桂枝茯苓膠囊對(duì)子宮內(nèi)膜炎模型大鼠NF-κB及MAPK信號(hào)通路的影響*

孫蘭，李家春，皇立衛(wèi)，閆宇輝，王振中，王麗

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 淮安 223003；2.江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 淮安 223003；3.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將子宮內(nèi)膜炎歸屬為“不孕”、“痛經(jīng)”等范疇[9]，桂枝茯苓膠囊是源于經(jīng)典處方的現(xiàn)代中藥制劑，處方由桂枝、茯苓等五味中藥組成，具有活血化瘀、緩消癥塊之功效，臨床上主要用于盆腔炎性疾病、原發(fā)性痛經(jīng)和子宮肌瘤等疾病，療效顯著[10]。研究表明桂枝茯苓膠囊能夠有效降低盆腔炎患者血清中白細(xì)胞介素10（Interleukin10，IL-10）、白細(xì)胞介素4（Interleukin4，IL-4）等細(xì)胞炎癥因子的水平[11]。本實(shí)驗(yàn)采用LPS誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜炎模型大鼠，考察桂枝茯苓膠囊對(duì)NF-κB和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)蛋白的影響，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大鼠60只，雌性，體質(zhì)量200±20 g，SPF級(jí)，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007。大鼠飼養(yǎng)于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)場所，室溫（24±2）℃，相對(duì)濕度40%-60%，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料飼養(yǎng)，每日保持12 h光照。

1.2 藥物與試劑

桂枝茯苓膠囊（200506，0.31 g/粒，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司）；脂多糖（Sigma公司）；髓過氧化物酶（MPO）測試盒（南京建成生物工程研究所）；醋酸地塞米松片（辰欣藥業(yè)股份有限公司）；IL-1β試劑盒（eBioscience公司）；IL-6試劑盒（eBioscience公司）；TNF-α試劑盒（eBioscience公司）；p38、p38（phospho T180+Y182）、NF-κBp65，NF-κB p65（phospho S276）、IκBα抗體（Abaca公司）；IκBα（phospho S36）抗體（Abaca公司）；ERK抗體（CST公司）； HRP標(biāo)記的羊抗兔的二抗（CST公司）；Precision plus ProteinTM Dual color Standards（Bio-Rad公司）。

1.3 儀器

ChemiDoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；渦旋混勻儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；Flexstation?3鈣流工作站（美國Molecular Devices公司）；蛋白質(zhì)小型垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；CENTRFUGE5840型冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（山東鑫煤礦山設(shè)備集團(tuán)有限公司）；勻漿機(jī)（德國IKA）；1703930轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；BX41顯微鏡（OLYMPUS公司）；YM30立式壓力蒸汽滅菌器（上海新諾）。

2 方法

2.1 分組、給藥及模型復(fù)制

選取健康60只雌性大鼠，按照體重隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、陽性組（醋酸地塞米松，2.5 mg·kg-1）、桂枝茯苓膠囊高、中、低劑量組（0.54、0.27、0.14 g·kg-1，各相當(dāng)于按體表面積折算的人臨床日用劑量的2、1、0.5倍），每組10只。各給藥組連續(xù)灌胃給藥7天，假手術(shù)組、模型組灌胃給與0.5% CMCNa，每天灌胃1次，灌胃體積10 mL·kg-1。末次給藥1 h，參照文獻(xiàn)方法復(fù)制大鼠子宮內(nèi)膜炎模型[12]，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組動(dòng)物，假手術(shù)組大鼠僅做開腹和關(guān)腹操作，其余組大鼠左側(cè)子宮用注射器刮傷子宮內(nèi)膜并注射（1.0 μg·μL-1）LPS生理鹽水溶液0.25 mL，模型復(fù)制24 h后處死動(dòng)物。

2.2 子宮組織處理

注射LPS 24 h后，采用脫頸椎方式處死各組動(dòng)物，采用75%乙醇消毒腹部，打開各鼠腹腔取左側(cè)子宮，冰上取一部分左側(cè)子宮組織，放入10%甲醛溶液中固定待測病理，剩余子宮組織-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 HE染色觀察子宮病理變化

