2型糖尿病陰虛證小鼠模型生物節(jié)律變化及六味地黃湯對(duì)其影響*

任威銘，戰(zhàn)麗彬，崔榮興，孫曉霞，翁澤斌

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 南京 210023；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥創(chuàng)新工程技術(shù)中心 沈陽(yáng) 110847）

糖尿病是全球高發(fā)慢性代謝性疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)2020年糖尿病患病率的統(tǒng)計(jì)約為11.2%，2型糖尿?。═ype 2 diabetes，T2DM）占90%以上[1]，因其逐漸累及全身多個(gè)組織器官，需要終身治療，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。

2型糖尿病患者多出現(xiàn)“多食、多飲、多尿、消瘦”的三多一少臨床癥狀，故中醫(yī)多將其歸于“消渴病”范疇，陰虛證是其主要基本證。2021年《2型糖尿病病證結(jié)合診療指南》將2型糖尿病中期統(tǒng)一辨為“氣陰兩虛證”，晚期分肝陰虛證、陰陽(yáng)兩虛證，多種證型與陰虛密切相關(guān)[2]。2型糖尿病陰虛證臨床表現(xiàn)多見(jiàn)有舌紅少苔、五心煩熱、盜汗、午后潮熱、脈細(xì)數(shù)等癥狀。陰虛潮熱的發(fā)作時(shí)間呈午后或夜半加重趨勢(shì)，清·汪必昌《醫(yī)階辨證·陰分潮熱三證辨》中提及“陰虛潮熱，午后潮夜半止，其熱下體甚”[3]。這種體溫改變隨時(shí)間而紊亂的表現(xiàn)提示了陰虛證癥狀的產(chǎn)生可能與機(jī)體生物節(jié)律紊亂有關(guān)。

生物節(jié)律指生物在生理、行為等方面反復(fù)出現(xiàn)的周期性特征。生物鐘是生物適應(yīng)外界環(huán)境規(guī)律性變化的一種內(nèi)在機(jī)制，其調(diào)節(jié)中樞位于下丘腦的視交叉上核SCN區(qū)域[4]，通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)外周組織，使機(jī)體各組織時(shí)鐘趨于一致。人體的節(jié)律周期約為24 h，其核心反饋環(huán)路由芳烴受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類似蛋白1（Brain and muscle arnt-like protein-1，Bmal1）、時(shí)鐘基因（Circadian locomotor output cycles kaput，Clock）、周期蛋白（Period circadian clock，Per）、隱花色素（Cryptochrome，Cry）所組成，調(diào)控大部分生命活動(dòng)過(guò)程[5]。研究表明，2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展與生物節(jié)律紊亂密切相關(guān)[6]，主要表現(xiàn)在血糖、血壓、激素分泌等多種方面，同時(shí)機(jī)體體溫晝夜節(jié)律紊亂，基礎(chǔ)體溫升高，晝夜體溫差值減小[7]。這種糖尿病的生物節(jié)律紊亂和陰虛證潮熱體溫變化異常是否有關(guān)還需進(jìn)一步探討。為此，我們通過(guò)建立2型糖尿病陰虛證模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)模型體溫變化，結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，以探討生物節(jié)律在2型糖尿病陰虛證“潮熱”癥狀的變化情況及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

在本研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（Guide for the Care and Use of laboratory Animals）原則進(jìn)行，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)201910A033）。采用南京君科生物工程有限公司提供的SPF級(jí)別8周齡雄性db/db小鼠99只，體質(zhì)量為40-50 g及其同窩野生對(duì)照型小鼠21只，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)特定的無(wú)病原體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫（24±2℃）、恒濕（65%±5%）、12 h明/暗循環(huán)（7：00-19：00）。動(dòng)物喂食60Co輻照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物維持飼料?？梢宰杂扇∮檬澄锖透邏簻缇?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

傷陰藥和六味地黃湯所用飲片均購(gòu)自南通三越中藥飲片有限公司（中國(guó)南通）。傷陰藥組成為黑順片（批號(hào)：190425）、肉桂（批號(hào)：190509）、制吳茱萸（批號(hào)：190514），黑順片、肉桂、制吳茱萸按照1:1:1的比例配制。藥材提前浸泡30 min，將黑順片先煎煮沸30 min。加入浸泡過(guò)的肉桂與制吳茱萸的混合液，混合后大火煮沸，轉(zhuǎn)小火再煎煮1 h，倒出藥液。水煎2次，混合后濃縮得到傷陰藥濃度1 g·mL-1，4℃保存。

