健脾合劑對腹瀉型腸易激綜合癥大鼠結(jié)腸miRNA表達譜的影響*

王萌，吳婷婷，丁姮月，梁國強，3，楊欣，張培培，孫宏文**

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 蘇州 215009；2.蘇州科技城醫(yī)院 蘇州 215153；3.蘇州市吳門醫(yī)派研究院 蘇州 215009）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種與心理、社會、環(huán)境因素有密切關(guān)系的軀體疾病[1]。我國IBS患病率為1.4%-11.5%并有增高趨勢，其癥狀主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性的腹痛、腹脹或腹部不適，與排便相關(guān)或伴隨排便習(xí)慣改變[2]。IBS雖預(yù)后尚可，但其病程遷延不愈，常伴有焦慮、抑郁、神經(jīng)質(zhì)等心理異常情況，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前治療IBS的藥物種類很多，包括解痙劑、止瀉劑、腸道不吸收的抗生素、益生菌、神經(jīng)遞質(zhì)藥物等，但療效并不理想[3]。因此，探討IBS的發(fā)病機制，尋找有效的干預(yù)方法，具有重要的臨床意義。

中醫(yī)藥在IBS的治療中越來越受到重視。根據(jù)IBS的臨床表現(xiàn)將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“泄瀉”、“便秘”、“腹痛”等病范疇[4]。全國著名脾胃病專家黃一峰先生在長期臨床工作中總結(jié)經(jīng)驗，在四君子湯基礎(chǔ)上加用陳皮、山藥等藥物組成健脾合劑，該方臨床應(yīng)用近30年，療效確切。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)健脾合劑可以改善IBS-D患者腹痛、腹脹、腹瀉等癥狀，緩解倦怠乏力、神疲懶言等脾虛表現(xiàn)，提高有益菌布勞特士菌屬（Blautia）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、糞球菌（Coprococcus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）水平[5]。

中醫(yī)藥是系統(tǒng)性強、整體性強的多靶點協(xié)同作用，健脾合劑治療IBS-D也是多方面、多角度的。因此，本研究擬借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因測序技術(shù)（RNAsequencing，RNA-seq），分析出細胞中所有基因的表達量及差異情況，探索健脾合劑治療IBS-D的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，尋找其治療靶點，為后續(xù)研究健脾合劑治療IBS-D的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠28只，體質(zhì)量（200±20）g，由蘇州希諾賽生物科技有限公司提供，許可證號：2021倫動批070，飼養(yǎng)于蘇州市中醫(yī)醫(yī)院研究所動物實驗室，12 h光照/黑暗循環(huán)，室溫控制在20-24℃，相對濕度45%-70%，分籠、自由飲用水飼養(yǎng)。

1.2 藥物、試劑

健脾合劑：藥物組成：黨參5 g、炒白術(shù)5 g、茯苓5 g、炙甘草3 g、炒陳皮5 g、炒山藥5 g，所有飲片由蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司提供，符合2020年《中國藥典》規(guī)范，批號分別為200117，200410，200617，200108，211021015，210827015；番瀉葉（蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司，批號：170909）；戊巴比妥鈉（美國sigma公司，批號：20089104）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司，批號1596026）；無水乙醇（國藥集團，批號：100092680）；多聚甲醛組織固定液（北京蘭杰柯科技有限公司，批號：70081800）。

1.3 儀器

NanoDrop-2000分光光度計（美國賽默飛世爾科技）、Agilent 2100生物分析儀（美國Agilent公司）、Illumina Novaseq 6000基因DNA測序儀（美國Illumina公司）、mini protean 3 cell電泳儀（Bio-Rad公司）；Sorvall ST 40型離心機（美國賽默飛公司）、JB-P5型石蠟包埋機（武漢俊杰電子有限公司）、RM2016型石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）。