將子宮組織從固定溶液中取出，貼好標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)依次脫水處理，隨后用石蠟包埋子宮組織，包埋好的組織切片為4 μm厚度。組織切片用蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色處理。在光鏡下觀察子宮腔、固有層腺體、子宮內(nèi)膜有無炎細(xì)胞浸潤及充血水腫等病理變化。觀察指標(biāo)如下：①觀察子宮腔有無縮小、粘連等變化，無病變記0分；輕度病變及病變范圍小于1/3記1分；中度病變、病變范圍在1/3-2/3之間記2分；重度病變、病變范圍在2/3以上的記3分。②觀察子宮內(nèi)膜及固有層腺體上皮細(xì)胞有無變性壞死，無病變記0分；輕度病變及病變范圍小于1/3記1分；中度病變、病變范圍在1/3-2/3之間記2分；重度病變、病變范圍在2/3以上的記3分。③觀察子宮粘膜固有層有無炎細(xì)胞浸潤，有無充血水腫，按照無明顯、輕度、中度、重度不同病變程度分別記0分、1分、2分、3分。④觀察子宮肌層有無炎細(xì)胞浸潤，按照無明顯、輕度、中度、重度不同病變程度分別記0分、1分、2分、3分。累加每組各指標(biāo)所有分?jǐn)?shù)。

2.4 比色法檢測MPO活性

稱取子宮組織，按照1:19加勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿，根據(jù)說明書方法操作，在460 nm波長處測定各管吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算各組MPO活性。

2.5 ELISA檢測子宮組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平

從-80℃冰箱中取出子宮組織，解凍后稱取適量放入離心管中，按照子宮組織與生理鹽水1∶9的比例，用移液管加入生理鹽水于各個(gè)離心管中，用自動(dòng)勻漿機(jī)研磨，離心機(jī)設(shè)置溫度設(shè)置4°C，轉(zhuǎn)速設(shè)置3000 r·min-1，離心管放入離心機(jī)中離心15 min，離心結(jié)束取上清液用于因子檢測，根據(jù)說明書操作步驟依次檢測IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子水平。

LU Wen-juan, CHEN Jing, ZHANG Jing-qing, JIANG Xin-hui

2.6 Western blot法檢測子宮組織中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38及其磷酸化蛋白表達(dá)水平

稱取各組子宮組織，用勻漿機(jī)研磨成漿，加入適量的含苯甲基磺酰氟的強(qiáng)效裂解液，分別提取各組大鼠子宮組織蛋白，并采用蛋白質(zhì)定量（Bicinchoninic acid，BCA）法進(jìn)行蛋白定量，各組取相同質(zhì)量的蛋白進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，封閉2 h。用洗膜液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗滌三次后加入一抗，4℃冰箱放置孵育過夜。TBST洗膜3次后加入稀釋二抗，放置搖床上，室溫輕搖孵育2 h，TBST漂洗膜3次。采用化學(xué)發(fā)光法（Enhanced Chemiluminescence，ECL）顯影并進(jìn)行分析。

2.7 數(shù)據(jù)處理

檢測數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5.0分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)子宮組織病理的影響

如圖1所示，組織學(xué)觀察顯示假手術(shù)組子宮組織結(jié)構(gòu)完整，模型組子宮表現(xiàn)出明顯的病理變化，如子宮內(nèi)膜充血水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分結(jié)構(gòu)消失，桂枝茯苓膠囊能明顯改善LPS誘導(dǎo)的子宮組織損傷。如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠子宮組織病理評(píng)分顯著升高（P＜0.01），表現(xiàn)在子宮腺體上皮細(xì)胞有變性、壞死，子宮內(nèi)膜層有以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤；與模型組大鼠子宮病變相比較，陽性組（醋酸地塞米松）、桂枝茯苓膠囊3個(gè)劑量組大鼠子宮組織病變明顯減輕，病理評(píng)分顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。這些結(jié)果表明桂枝茯苓膠囊可以減輕LPS誘導(dǎo)的子宮病理組織損傷。

表1 對(duì)子宮組織病理的影響（±s，n=10）

表1 對(duì)子宮組織病理的影響（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組地塞米松組桂枝茯苓膠囊組桂枝茯苓膠囊組桂枝茯苓膠囊組劑量--2.5 mg·kg-1 0.54 g·kg-1 0.27 g·kg-1 0.14 g·kg-1病理評(píng)分1.23±0.19 6.86±1.89##3.27±1.13**4.07±1.26**4.52±1.27**4.67±1.39*