六味地黃湯選用熟地黃（批號(hào)：190817）、酒萸肉（批號(hào)：190829）、山藥（批號(hào)：190109）、澤瀉（批號(hào)：190718）、牡丹皮（批號(hào)：190723）、茯苓（批號(hào)：190217），根據(jù)中國(guó)藥典（中國(guó)藥典委員會(huì)，2015）的方法制備。藥材浸入8倍冷水中30 min后大火煮沸轉(zhuǎn)小火煎煮30 min。水煎2次?；旌虾鬂饪s最終生藥含量為5.63 g·kg-1為低劑量，11.26 g·kg-1為中劑量，22.52 g·kg-1為高劑量，4℃保存。

1.3 主要試劑和儀器

Bmal1抗體（Santa cruz，sc-365645）；Clock（Santa cruz，sc-271603）；Per1（ABclonal，A8449）；Per2（ABclonal，A5107）；Per3（Abcam，Ab177482）；Cry1（ABclonal，A6890）；Cry2（Proteintech，13997-1-AP）；β-Actin（CST，3700S）；羊抗小鼠IgG（Boster，BA1050）；羊抗兔IgG（Boster，BA1054）。紅外測(cè)溫儀（CEM，中國(guó)，DT-8838）；呼吸麻醉儀（Gene&I，中國(guó)，AMS）；動(dòng)物手術(shù)冷光源（AS ONE，日本，GR-60W）；電子調(diào)溫電熱套（泰斯特，中國(guó)，98-1-B）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Eyela，日本，N3010）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q，美國(guó)Integral S）；磁力攪拌儀（IKA，德國(guó)RCT Digital）；小型臺(tái)式高速離心機(jī)（Thermo，美國(guó)Heraeus Fresco-21）；十二通道組織均質(zhì)儀（QIAGEN，美國(guó)Tissuelyser LT）；垂直電泳槽（Bio-Rad，美國(guó)PowerPac Basic）；超微量分光光度計(jì)（ThermoFisher，美國(guó)ND-ONE-W）；超靈敏多功能成像儀（GE，美國(guó)AI600）。

1.4 分組及造模方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，測(cè)量體質(zhì)量和空腹血糖，選取空腹血糖≥16.7 mmol·L-1的2型糖尿病小鼠。將同窩野生對(duì)照小鼠分為正常對(duì)照組（C組）9只、陰虛證組（Y組）12只；2型糖尿病小鼠分為2型糖尿病組（D組）12只、2型糖尿病陰虛證組（DY組）11只、糖尿病六味地黃湯低劑量組（DL組）12只、糖尿病六味地黃湯中劑量組（DM組）12只、糖尿病六味地黃湯高劑量組（DH組）12只、糖尿病陰虛證六味地黃湯低劑量組（DYL組）14只、糖尿病陰虛證六味地黃湯中劑量組（DYM組）13只、糖尿病陰虛證六味地黃湯高劑量組（DYH組）13只。

采用“熱盛傷陰”的造模方法，予陰虛證造模組別（Y組、DY組、DYL組、DYM組、DYH組）每天予小鼠0.1 mL·10 g-1的傷陰藥藥液體積灌胃；正常對(duì)照組（C組）、2型糖尿病小鼠（D組、DL組、DM組、DH組）每只小鼠每天予以同體積超純水灌胃，造模時(shí)間連續(xù)8周。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陰虛證造模于第4周完成，造模成功后小鼠表現(xiàn)為口干（飲水量增加、唾液流率增加）、大便干燥（糞便含水量減低）、皮膚干燥（皮膚含水量減低）、虛性亢奮（活動(dòng)度與易激惹程度增加）等表現(xiàn)。糖尿病小鼠選用db/db自發(fā)性糖尿病小鼠，隨著年齡增長(zhǎng)，會(huì)逐漸自發(fā)表現(xiàn)出2型糖尿病特征。從第4周開(kāi)始，六味地黃湯給藥組（DYL組、DYM組、DYH組、DL組、DM組、DH組）于每天16：00予以每只小鼠0.1 mL·10 g-1的藥液體積予以灌胃，正常對(duì)照組和2型糖尿病組每只小鼠同時(shí)予以相同體積超純水灌胃，給藥時(shí)間連續(xù)4周。