2 方法

2.1 健脾合劑的制備

取健脾合劑一劑共28 g生藥，將藥物浸泡30 min，按常規(guī)中草藥煎煮方法，煎煮提取2次，過濾后合并提取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（真空壓力、溫度80℃）中濃縮得1 g·mL-1的中藥原液，冷卻分裝后置于4℃冰箱保存。健脾合劑所選濃度為前期研究篩選出的療效較好濃度,按人與大鼠體表面積計算得出給藥劑量為7.56 g·kg-1。

2.2 造模、分組及處理

28只大鼠標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)3天適應(yīng)實驗環(huán)境，隨機選取10只大鼠作為空白組。其余18只大鼠使用急-慢應(yīng)激法聯(lián)合番瀉葉灌胃法建立IBS-D模型。急-慢應(yīng)激法[6]：包括以下刺激：12 h夜間持續(xù)照明，5 min悶熱環(huán)境（45℃）；24 h禁水，3 min寒冷環(huán)境（4℃）；1 min夾尾；40 min水平震動（120次·min-1）；24 h禁食。每周按隨機順序給予大鼠上述刺激，每連續(xù)2天不能重復(fù)相同的刺激順序，以免大鼠提前預(yù)知，連續(xù)刺激3周后休息1周，并在第4周最后1天，給予紙帶束縛大鼠1 h。從第23天開始進行番瀉葉灌胃（取番瀉葉飲片2000 g，浸泡30 min后用蒸餾水煎煮提取2次，過濾后合并提取液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮得1 g·mL-1的中藥原液，冷卻分裝后置于4℃冰箱，灌胃時水浴法加熱藥液至25℃，以10 mL·kg-1灌胃給予18只大鼠），每天2次，連續(xù)5天，制定IBS-D模型。造模第28天隨機選取正常對照組2只和模型組2只大鼠，處死后采集結(jié)腸黏膜，并對黏膜進行HE染色，觀察結(jié)腸組織表面層是否完整、有無潰瘍、杯狀細胞形態(tài)及數(shù)量變化、水腫及炎性細胞浸潤等情況，判斷造模是否成功。造模成功后，將大鼠隨機分為空白組、模型組及中藥組，每組8只。空白組和模型組按10 mL·kg-1生理鹽水灌胃，中藥組以健脾合劑（10 mL·kg-1）灌胃。造模成功當(dāng)天開始給藥，以蒸餾水稀釋健脾合劑，加熱至25℃進行灌胃，每日給藥1次，持續(xù)給藥14天。每日觀察大鼠的一般情況，包括活動、飲食、毛色以及糞便情況，給藥第1天和第14天分別記錄大鼠的體重，收集大鼠糞便進行Bristol糞便積分，并依據(jù)大便性狀記為1-7分[7]。

2.3 HE染色

各組末次給藥后，禁食不禁水24 h，稱重后按50 mg·kg-1注射戊巴比妥鈉麻醉后斷頸法處死大鼠，迅速剖腹，肛緣處向上取4-8 cm結(jié)腸組織，并沿腸系膜縱軸切開，用蒸餾水沖洗干凈，4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織，乙醇逐步脫水，石蠟包埋切片后，60℃烘箱過夜烤片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下對結(jié)腸組織進行觀察。

2.4 RNA提取和RNA定量

取大鼠結(jié)腸組織，使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I，DNase I，TaKaRa公司）去除基因組DNA。在1%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測RNA降解和污染。使用NanoDrop-2000分光光度計測量RNA濃度。最后，使用Agilent 2100 生物分析儀評估RNA完整性。僅使用高質(zhì)量的RNA樣本（OD260/280=1.8-2.2，OD260/230≥2.0，RI N≥728 S:18 S≥1.0，＞3 μg）構(gòu)建測序文庫。