圖1 對(duì)子宮組織病理的影響（HE，×200）

3.2 對(duì)MPO活力的影響

各組大鼠子宮組織MPO活力數(shù)據(jù)如表2所示。與假手術(shù)組對(duì)比，模型組的MPO水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，地塞米松組和桂枝茯苓膠囊組（0.54 g·kg-1）的MPO水平均顯著下降（P＜0.01），桂枝茯苓膠囊組（0.27、0.14 g·kg-1）的MPO水平均顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果 提示桂枝茯苓膠囊可抑制LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎小鼠炎癥細(xì)胞過度浸潤。

表2 對(duì)MPO活力的影響（±s，n=10）

表2 對(duì)MPO活力的影響（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組地塞米松組桂枝茯苓膠囊組桂枝茯苓膠囊組桂枝茯苓膠囊組劑量--2.5 mg·kg-1 0.54 g·kg-1 0.27 g·kg-1 0.14 g·kg-1 MPO活力（U·g-1）0.25±0.02 0.78±0.05##0.38±0.04**0.42±0.03**0.48±0.04*0.52±0.05*

3.3 對(duì)子宮組織IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子的影響

各組IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子水平表3所示。與假手術(shù)組大鼠子宮組織因子相比較，模型組大鼠子宮組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.01）；與模型組大鼠子宮組織因子相比較，地塞米松組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低（P＜0.01），并且桂枝茯苓膠囊3個(gè)劑量組子宮組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平較模型組下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 對(duì)子宮組織IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子的影響（±s，n=10）

表3 對(duì)子宮組織IL-1β、IL-6、TNF-α細(xì)胞因子的影響（±s，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組地塞米松組桂枝茯苓膠囊組桂枝茯苓膠囊組桂枝茯苓膠囊組劑量--2.5 mg·kg-1 0.54 g·kg-1 0.27 g·kg-1 0.14 g·kg-1 IL-1β（pg·mL-1）51.42±6.17 161.26±20.29##83.22±8.68**98.32±10.59**104.25±12.62**110.71±12.86**IL-6（pg·mL-1）153.23±22.28 382.56±36.25##232.67±22.58**266.45±21.68**272.41±23.81**342.62±28.92*TNF-α（pg·mL-1）97.26±20.22 252.98±32.52##142.61±30.59**167.91±29.15**183.76±28.52**211.63±32.38*

3.4 對(duì)子宮組織中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38蛋白表達(dá)水平的影響

采用Western blot法檢測假手術(shù)組、模型組、地塞米松組、桂枝茯苓膠囊3個(gè)劑量組子宮組織中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖2、3所示：與假手術(shù)組比較，模型組NF-κB p65、IκBα、ERK、p38蛋白磷酸化水平顯著升（P＜0.01）；與模型組比較，桂枝茯苓膠囊各劑量組NF-κBp65、IκBα、ERK、p38蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。以上結(jié)果說明，桂枝茯苓膠囊能抑制子宮內(nèi)膜炎大鼠的子宮組織中NF-κB p65、IκBα、ERK、p38的蛋白表達(dá)。

圖2 對(duì)NF-κBp65、IκBα及其磷酸化蛋白水平的影響（±s，n=3）

圖3 對(duì)ERK、p38及其磷酸化蛋白水平的影響（±s，n=3）

4 討論

子宮內(nèi)膜炎常由細(xì)菌、病毒、真菌、支原體和其他感染引起[13]，該病如治療不徹底，常會(huì)引起慢性盆腔痛、輸卵管妊娠等并發(fā)癥，給患者的身心健康帶來嚴(yán)重危害[14]。中醫(yī)認(rèn)為血瘀是子宮內(nèi)膜炎主要病機(jī)，歸為“不孕”、“婦人腹痛”等范疇[15]。研究表明，約10%左右的女性不孕是由盆腔炎性疾病引起[16-17]。LPS是細(xì)菌細(xì)胞壁的成分之一，能誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子生成、組織水腫和損傷[18]。本研究采用宮腔注射LPS復(fù)制大鼠子宮內(nèi)膜炎模型，HE染色觀察到模型組大鼠子宮腺體上皮細(xì)胞排列紊亂、充血，子宮內(nèi)膜炎性細(xì)胞浸潤。桂枝茯苓膠囊組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)完整，只有輕微的子宮內(nèi)膜病變和少量的炎性細(xì)胞浸潤。結(jié)果 提示，桂枝茯苓膠囊對(duì)LPS引起的大鼠子宮內(nèi)膜炎具有抗炎作用。髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）作為組織中性粒細(xì)胞活性狀態(tài)的直接指標(biāo)[19]。研究表明MPO通過損傷宿主組織與多種炎癥性疾病相關(guān)[20]。本研究通過檢測MPO活性來評(píng)價(jià)桂枝茯苓膠囊對(duì)LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜炎大鼠的保護(hù)作用。結(jié)果 顯示，桂枝茯苓膠囊組MPO活性顯著降低，結(jié)果表明，桂枝茯苓膠囊對(duì)LPS誘導(dǎo)的MPO活性有明顯的抑制作用。