1.5 標(biāo)本采集

晚上禁食12 h后，用異氟烷麻醉小鼠后安樂(lè)死，迅速收集下丘腦、肝臟組織，在液氮快速冷凍，以備后續(xù)分析。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 體溫檢測(cè)

使用非接觸紅外測(cè)溫儀檢測(cè)小鼠肛溫、心前區(qū)溫度、四肢爪心溫度。將儀器測(cè)溫探頭對(duì)準(zhǔn)檢測(cè)部位正中，距離1-2 cm，每周1次，測(cè)量時(shí)間分別為8：30、15：00、20：00。以評(píng)價(jià)小鼠體溫節(jié)律。

1.6.2 小鼠下丘腦和肝臟生物節(jié)律蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot技術(shù)檢測(cè)。提取小鼠下丘腦和肝臟組織總蛋白，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，按照1：1000加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日TBST充分洗膜，加入二抗（1:2000），TBST充分洗膜，ECL發(fā)光顯影后分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Graphpad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法為單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體溫波動(dòng)情況

從第5周開(kāi)始，C組肛溫出現(xiàn)規(guī)律性的8：30降低、15：00升高、20：00降低的波動(dòng)趨勢(shì)；Y組肛溫普遍高于其余各組；D組則節(jié)律紊亂，肛溫趨于平穩(wěn)，有規(guī)律的溫度波動(dòng)消失；DY組肛溫高于D組，并表現(xiàn)出了不同于C組的節(jié)律波動(dòng)，雖然顯示出午后升高的趨勢(shì)，但波動(dòng)趨勢(shì)較正常組平穩(wěn)；給予六味地黃湯干預(yù)后，2型糖尿病模型未表現(xiàn)有明顯規(guī)律性體溫波動(dòng)變化；而DYH組顯示出對(duì)肛溫節(jié)律的恢復(fù)作用，從第5周開(kāi)始給藥后，高劑量組顯示出“低、高、低”的規(guī)律波動(dòng)，這種波動(dòng)幅度大于DY組的波動(dòng)幅度，可能是2型糖尿病小鼠正常節(jié)律恢復(fù)的表現(xiàn)（圖1A）。心前區(qū)溫度未見(jiàn)節(jié)律波動(dòng)（圖1B）。雙上肢溫度可見(jiàn)，C組在各實(shí)驗(yàn)周均出現(xiàn)規(guī)律性的8：30降低、15：00升高、20：00降低的較明顯的波動(dòng)；Y組晝夜體溫變化幅度較大，但未顯規(guī)律性波動(dòng)；D組則節(jié)律紊亂，有規(guī)律的溫度波動(dòng)消失；DY組可見(jiàn)自第6周開(kāi)始，上肢溫度出現(xiàn)規(guī)律的節(jié)律波動(dòng)，顯示出8：30和20：00較低，15：00升高的趨勢(shì)；給予六味地黃湯后，DYH組結(jié)果也顯示出上肢溫度8：30降低、15：00升高、20：00降低的節(jié)律變化規(guī)律（圖1C）。雙下肢溫度可見(jiàn)，C組第1、3、4周外，其他實(shí)驗(yàn)周均出現(xiàn)規(guī)律性的8：30降低、15：00升高、20：00降低的波動(dòng)規(guī)律；D組則節(jié)律紊亂，有規(guī)律的溫度波動(dòng)消失；六味地黃湯干預(yù)后，DYH組表現(xiàn)出與上肢相似的變化規(guī)律（圖1D）。六味地黃湯干預(yù)后，以方測(cè)證，高劑量組能夠進(jìn)一步恢復(fù)肛溫、雙上肢爪心溫度和雙下肢爪心溫度節(jié)律，因此在后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)中，選擇高劑量組為最佳劑量進(jìn)行分子表達(dá)的驗(yàn)證（圖1）。