2.5 miRNA測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及比對分析

從總RNA中電泳切膠得到small RNA，分別連接5’接頭和3’接頭，用接頭引物進行反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），構(gòu)建小RNA文庫。用Illumina Novaseq 6000基因DNA測序儀進行測序，測序部分交由上海美吉公司完成；對原始測序數(shù)據(jù)進行測序相關(guān)質(zhì)量評估；將質(zhì)控后的數(shù)據(jù)，即clean data（reads）與參考基因組進行比對，參考基因來源：Rattus_norvegicus，參考基因組版本：Rnor_6.0，參考基因組來源：http://asia.ensembl.org/Rattus_norvegicus/Info/Index，比對到的reads數(shù)從9952451到17785312不等。

2.6 表達量及表達差異分析

使用miRDeep軟件統(tǒng)計miRNA表達量，基于表達定量結(jié)果，使用DESeq2軟件進行組間差異基因分析，獲得發(fā)生差異表達的基因，篩選閾值為：差異倍數(shù)fold change（|log2FC|）＞1且顯著性水平P（Padjust）≤0.05。

2.7 miRNA靶基因分析

采用軟件Goatools對靶基因集中的基因進行GO富集分析，從而獲得該基因集中的基因主要具有哪些GO功能。使用方法為Fisher精確檢驗，當(dāng)P＜0.05時，認為此GO功能存在顯著富集情況。采用R腳本對靶基因集中的基因進行KEGG通路富集分析，當(dāng)P＜0.05時，認為此KEGG通路功能存在顯著富集情況，按富集程度篩選排名前20的目標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

造模前，所有大鼠精神良好，活潑好動，毛色光亮，飲食正常，大便干稀適中；造模開始后，模型大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，活動減少，毛色枯燥，飲食減少，大便稀溏，甚至呈水樣，伴見體重下降，初步提示造模成功；給藥后，中藥組大鼠體重逐漸上升，精神、活動好轉(zhuǎn)，毛色恢復(fù)光亮，大便轉(zhuǎn)干。如圖1表示，給藥第1天，模型組與中藥組大鼠體重明顯低于空白組（P＜0.01）；給藥第14天，中藥組體重較模型組明顯增加（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠體重比較（n=8）

3.2 大鼠糞便Bristol評分

造模后，模型大鼠糞便Bristol評分顯著上升（P＜0.01）；給藥14天后，模型組糞便積分仍較高，糞質(zhì)稀薄呈水樣，中藥組較之明顯好轉(zhuǎn)，Bristol評分顯著下降（P＜0.01），具體見圖2。

圖2 各組大鼠糞便Bristol評分比較（n=8）

3.3 病理結(jié)果

大鼠結(jié)腸HE染色結(jié)果顯示，空白組大鼠黏膜上皮完整，固有層腺體排列整齊規(guī)則，間質(zhì)無明顯淋巴細胞浸潤；模型組見黏膜上皮輕度破損及水腫，上皮細胞排列不整，周圍少許炎性細胞浸潤；中藥組與模型組相比較，上皮破損及水腫減輕，上述情況得到有效改善，見圖3。

圖3 大鼠結(jié)腸組織病理組織學(xué)觀察（HE染色，×100，×200）

3.4 miRNA差異表達基因篩選

RNA-seq測序結(jié)果表明（圖4A-4C），空白組與模型組相比，差異表達的miRNA共109個，其中80個上調(diào)，29個下調(diào)；模型組與中藥組相比，差異表達的miRNA共109個，其中19個上調(diào)，90個下調(diào)。通過韋恩圖將兩次比較結(jié)果進行比對，共有81個miRNA相同，見圖4D；在模型組與空白組比較中下調(diào)、中藥組與模型組比較中上調(diào)的有7個；在模型組與空白組比較中上調(diào)、中藥組與模型組比較中下調(diào)的有74個，具體見表1。

