電針激活CB2受體增強(qiáng)細(xì)胞自噬功能緩解炎性痛的機(jī)制*

武彩花，高芳，向宏春，藍(lán)渝葉，萬科幸，高珊，楊金梅，李熳，毛紅蓉**

（1.武漢市第一醫(yī)院 武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 武漢 430030）

炎性痛通常由組織損傷與炎癥一起發(fā)生，廣泛存在于各種急、慢性疾病的進(jìn)程中，當(dāng)炎癥反應(yīng)繼續(xù)存在，這種疼痛就會持續(xù)存在[1-2]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。研究表明，細(xì)胞自噬與炎癥反應(yīng)之間存在著密切聯(lián)系[3]，自噬能通過清除受損的線粒體，進(jìn)而抑制炎癥小體的激活以及白介素-1β（Interleukin-1 β，IL-1β）的分泌[4]。自噬是一種胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[5]，控制著物質(zhì)向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)，使有缺陷的細(xì)胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)等物質(zhì)降解[6]，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[7]。已有研究表明，電針治療炎性痛疾病具有消炎、鎮(zhèn)痛的作用[8-10]，前期工作表明，電針能通過上調(diào)外周內(nèi)源性大麻素含量，激活CB2受體，進(jìn)而顯著下調(diào)大鼠炎癥皮膚組織中IL-β等致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而發(fā)揮消炎、鎮(zhèn)痛作用[11-13]。而電針能否通過激活炎性痛病灶皮膚組織中的CB2受體，增強(qiáng)其炎癥皮膚組織細(xì)胞自噬功能，促進(jìn)受損線粒體的清除，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，目前尚不清楚。本研究首先觀察電針對野生型小鼠和CB2受體基因敲除小鼠CFA誘導(dǎo)炎性痛的緩解作用和炎癥皮膚組織細(xì)胞自噬功能的影響，激活CB2受體模擬電針作用，觀察其對NR8383巨噬細(xì)胞自噬功能以及線粒體受損情況的影響，探討電針能否通過激活CB2受體增強(qiáng)炎癥皮膚組織細(xì)胞自噬功能以及促進(jìn)受損線粒體的清除從而緩解炎性痛。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

CB2受體基因敲除小鼠購于Jackson實驗室（貨號005786）。小鼠飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心SPF級動物房，4周齡時打耳標(biāo)并剪尾，提取尾組織DNA，采用PCR進(jìn)行基因型的鑒定，鑒定方法依據(jù)Buckley等[14]的文獻(xiàn)報道。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

PCR反應(yīng)溫度體系為：95℃反應(yīng)1 min；60℃反應(yīng)1 min，72℃反應(yīng)2 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

實驗采用健康野生型（Wild type，WT）為CB2基因敲除小鼠同窩，鑒定方法同上，為陰性，以下簡稱野生型小鼠。

1.2 動物模型

動物模型實驗中的所有動物操作及方案均經(jīng)過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。實驗小鼠飼養(yǎng)條件：環(huán)境潔凈，室內(nèi)溫度22±2℃、12 h白晝/12 h黑夜自動交替的動物房，飲食自由。在實驗前馴養(yǎng)適應(yīng)1周，野生型小鼠和CB2受體基因敲除小鼠均隨機(jī)分為：溶媒對照組（control組）、CFA模型組（CFA模型組）、電針組（CFA+EA組）和假電針組（CFA+ sham EA組），每組8只。其中CFA模型組、電針組和假電針組在小鼠左后肢足背皮下注射50 μL CFA誘導(dǎo)炎性痛模型，溶媒對照組在同部位注射50 μL石蠟油；電針組小鼠在造模后第2、4、6天，采用LH202H型韓氏穴位電針儀針刺小鼠的左側(cè)膽經(jīng)“環(huán)跳穴”（GB30）和“陽陵泉穴”（GB34），電針參數(shù)為：電流強(qiáng)度1 mA，頻率2 Hz，刺激30 min；假電針組僅將毫針刺入相同穴位，不通電，留針30 min。

1.3 痛行為學(xué)檢測

采用熱板測痛法測定小鼠熱痛閾值。在室溫為25-27℃的安靜環(huán)境中，設(shè)置熱板溫度為55℃，將小鼠放入熱板上，同時開始計時，小鼠出現(xiàn)縮腿或舔爪信號時停止計時，并及時取出小鼠避免燙傷，每只小鼠測3次后取平均值，每次間隔5 min。

