP指標[26]。以往anti-CCP、RF等聯(lián)測模式多用于提高診斷[27-30]的準確性，實際上，anti-CCP、RF的量化能夠敏感地反映RA免疫反應的程度：RF含量與自身免疫反應劇烈程度呈現(xiàn)正相關，隨病情發(fā)展增加[31]，與病情處于活動期、病程長有關，劇烈的免疫反應會加快炎癥的進程。當病情得到控制后，RF滴度降低，其含量變化對判斷RA預后具有重要意義。另外，滑膜液中的RF還會與變性IgG結合，形成中等大小的免疫復合物后沉積于關節(jié)滑膜，從而導致慢性、免疫炎癥性損傷；anti-CCP是RA的臨床監(jiān)測指標，與RA的活動性、病情嚴重程度及病情發(fā)展有關，用于判斷RA疾病活動程度及骨侵蝕嚴重程度[32-34]。

RA發(fā)病之根本所在，是標實的同時寓有本虛，先天稟賦不足，腎精虧虛。因此，溫腎固本，通經活絡，扶正以祛邪是類風濕性關節(jié)炎的治療之根[35-36]。艾灸之法，溫經散寒、扶正祛邪、調理陰陽，因此常用于各種經脈痹阻、陽氣不足所致之癥。本實驗選穴足三里、腎俞，分別為胃經下合穴與腎之背俞穴，具有調理脾胃、調理先天之本、振奮正氣之效。二者配伍，后天補先天，先天生后天，使陽氣內生，匡扶正氣。臨床研究、系統(tǒng)性評價業(yè)已證實艾灸具有較好的臨床治療效果[5-8]及循證醫(yī)學證據(jù)[37]支持。我們的前期研究表明艾灸對實驗性RA具有明確的抗炎效應和免疫調整作用，且能夠良性調整引發(fā)持續(xù)性滑膜炎癥的炎性細胞因子的分泌及其信號傳導通路[38-45]。結合本次實驗結果，提示艾灸可降低家兔雙側膝關節(jié)腫脹程度及滑膜液中免疫效應因子anti-CCP、RF，促炎性細胞因子IL-18的含量，在NLRP3過表達的情況下其作用顯著降低，說明艾灸可能通過有效調控實驗性RA家兔關節(jié)滑膜液中anti-CCP、RF、IL-18的含量來實現(xiàn)抑制實驗性RA家兔異常免疫反應，從而實現(xiàn)其抗炎調節(jié)作用，而這一作用的實現(xiàn)可能與NLRP3表達情況有密切關聯(lián)。本實驗結果也印證了“炎癥就是劇烈免疫反應的結果”。近年來，隨著醫(yī)學的發(fā)展和進步，已基本明確了NLRP3的結構，但是NLRP3是如何啟動、激活、調控的，尤其在RA中，尚處于探索研究階段。RA是一個以自身免疫抗體產生為特征的自身免疫性疾病，作為免疫與炎癥的紐帶，以NLRP3為切入點，艾灸-NLRP3-anti-CCP/RF-IL-18為研究主線，有望在艾灸治療RA的研究領域取得新進展，可以為臨床探索RA的治療提供新思路，為艾灸治療RA提供實驗依據(jù)。