圖1 各組小鼠不同部位溫度節(jié)律變化

通過(guò)對(duì)各組體溫波動(dòng)變化的分析發(fā)現(xiàn)，C組、Y組、DY組及六味地黃湯干預(yù)后體溫都存在一定的節(jié)律性表現(xiàn)，為了進(jìn)一步區(qū)別節(jié)律變化的差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)第8周的各部位體溫進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8：30時(shí)，Y小鼠肛溫低于C組（P＜0.001），但在15：00時(shí)，Y證平均肛溫最高（P＜0.001），至20：00，Y組體溫下降，可見(jiàn)Y組的體溫波動(dòng)明顯大于C組波動(dòng)，下午的體溫升高于個(gè)體而言更加明顯，雖然仍在正常體溫范圍內(nèi)，但會(huì)導(dǎo)致自覺(jué)發(fā)熱的情況出現(xiàn)。D組肛溫始終明顯低于正常小鼠的肛溫（P＜0.01），DY組呈現(xiàn)出比D組升高的趨勢(shì)，六味地黃湯干預(yù)后，DYH組相對(duì)平穩(wěn)，低-高-低的變化趨勢(shì)存在，但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2A）。各組小鼠心前區(qū)溫度在8：00時(shí)未表現(xiàn)明顯差異；至15：00時(shí)，Y組、D組、DY證組較正常組心前區(qū)溫度升高（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01），20：00時(shí)，DYH組較DY組心前區(qū)溫度明顯下降（P＜0.05，圖2B）。各組小鼠四肢爪心溫度變化可見(jiàn)，Y組始終高于C組，但在晨間和晚間尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，午后則差異明顯（P＜0.001，圖2C-2D）；DY組較D組變化趨勢(shì)相似（圖2C-2D）；相較于D組，六味地黃湯的干預(yù)沒(méi)有規(guī)律的變化趨勢(shì)，但是DYH較DY組則在15:00體現(xiàn)出了明顯的回調(diào)（P＜0.01，圖2C-2D）。說(shuō)明六味地黃湯在調(diào)節(jié)2型糖尿病陰虛證的體溫節(jié)律紊亂中效果更明顯，而對(duì)2型糖尿病非陰虛證療效不明，以方測(cè)證，進(jìn)一步說(shuō)明了陰虛證狀態(tài)下體溫變化存在異常。

圖2 各組小鼠第8周體溫波動(dòng)情況

綜上可見(jiàn)，正常小鼠存在體溫規(guī)律性波動(dòng)，但幅度相對(duì)穩(wěn)定，陰虛證狀態(tài)下，15：00時(shí)，體溫會(huì)出現(xiàn)顯著上升，這可能是陰虛證個(gè)體自覺(jué)午后發(fā)熱的原因。2型糖尿病的個(gè)體基礎(chǔ)體溫較正常個(gè)體偏低，而2型糖尿病陰虛證狀態(tài)下會(huì)表現(xiàn)出上升趨勢(shì)。六味地黃湯是治療2型糖尿病陰虛證的經(jīng)典方劑，在經(jīng)過(guò)其干預(yù)后，非陰虛證組體溫波動(dòng)未體現(xiàn)出明顯規(guī)律，但陰虛證組回調(diào)明顯，體溫波動(dòng)趨勢(shì)以及四肢爪心發(fā)熱的變化趨勢(shì)與正常組更相似，相對(duì)于陰虛證組大幅度的體溫波動(dòng)有好轉(zhuǎn)表現(xiàn)。

2.2 下丘腦生物節(jié)律蛋白表達(dá)情況

下丘腦中，D組Clock蛋白表達(dá)較C組顯著性降低（P＜0.05），DY組Bmal1和Clock較D組表達(dá)具有升高趨勢(shì)。在給藥組中，DH組Clock較2型糖尿病組顯著性升高（P＜0.05）。周期蛋白Per2在D組中較C組表達(dá)顯著性降低（P＜0.001），而在D組中顯著性升高（P＜0.0001）；給予六味地黃湯后，DH組較D組表達(dá)有上升趨勢(shì)，DYH組給藥后表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。而Per1和Per3在所有組中未見(jiàn)明顯改變。Cry是由Bmal1和Clock結(jié)合后促使Cry mRNA轉(zhuǎn)錄，在胞外翻譯為蛋白，再進(jìn)入核內(nèi)抑制Bmal1和Clock的合成，同時(shí)也能通過(guò)蛋白酶體降解以保持周期性。在本研究中，D組和DY組的Cry2表達(dá)較C組均顯著降低（P＜0.05），DH組的Cry1和Cry2較D組表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）（圖3）。