采用von Frey絲（Stoelting, Wood Dale, IL），以“up and down”方法[15]測定小鼠機(jī)械痛閾。在室溫25-27℃的安靜環(huán)境中，采用雙盲實驗方法，將小鼠置于底為5 mm × 5 mm的金屬絲網(wǎng)眼墊的透明有機(jī)玻璃箱中，適應(yīng)20-30 min，等其安靜后測定機(jī)械痛閾。將校準(zhǔn)的von Frey絲垂直地作用于小鼠左后肢足底，稍用力，直至其彎曲成S形，每次持續(xù)時間最長不超過6 s，小鼠出現(xiàn)快速的縮足反射或舔足反應(yīng)，則記為陽性反應(yīng)。每次測試重復(fù)2次，計算平均值。造模前所有小鼠連續(xù)測定3天基礎(chǔ)痛閾，造模后連續(xù)測6天。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

采用的NR 8383來源于肺灌洗時的正常大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，購于武漢普諾賽生命科技有限公司。用含20%胎牛血清（Biological Industries公司，以色列）及1%雙抗（Gibco公司，美國）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度至90%以上后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。NR 8383為貼壁和懸浮混合狀態(tài)生長的細(xì)胞，其傳代方法為直接用移液器吹打細(xì)胞，將其從培養(yǎng)瓶底部吹下來，收集細(xì)胞懸液至15 mL離心管中，室溫800 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，棄掉上清，加入新鮮培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸細(xì)胞，以1∶2的比例將細(xì)胞種于新的培養(yǎng)瓶中。

1.5 Western blot檢測p62、LC3B蛋白表達(dá)

檢測各組小鼠p62、LC3B蛋白表達(dá)。取制備的皮膚組織及收集的細(xì)胞懸液，提取總蛋白，使用加強(qiáng)型BCA試劑盒（碧云天）測定蛋白濃度。取80 μg總蛋白上樣，采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（80V，恒壓2 h）。電泳結(jié)束后切取目的條帶，將目的條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，取出PVDF膜，封閉1 h后，4℃孵育一抗（兔抗p62、兔抗LC3B）過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶20 000）后室溫孵育1 h，在暗室用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色5 min，壓膠片，取出膠片并依次放入顯影液、定影液中顯影。將膠片洗凈晾干后掃描，使用Image J對條帶進(jìn)行灰度分析。Western blot實驗所用一抗有兔抗p62（1∶1000），購于Cell Signaling；兔抗LC3B（1:1000），購于Cell Signaling；小鼠抗β-actin（1:4000），購于Santa Cruz；使用的二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠/羊抗兔IgG（1∶20000），購于Jackson ImmunoResearch。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

受損線粒體檢測：NR8383細(xì)胞加藥處理完成后，避光操作，加入線粒體染料MitoTracker Green（綠色熒光可染所有的線粒體，100 nmol·L-1）和MitoTracker deep Red（紅色熒光，依賴于線粒體的膜電位，只能染有活性的線粒體，100 nmol·L-1）（均購于Life Technology），于37℃孵育30 min；吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，室溫用800 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清；加1 mL PBS 37℃洗滌細(xì)胞2次，每次5 min，再離心棄上清；加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，使用FlowJo 7.6.2軟件分析結(jié)果并作圖。

線粒體活性氧（Reactive oxygen species，ROS）檢測：NR8383細(xì)胞加藥處理完成后，避光操作，加入線粒體相關(guān)ROS染料MitoSOX（MitoSOX?Red，線粒體超氧化物指示劑，Invitrogen公司，Thermo Fisher Scientific Inc）對細(xì)胞進(jìn)行2.5 μmol·L-1染色，于37℃孵育30 min；用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，再懸浮在含1%胎牛血清的冷PBS溶液中，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。使用FlowJo 7.6.2軟件分析結(jié)果并作圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（means±SEM）表示，采用單因素方差分析和LSD（最小顯著差異）和S-N-K方差后分析來檢測各組的統(tǒng)計差異，分析均在SPSS（11.5版）程序中進(jìn)行，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 電針顯著改善野生型炎性痛模型小鼠熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺超敏

與溶媒對照組相比，野生型小鼠CFA造模后第1天各組熱痛閾、機(jī)械痛閾值均較溶媒對照組顯著下降（P＜0.01，圖1A、1C）；與CFA模型組相比，給予2 Hz電針治療后，電針組的熱痛閾在第3-6天均顯著回升（P＜0.05，圖1A），電針組的機(jī)械痛閾值在第2-6天均顯著回升（P＜0.05，圖1C）。假電針組的熱痛閾和機(jī)械痛閾較模型組均無顯著差異（P＞0.05）。說明電針可顯著改善炎性痛模型野生型小鼠的熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺超敏。