表1 大鼠結(jié)腸組織顯著差異表達miRNA

續(xù)表

圖4 組間有統(tǒng)計學(xué)差異的miRNA

3.5 差異miRNA靶基因GO功能富集分析

對受健脾合劑調(diào)控差異表達miRNA的靶基因進行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，差異表達的miRNA靶基因所涉及的功能及過程主要集中在囊泡定位、髓鞘形成、突觸囊泡轉(zhuǎn)運、細胞器膜融合、發(fā)育性生長負調(diào)控等生理過程。具體見圖5、圖6。

圖5 GO富集分析（空白組VS模型組）

圖6 GO富集分析（模型組VS中藥組）

3.6 差異miRNA靶基因KEGG富集分析

對受健脾合劑調(diào)控差異表達miRNA的靶基因進行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，差異表達的基因主要富集在MAPK、Hippo、Wnt、Toll-like receptor等信號通路，見圖7、圖8。

圖7 KEGG富集分析（空白組VS模型組）

圖8 KEGG富集分析（模型組VS中藥組）

4 討論

腸易激綜合癥的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，目前尚無定論，一般認為，內(nèi)臟高敏和胃腸動力異常是其基本的病理生理特點[8]。本實驗采用急-慢應(yīng)激法聯(lián)合番瀉葉灌胃的復(fù)合造模方法構(gòu)建大鼠IBS-D模型。急-慢應(yīng)激法通過給予大鼠隨機反復(fù)多因素刺激，從腦-腸-軸角度改變大鼠內(nèi)臟敏感性[6]；番瀉葉短期灌胃可以造成大鼠功能性腹瀉狀態(tài)[9]。在本實驗中，前期急-慢應(yīng)急法刺激下的模型大鼠逐漸活動減少、情緒激動易激惹、毛發(fā)枯燥無光澤、大便稀爛、體重下降，加用番瀉葉灌胃后，體重進一步下降，Bristol糞便積分顯著上升，解剖取大鼠結(jié)腸組織進行觀察，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織未見出血糜爛、水腫潰瘍等明顯器質(zhì)性病變，HE染色見有少量炎性細胞浸潤，基本符合腹瀉型腸易激的臨床癥狀和鏡下特征，證明該造模方法可以成功模擬IBSD患者的基本特征，且持久穩(wěn)定、可重復(fù)性好，值得推廣應(yīng)用。

中醫(yī)根據(jù)IBS-D腹痛腹瀉的基本特征，一般將其歸屬于“泄瀉”范疇，并認為脾虛濕盛貫穿于IBS-D全過程，是其發(fā)病的總病機[4]。感受外邪、飲食不節(jié)、勞倦體虛、七情內(nèi)傷等各種病因?qū)е缕⑽柑撊?，運化功能失常，脾失健運，濕濁阻于大腸而發(fā)為泄瀉，故治療上以健脾化濕為主。健脾合劑包括黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、山藥和陳皮六味藥。方中黨參補脾養(yǎng)胃，健運中氣。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黨參可以抑制胃腸道平滑肌痙攣，通過增加前列腺素含量保護消化道黏膜[10]。白術(shù)益氣健脾，燥濕利水。白術(shù)多糖可以調(diào)節(jié)脾虛型大鼠腸道菌群失衡，白術(shù)內(nèi)脂可以有效降低促炎因子腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6水平，發(fā)揮抗炎作用[11]。茯苓滲濕利水，健脾寧心。研究表明茯苓通過抑制腸粘膜內(nèi)皮細胞一氧化碳、內(nèi)皮素-1及血栓素A2的分泌，改善腸道微循環(huán)，修復(fù)腸粘膜屏障[12]。炙甘草益氣和中，調(diào)和陰陽。甘草苷有明顯的抗抑郁、抗炎作用[13]。山藥補脾養(yǎng)胃生津，山藥多糖可以抑制小鼠胃和小腸排空功能[14]。陳皮理氣健脾，燥濕化痰，具有雙向調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌的作用[15]。綜上所述，健脾合劑具有益氣健脾，滲濕止瀉功效，是治療IBS-D的良方。

轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，其中主要包括miRNA等。miRNA是一類長度約為20-24個核苷酸的小RNA，其在細胞內(nèi)的調(diào)節(jié)具有多樣性，廣泛參與機體各項生理病理過程及信號通路的激活與抑制。本實驗對空白組、模型組、中藥組大鼠結(jié)腸組織進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，在空白組與模型組、模型組與中藥組各組間差異表達的miRNA共有109個，兩組比較結(jié)果互相比對則發(fā)現(xiàn)其中有81個miRNA是相同的,包括miRNA-665、miRNA-132-5p、miRNA-132-3p、miRNA-21-3p、miR-146a-5p等。miRNA-665在模型組中上調(diào)，在中藥組中則表現(xiàn)為下調(diào)，而研究發(fā)現(xiàn)miRNA-665參與結(jié)腸細胞的凋亡[16]，說明健脾合劑可以通過抑制miRNA-665的表達，減少細胞凋亡，保持腸粘膜完整性；Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-132通過負調(diào)節(jié)FOXO3a促進炎癥細胞因子的表達，本實驗中，miRNA-132-5p、miRNA-132-3p在模型組顯著上調(diào)，在中藥組顯著下調(diào)，說明健脾合劑通過抑制miRNA-132-5p、miRNA-132-3p的表達發(fā)揮抗炎作用；同時，本實驗中miRNA-21-3p也在中藥組中呈現(xiàn)低表達，該miRNA也與腸道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[18]；與之相反的則是miRNA-146a-5p，其在模型組中顯著下調(diào)，在中藥組中顯著上調(diào)，miR-146可以改善腸上皮屏障功能[19]，提示健脾合劑通過促進miRNA-146a-5p的表達從而發(fā)揮修復(fù)腸粘膜屏障功能的作用。

差異表達miRNA的靶基因GO功能富集和KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，健脾合劑參與多種生物過程包括生物調(diào)節(jié)、細胞代謝，參與多種分子功能及細胞組分，更參與了機體多條生命活動的重要通路，包括MAPK、Wnt、Hippo等信號通路。MAPK信號通路參與細胞增殖與分化、免疫反應(yīng)等一系列生理、病理過程，它能從增加內(nèi)臟高敏性、激活異常免疫調(diào)控等方面導(dǎo)致IBS-D的發(fā)病[20-21]。Hippo信號通路參與細胞再生與腸粘膜修復(fù)過程，并在維持腸上皮細胞間連接方面也有積極影響[22]。Wnt信號通路參與調(diào)控腸隱窩干細胞的分化過程，其在維持腸道干細胞穩(wěn)態(tài)和修復(fù)損傷方面有重要作用[23-24]。在本實驗中，miRNA-337-5p、miRNA-495、miRNA-126b、miRNA-299b-5p、miRNA-299a-5p等在模型組顯著上調(diào)，在中藥組顯著下調(diào)，而這些miRNA與MAPK相關(guān)通路的激活有關(guān)[25-27]；miRNA-31a-5p在模型組顯著下調(diào)，在中藥組則表現(xiàn)為上調(diào)，此基因可以激活Hippo、Wnt信號通路[28]。由此可見，健脾合劑可以通過抑制MAPK信號通路的活性，上調(diào)Hippo、Wnt信號通路的表達，降低內(nèi)臟敏感性，維持腸道干細胞穩(wěn)態(tài)，修復(fù)腸粘膜屏障，最終達到治療IBS-D的效果。

綜上所述，健脾合劑能夠調(diào)節(jié)相關(guān)miRNA的表達，通過調(diào)控MAPK、Hippo、Wnt等信號通路發(fā)揮干預(yù)腹瀉型腸易激綜合癥的作用。但其對上述基因、信號通路的影響仍需應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）等方法進行下一步研究與驗證。本研究從轉(zhuǎn)錄因子的角度為健脾合劑治療腹瀉型腸易激綜合癥的作用機制提供了線索與思路，為健脾合劑的下一步基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)。