圖3 下丘腦生物鐘蛋白變化（n=3）

2.3 肝臟生物鐘蛋白表達(dá)情況

在肝臟中，D組Bmal1和Clock較正常對(duì)照組下降，而DY組較D組表達(dá)增加，表明2型糖尿病存在生物節(jié)律蛋白表達(dá)下降，而傷陰藥可能通過(guò)過(guò)表達(dá)Bmal1和Clock影響生物鐘分子機(jī)制（圖4）。D組Per3蛋白表達(dá)較C顯著性降低（P＜0.05），DY組較D組顯著性升高（P＜0.001），表明在該模型中，傷陰藥可能通過(guò)上調(diào)Bmal1和Clock的蛋白表達(dá)，促進(jìn)Per3的表達(dá)增加，與下丘腦不同。Per1和Per2在各組間無(wú)顯著性差異。D小鼠的Cry1表達(dá)較C組顯著性降低（P＜0.05），DY組較D組的Cry1表達(dá)顯著性升高（P＜0.05）。Cry2表達(dá)在各組間無(wú)顯著性差異。

圖4 肝臟生物鐘蛋白變化（n=3）

3 討論

2型糖尿病中醫(yī)多屬消渴病范疇，具有五臟脆，素體臟腑陰虛的病理基礎(chǔ)。清·丹波元堅(jiān)《雜病廣要·消渴》提出“消渴屬陰虛，津液不足”[8]。中醫(yī)證候研究顯示陰虛證是2型糖尿病重要證型之一，潮熱是其常見(jiàn)臨床表現(xiàn)。清·丹波元堅(jiān)《雜病廣要·寒熱門》認(rèn)為“潮熱有作有止，若潮水之來(lái)，不失其時(shí)，一日一發(fā)”[8]。2型糖尿病肝腎陰虛，午后陰氣當(dāng)旺不旺，陽(yáng)氣不能潛藏于內(nèi)而外越，表現(xiàn)為午后潮熱，至日暮而止。六味地黃丸出自宋代兒科大家錢乙《小兒藥證直訣·卷下》，張介賓于《景岳全書(shū)》改為湯劑，由熟地、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、丹皮組成。全方補(bǔ)瀉兼施，補(bǔ)養(yǎng)肝、脾、腎之陰，瀉腎濁虛火，主治腎陰虧損、腰膝酸軟、消渴、骨蒸潮熱等癥，為治療腎陰虧虛經(jīng)典方劑。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明六味地黃湯能夠通過(guò)影響血管生成及內(nèi)皮功能、改善炎癥反應(yīng)及缺氧反應(yīng)發(fā)揮治療2型糖尿病的作用[9]。

本研究采用自發(fā)性糖尿病小鼠模型結(jié)合“熱盛傷陰法”造模，選用自發(fā)性2型糖尿病模型db/db小鼠[10]，具有高血糖、高胰島素血癥、肥胖等2型糖尿病特點(diǎn)?！盁崾帯痹炷７椒ㄟx用辛熱之品附子、肉桂、吳茱萸灌服4周，取中醫(yī)過(guò)食辛溫燥熱，脾胃運(yùn)化失職，積熱內(nèi)蘊(yùn)，化燥傷津，久則耗傷陰液發(fā)為陰虛之意。課題組前期運(yùn)用該方法已成功建立陰虛證動(dòng)物模型[11]。

體溫節(jié)律由下丘腦中的視交叉上核（SCN）協(xié)調(diào)能量攝入與血管舒縮所等生理活動(dòng)調(diào)控，涉及中央起搏器和外周組織細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜分子鐘網(wǎng)絡(luò)，多使用非接觸式紅外溫度計(jì)對(duì)直腸、陰道、口腔或耳廓等部位多次測(cè)量，以準(zhǔn)確評(píng)估體溫晝夜變化[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)小鼠四肢爪心溫度、心前區(qū)溫度及肛溫改變，全面反映2型糖尿病陰虛證小鼠模型體溫變化。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病組的各部位體溫波動(dòng)節(jié)律紊亂，2型糖尿病陰虛證動(dòng)物模型肛溫、雙上肢表現(xiàn)出了較為明顯8：30降低、15：00升高、20：00降低的體溫波動(dòng)節(jié)律。此現(xiàn)象在第4周成模后表現(xiàn)更為明顯，長(zhǎng)時(shí)程給予溫燥傷陰之品，耗傷小鼠陰液，陰虛陽(yáng)亢，于15：00檢測(cè)時(shí)體溫升高。既往研究表明，給予附子、肉桂等熱性藥物使小鼠TNF-α節(jié)律改變，出現(xiàn)發(fā)熱癥狀[13]。同時(shí)，“陰虛內(nèi)熱”可引起機(jī)體生物節(jié)律紊亂，能量代謝失常[14]。而給予高劑量六味地黃湯后體溫波動(dòng)節(jié)律幅度降低，具有改善作用，證明了2型糖尿病陰虛證體溫節(jié)律的晝夜波動(dòng)趨勢(shì)。現(xiàn)代研究表明，六味地黃湯中丹皮、山茱萸、澤瀉等藥物也都具有抗炎、解熱功效，為該方降低體溫，恢復(fù)正常體溫節(jié)律提供科學(xué)依據(jù)[15-17]，猜測(cè)這種作用也有可能通過(guò)調(diào)節(jié)生物鐘分子機(jī)制所實(shí)現(xiàn)。