圖1 電針對野生型和CB2受體基因敲除小鼠熱痛閾值和機(jī)械痛覺閾值的影響（means±SEM，n=8）

與溶媒對照組相比，CB2受體基因敲除小鼠造模后第1天各組熱痛閾、機(jī)械痛閾值均顯著下降（P＜0.01，圖1B、1D），而給予2 Hz電針治療后對CB2受體基因敲除炎性痛模型小鼠的熱痛閾和機(jī)械痛閾均無顯著影響（P＞0.05，圖1B、1D）。以上結(jié)果提示，電針通過激活CB2受體緩解CFA誘導(dǎo)的炎性痛。

2.2 電針顯著改善野生型炎性痛模型小鼠炎癥皮膚組織細(xì)胞中自噬功能

在野生型小鼠皮膚組織中，CFA模型組p62蛋白表達(dá)較溶媒對照組顯著升高，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著下降（P＜0.05，圖2A、2B、2D），與CFA模型組比較，電針組p62蛋白水平顯著下降，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著上升（P＜0.05，圖2A、2B、2D），假電針組無明顯變化（P＞0.05）。以上結(jié)果提示，CFA誘發(fā)炎性痛時小鼠皮膚組織中自噬減弱，而給予電針治療后可促進(jìn)自噬功能。

圖2 電針對野生型和CB2受體基因敲除小鼠炎癥皮膚組織中p62蛋白表達(dá)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的影響（means±SEM，n=8）

在CB2受體基因敲除小鼠皮膚組織中，與溶媒對照組相比，CFA模型組p62蛋白表達(dá)顯著升高，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值顯著下降（P＜0.05，圖2A、C、E），給予電針或假電針治療后，p62蛋白表達(dá)和LC3-II/I的比值均與CFA 模型組無顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，電針促進(jìn)炎癥皮膚組織的自噬功能依賴于CB2受體的參與。

2.3 在NR8383巨噬細(xì)胞中激活CB2受體可改善CFA引起的自噬功能減弱

與DMSO對照組相比，給予CFA處理后會導(dǎo)致NR8383細(xì)胞自噬底物p62蛋白表達(dá)顯著升高，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值顯著降低（P＜0.05，圖3），提示CFA顯著抑制NR8383巨噬細(xì)胞的自噬功能；采用CB2受體激動劑AM1241預(yù)處理再加入CFA后，NR8383巨噬細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值顯著升高（P＜0.05，圖3），CB2受體拮抗劑AM630可逆轉(zhuǎn)上述作用。以上結(jié)果提示：CB2受體激活劑AM1241可顯著改善CFA引起的NR8383巨噬細(xì)胞自噬功能障礙，該作用是由CB2受體介導(dǎo)的。

圖3 CB2受體激動劑AM1241對CFA處理后NR8383巨噬細(xì)胞自噬功能的調(diào)節(jié)作用（means±SEM，n=8）

2.4 在NR8383巨噬細(xì)胞中激活CB2受體可減少線粒體受損的數(shù)量

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測NR8383巨噬細(xì)胞中受損的線粒體。如圖4A所示，P2區(qū)表示膜活性受損的線粒體，只染上綠色熒光。CFA可誘發(fā)膜活性受損的線粒體增多（P＜0.05，圖4B）；CB2受體激動劑AM1241預(yù)處理后，與CFA模型組相比，受損線粒體的數(shù)量顯著減少，而CB2受體拮抗劑AM630可逆轉(zhuǎn)此作用。以上結(jié)果提示：CB2受體激活劑AM1241可明顯減少受損線粒體的數(shù)量，該作用是CB2受體介導(dǎo)的。

圖4 CB2受體激動劑AM1241對CFA處理后NR8383巨噬細(xì)胞中受損線粒體數(shù)量的影響（means±SEM，n=8）

3 討論

炎性痛是由于損傷或者感染的組織釋放的炎癥介質(zhì)作用于痛覺神經(jīng)末梢，增強(qiáng)其興奮性，導(dǎo)致痛覺過敏的發(fā)生[1,16]。足部皮下注射CFA是一種常用的炎性痛模型[17-18]，被用來研究炎性疼痛。有研究表明自噬參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，如能增強(qiáng)自噬作用，就可以清除體內(nèi)更多的受損線粒體等細(xì)胞器，以實現(xiàn)細(xì)胞本身代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制[19-20]，調(diào)節(jié)線粒體自噬或許成為一些疾病治療新的方向。