炎癥在子宮內(nèi)膜炎的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。LPS可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的釋放[21]。這些炎性細(xì)胞因子可導(dǎo)致子宮損傷子宮組織。因此，抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生可能是治療子宮內(nèi)膜炎的靶點(diǎn)。炎癥是宿主對(duì)細(xì)胞和組織功能障礙的基本防御反應(yīng)，主要表現(xiàn)為TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加[22]。在炎癥反應(yīng)過程中，TNF-α由調(diào)節(jié)基因誘導(dǎo)產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子，能夠促進(jìn)IL-1β、IL-6細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞粘附分子的釋放和表達(dá)[23]。在體內(nèi)，TNF-α能激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號(hào)通路，從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[24]。促炎細(xì)胞因子IL-1β是中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性炎癥過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[25]，研究表明過量的IL-1β炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)在子宮內(nèi)膜炎的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因?yàn)樗诿庖叻磻?yīng)中充當(dāng)“主”細(xì)胞因子[26]。IL-1β是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，其產(chǎn)生和分泌基于NF-κB的激活，在調(diào)節(jié)下游炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，參與多種炎癥性疾病過程[27]。IL-6是一種多效性細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程，包括炎癥、免疫反應(yīng)和急性期反應(yīng)的發(fā)展[28]。為了進(jìn)一步研究桂枝茯苓膠囊對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠子宮內(nèi)膜炎的治療作用，子宮組織中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平被檢測。研究結(jié)果表明，桂枝茯苓膠囊能夠顯著抑制子宮組織的TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥細(xì)胞因子水平。

為了進(jìn)一步研究桂枝茯苓膠囊如何減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)通過Western blot檢測NF-κB信號(hào)通路活性。NF-κB信號(hào)通路是一種重要的炎癥關(guān)聯(lián)途徑，它們可以通過介導(dǎo)下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)炎癥的發(fā)展[29]。NF-κB信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)介導(dǎo)炎癥的基因以及各種細(xì)胞因子，而且與許多炎癥疾病密切相關(guān)[30]。正常情況下，NF-κB定位于細(xì)胞質(zhì)上，并與其抑制劑IκB結(jié)合。當(dāng)受到各種誘導(dǎo)劑的刺激時(shí)，IκB被降解，NF-κB p65磷酸化后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6等靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)[31]。本研究Western blot分析結(jié)果顯示模型組大鼠IκBα、NF-κBp65磷酸化蛋白表達(dá)升高，表明NF-κB通路過度激活。桂枝茯苓膠囊組大鼠p-NF-κB p65及p-IκBα表達(dá)較模型組明顯降低，表明桂枝茯苓膠囊可明顯抑制NF-κB通路活性。結(jié)果 提示，桂枝茯苓膠囊通過調(diào)控LPS誘導(dǎo)的大鼠子宮內(nèi)膜炎NF-κB信號(hào)通路蛋白的表達(dá)，對(duì)大鼠炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。

MAPK是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的另一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的水平[32]。MAPKs是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，包括ERK、JNK和p38。MAPKs可以通過外部信號(hào)和激活誘導(dǎo)下游炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，該通路的激活可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的生成而加劇炎癥反應(yīng)[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)子宮腔注射LPS模型組大鼠p38和ERK的磷酸化水平增加，桂枝茯苓膠囊顯著抑制p38和ERK蛋白的磷酸化。研究結(jié)果提示桂枝茯苓膠囊可能通過抑制MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，研究結(jié)果表明桂枝茯苓膠囊通過阻斷NF-κB和MAPK信號(hào)傳導(dǎo)，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，從而減輕子宮內(nèi)膜損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了桂枝茯苓膠囊多靶點(diǎn)、多途徑防治婦科疾病作用特性。但桂枝茯苓膠囊成分復(fù)雜，而且細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相互間存在交叉作用，因此后續(xù)將進(jìn)一步研究桂枝茯苓膠囊防治盆腔炎的活性成分以及對(duì)上述炎性細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)交匯的作用。