分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2型糖尿病陰虛證模型生物鐘基因在下丘腦和肝臟中均發(fā)生改變，表明這種“潮熱”樣體溫節(jié)律改變可能是由于生物鐘核心反饋環(huán)路蛋白異常而引起。生物鐘核心反饋環(huán)路包括正調(diào)控元件和負(fù)調(diào)控元件。Bmal1與Clock結(jié)合為異源二聚體（Bmal1-Clock），激活靶基因啟動(dòng)子E-box驅(qū)動(dòng)Pers和Crys轉(zhuǎn)錄表達(dá)，Per和Cry蛋白在細(xì)胞質(zhì)中形成異二聚體，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過(guò)與復(fù)合物Bmal1-Clock的相互作用抑制自身轉(zhuǎn)錄[18]。

在本實(shí)驗(yàn)中，2型糖尿病模型下丘腦節(jié)律基因表達(dá)較為穩(wěn)定，Clock、Per2和Cry2表達(dá)下降，而給予傷陰藥造模后，Per2表達(dá)顯著性升高，表明傷陰藥能增加下丘腦Per2蛋白表達(dá)，這可能是2型糖尿病陰虛證模型體溫節(jié)律變化引起“潮熱”癥狀的重要機(jī)制。下丘腦SCN區(qū)域是生物節(jié)律的調(diào)節(jié)中樞，具有調(diào)節(jié)體溫的功能，其節(jié)律相位在一定溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定，這種溫度補(bǔ)償機(jī)制是不同區(qū)域相互聯(lián)系、協(xié)同調(diào)控的結(jié)果，而非細(xì)胞水平自主性[19]。SCN區(qū)域不易受環(huán)境溫度變化影響，可在一定溫度變化范圍內(nèi)保持穩(wěn)定的魯棒性，通過(guò)調(diào)節(jié)體溫使外周組織節(jié)律相位一致。研究表明，Per2可影響體溫節(jié)律，當(dāng)將per2啟動(dòng)子區(qū)域中的Ebox順式元件突變后，可持續(xù)的分子時(shí)鐘振蕩消除，同時(shí)晝夜運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和體溫節(jié)律變得不穩(wěn)定[20]。也有報(bào)道表明，給予新生小鼠辣椒素皮膚涂抹刺激后，晝夜體溫升高，Per2蛋白表達(dá)升高，表明了Per2對(duì)溫度具有敏感性[21]。在陰虛證中，外界環(huán)境溫度未有變化，但機(jī)體陰液虧耗，陽(yáng)熱偏盛，于午后發(fā)熱，這種發(fā)熱常穩(wěn)定存在，可能原因是由于下丘腦SCN區(qū)域生物節(jié)律蛋白Per2表達(dá)持續(xù)升高所致，從而形成穩(wěn)定的午后發(fā)熱。

肝臟作為生物節(jié)律外周組織，受外界環(huán)境溫度、飲食等多種因素影響，也受到下丘腦SCN區(qū)域的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2型糖尿病組的肝臟生物鐘蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組降低，表現(xiàn)在Clock、Per3、Cry1上。2型糖尿病陰虛證模型上發(fā)現(xiàn)可Bmal1、Clock、Per1、Per3、Cry1蛋白表達(dá)增加，說(shuō)明2型糖尿病陰虛證小鼠出現(xiàn)節(jié)律改變，而六味地黃湯可能緩解這種節(jié)律改變。在2型糖尿病模型中，由于Bmal1和Clock基因表達(dá)下降，其下游生物鐘基因Per1、Per2、Per3和Cry1也呈下降趨勢(shì)。比較正常對(duì)照組與陰虛證組，2型糖尿病和2型糖尿病陰虛證組，可以發(fā)現(xiàn)，陰虛證組節(jié)律基因表達(dá)升高幅度較小，而糖尿病陰虛證的蛋白表達(dá)較糖尿病明顯升高。表明2型糖尿病受傷陰藥造模影響后，更容易發(fā)生節(jié)律改變，而正常對(duì)照組受影響較小。2型糖尿病患者的溫度調(diào)節(jié)能力受損，可能是溫度補(bǔ)償特征受損[7]。除生物節(jié)律受溫度影響外，上述節(jié)律因子還參與糖尿病的糖脂代謝、胰島素分泌等生理過(guò)程。Bmal1和Clock是生物鐘核心環(huán)路的正反饋調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)Per/Cry等參與胰島素生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)以及葡萄糖刺激的胰島素分泌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活，從而影響糖代謝過(guò)程[22]，Bmal1基因多態(tài)性更是與空腹血糖升高相關(guān)，誘導(dǎo)糖尿病發(fā)生[23]。