近來研究表明，自噬與炎性痛之間存在著密切聯(lián)系[21-22]，炎癥可以激活或抑制自噬，而自噬可以調(diào)節(jié)炎癥因子的產(chǎn)生和分泌從而調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)[23-24]。在自噬啟動期間，p62與自噬體膜結(jié)合，已被廣泛用作自噬發(fā)生的蛋白質(zhì)標(biāo)記物。LC3是一類泛素樣蛋白，能促進(jìn)炎癥小體的形成[25-26]，也可作為與自噬密切相關(guān)的主要標(biāo)記物。其中P62通過LC3相互作用區(qū)結(jié)構(gòu)域參與自噬-溶酶體的形成，LC3包括LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ型，發(fā)生自噬時，LC3-Ⅰ脂質(zhì)化形成LC3-Ⅱ，并定位在胞內(nèi)自噬體膜上，在自噬過程中被降解[27-28]。因此，LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ和p62清除被認(rèn)為是自噬通量的標(biāo)志[29-30]。大量的臨床研究表明，電針治療各種疼痛類疾病效果顯著，在臨床得到廣泛的應(yīng)用[31-33]。外周機(jī)制被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)過程中內(nèi)源性鎮(zhèn)痛的重要機(jī)制[34-35]，阿片肽、內(nèi)源性大麻素、生長抑素和抗炎細(xì)胞因子等是常見的內(nèi)源性鎮(zhèn)痛化合物[35]。本課題組前期研究結(jié)果表明，在CFA誘導(dǎo)的炎性痛模型中，電針能通過上調(diào)炎癥皮膚組織中內(nèi)源性大麻素的合成[10,13]，激活外周CB2受體，顯著抑制皮膚組織中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α（Tumour necrosis factor alpha，TNF-α）的表達(dá)[36]。同時，電針通過CB2受體能抑制NLPR3炎癥小體的活化和IL-1β成熟片段的產(chǎn)生，從而抑制CFA炎性痛模型中的熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺超敏[11]。有研究表明，CB2激活后通過增強(qiáng)自噬作用發(fā)揮抗炎、抑制膀胱炎的作用[37-39]。和此研究相一致，本研究通過CB2受體基因敲除小鼠首次發(fā)現(xiàn)，電針能通過激活CB2受體，促進(jìn)炎癥組織細(xì)胞中自噬功能，從而緩解炎性痛。

由于電針能促進(jìn)炎癥皮膚組織中內(nèi)源性大麻素的合成并激活CB2受體，在離體實驗中采用CB2受體激動劑AM1241來模擬電針作用，以探討電針激活CB2受體促進(jìn)自噬后緩解炎性痛的機(jī)制。結(jié)果 表明，AM1241激活CB2受體后可顯著促進(jìn)NR8383巨噬細(xì)胞的自噬功能，改善CFA引起的細(xì)胞自噬功能減弱。同時，通過檢測受損線粒體數(shù)量，發(fā)現(xiàn)CFA可增加膜活性受損的線粒體數(shù)量，說明CFA減弱細(xì)胞自噬功能，不能清除受損的細(xì)胞器；而經(jīng)CB2受體激動劑AM1241預(yù)處理后，受損線粒體的數(shù)量顯著減少，而CB2受體拮抗劑AM630可翻轉(zhuǎn)這一作用。以上結(jié)果提示，CB2受體激活后改善自噬功能障礙，從而有效清除受損的線粒體等細(xì)胞器。由于受損線粒體可以產(chǎn)生ROS，繼而激活NLRP3炎癥小體，增加IL-1β成熟片段的分泌[40-41]，從而敏化外周傷害性感受器，導(dǎo)致炎性痛[11]。CB2受體激活減少受損線粒體的數(shù)量后，可減少炎癥小體的活化和IL-1β等炎癥因子的分泌，從而緩解炎性痛。

電針療法是在刺入人體穴位的毫針上通以接近人體生物電的微量電流，利用針和電兩種刺激相結(jié)合，以防治疾病的一種方法。以往的研究表明，電針通過激活CB2受體增加內(nèi)源性阿片肽受體等鎮(zhèn)痛物質(zhì)，從而減輕炎性痛[42]。而經(jīng)皮神經(jīng)電刺激療法則是刺激感覺纖維而設(shè)計的，將其電極置于特殊點，有關(guān)穴位和運(yùn)動點，另外可置于病灶同節(jié)段上，因為電刺激可引起同節(jié)段的內(nèi)啡肽釋放而鎮(zhèn)痛，跟電針有相似之處。但是電針刺激在針刺后施加，針刺的深淺與得氣以及療效都有關(guān)系，因此電針對穴位深層的刺激作用是經(jīng)皮電刺激達(dá)不到的。

綜上所述，電針可能通過激活CB2受體，增強(qiáng)炎癥皮膚組織細(xì)胞的自噬功能，清除受損的線粒體，減少炎癥因子的釋放，從而緩解炎性痛。