綜合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)各組間體溫節(jié)律的變化，在相應(yīng)分子表達(dá)上呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，模型組顯著低于正常對(duì)照組，而陰虛證組和糖尿病陰虛證組表達(dá)上升，六味地黃湯反證了陰虛證具有節(jié)律表現(xiàn)的同時(shí)，也有上調(diào)節(jié)律因子的趨勢(shì)。中樞組織和外周組織的節(jié)律因子的表達(dá)有異同，共同可見(jiàn)有Clock、Cry蛋白的變化。節(jié)律調(diào)控中樞下丘腦中，主要的變化因子是Per2和Cry2。不同的是，在外周靶器官中，主要的調(diào)控因子是Bmal1、Per3和Cry1。通過(guò)分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)生物鐘機(jī)制在糖尿病陰虛證中的重要作用。生物鐘分子的正常表達(dá)可以使機(jī)體表現(xiàn)出穩(wěn)定節(jié)律，生物鐘分子表達(dá)下降則容易導(dǎo)致節(jié)律紊亂[24]。如2型糖尿病小鼠體溫節(jié)律波動(dòng)規(guī)律不明顯，相應(yīng)節(jié)律分子表達(dá)下降；而糖尿病陰虛證小鼠的生物鐘蛋白表達(dá)上調(diào)，與機(jī)體表現(xiàn)出穩(wěn)定的“午后潮熱”“五心煩熱”相關(guān)。研究表明，生物鐘和溫度周期具有密切聯(lián)系，長(zhǎng)時(shí)間日光照射可導(dǎo)致生物節(jié)律蛋白降解，但穩(wěn)定的溫度周期可是的核心生物鐘蛋白恢復(fù)振蕩，重啟生物鐘。

綜上，2型糖尿病陰虛證動(dòng)物模型顯示出具有“潮熱”的體溫節(jié)律變化，體現(xiàn)在肛溫、雙上肢爪心溫度的8：00“低”、15：00“高”、20：00“低”節(jié)律波動(dòng)，肝臟和下丘腦生物節(jié)律改變可能是這種體溫節(jié)律變化的重要機(jī)制。以生物節(jié)律為切入點(diǎn)探討2型糖尿病陰虛證的證候本質(zhì)的研究較為零散，不同疾病證候中的研究報(bào)道亦有不同，但是其可以擴(kuò)展我們對(duì)疾病證候科學(xué)內(nèi)涵的認(rèn)識(shí)，并拓寬中醫(yī)證候研究的新思路，也為中醫(yī)證候新藥的研究和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

本研究存在一定不足，如所構(gòu)建的陰虛證模型是旨在模擬疾病證候模型，不能完全模擬真實(shí)世界患者所患證候特征；其次，本研究所應(yīng)用的嚙齒動(dòng)物的生物節(jié)律與人類生物節(jié)律生存在差異，不能完全模擬現(xiàn)代人疾病證候下出現(xiàn)的節(jié)律紊亂，但也有大量文獻(xiàn)應(yīng)用嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行人類節(jié)律紊亂相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[25-28]，這些問(wèn)題也將在今后的實(shí)驗(yàn)及臨床研究中不斷深入研究。綜上所述，本研究結(jié)果豐富了中醫(yī)糖尿病陰虛證證候特征的實(shí)質(zhì)研究以期對(duì)中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)及生物節(jié)律相關(guān)研究進(jìn)行，為今后進(jìn)一步的研究?jī)?chǔ)備了有益的依據(jù)。