大黃素通過調(diào)控miR-29a-5p/VEGFB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性*

張肇鋒，湯若晗，張良

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210023）

多柔比星（Doxorubicin，DOX）作為臨床上最常用的化療藥物，對(duì)多種血液系統(tǒng)癌癥和肉瘤具有顯著的治療作用[1-2]。但是，嚴(yán)重的心臟毒性限制了其臨床益處的發(fā)揮[3]。目前的研究顯示多柔比星心臟毒性的多種誘發(fā)因素中氧化應(yīng)激是最主要的因素，DOX可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞中活性氧（ROS）含量增加，同時(shí)DOX降低了超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，引發(fā)心臟毒性[4]。因此，新的治療藥物的研究與開發(fā)對(duì)該疾病具有重要的意義。

microRNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，可以與大多數(shù)人類mRNA產(chǎn)生保守的相互作用，從而影響人體的發(fā)育過程和疾病進(jìn)程[5]。近年來，越來越多的研究顯示miRNA在多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性進(jìn)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，例如miR-495-3p[6]與miR-24-3p[7]均能靶向相關(guān)蛋白減輕氧化損傷改善多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性。有文章顯示大鼠在給予DOX治療后心肌組織中miR-29a-5p表達(dá)水平明顯升高[8]，此外，miR-29a-5p在細(xì)胞凋亡[9]和氧化應(yīng)激[10]等細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程中也發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用。miR-29a-5p的靶向蛋白血管內(nèi)皮生長因子B（Vascular endothelial growth factor-B，VEGFB）在心臟中大量表達(dá)，之前的研究顯示白藜蘆醇能夠通過上調(diào)VEGFB減輕多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[11]。對(duì)于其抗凋亡的機(jī)制，有研究表明VEGFB能夠激活受體NP-1和VEGFR-1并與它們的復(fù)合物結(jié)合發(fā)揮抗凋亡的功能[12-13]。然而，miR-29a-5p/VEGFB途徑是否可以調(diào)節(jié)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性，目前仍未見報(bào)道。

大黃素（Emodin）是從中藥大黃中提取的蒽醌衍生物，具有抗炎[14]、抗菌[15]、免疫抑制[16]等生物活性。重要的是，有研究表明大黃素可以抑制脂多糖（LPS）和缺氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡[17-18]和心肌炎癥[19]的發(fā)生。然而，目前還沒有大黃素對(duì)抗DOX誘導(dǎo)心臟毒性作用和機(jī)制的研究報(bào)告，因此，本研究的目的是研究大黃素對(duì)DOX誘導(dǎo)心臟毒性的保護(hù)作用，并檢驗(yàn)這種作用是否通過調(diào)控miR-29a-5p/VEGFB途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

H9C2大鼠心肌細(xì)胞，購買于江蘇凱基生物技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑

大黃素（批號(hào)：C18F8Q29652）、多柔比星（批號(hào)：H11S10Y9726），上海源葉生物科技有限公司；DMSO（批號(hào)：710N0314），北京索萊寶科技有限公司；DMEM（批號(hào)：8121587）、FBS（批號(hào)：2176377），美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素混合液（100×）（批號(hào)：20210415），蘇州新賽美生物科技有限公司；Caspase-3試劑盒（批號(hào)：110719200930）、Caspase-9試劑盒（批號(hào)：041621211117）、MDA脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：041621210810）、總SOD活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：052621210729）、ROS活性氧檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：041720200803）、GSH-Px谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：030121210906）、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：050721211125），均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；cTnT肌鈣蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：Dec 2021），南京邁博生物科技有限公司；CK肌酸激酶檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：202201），南京翼飛雪生物科技有限公司；GSH還原型谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20211104）、LDH乳酸脫氫酶檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20211207），南京建成生物工程研究所；VEGFB抗體（批號(hào)：73v5240），美國AFFINITY公司；Bax抗體（批號(hào)：10005017）、Bcl-2（批號(hào)：26593-1-AP）、Bcl-xl抗體（批號(hào)：00049963）、β-actin抗體（批號(hào)：10004156）、鼠二抗（批號(hào)：20000275），均購自美國Proteintech公司；兔二抗（批號(hào)：BST17A13B17C50），美國BOSTER公司；miR-29a-5p模擬物、抑制劑和陰性對(duì)照購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix和miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 儀器

IX53型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；infinte M200PRO型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；164-5050垂直電泳儀、GelDoc 2000凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；Nikon Ti倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；DS-11型Nano-Drop濃度測(cè)定儀，美國DeNovix公司；7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H9C2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含89% DMEM、10%胎牛血清、1% 1×105U·mL-1青霉素和1×105μg·mL-1鏈霉素的完全培養(yǎng)基中。在37℃下含95% O2、5% CO2的飽和濕度條件中培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

取對(duì)數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)細(xì)胞·mL-1，接種于六孔板。設(shè)對(duì)照組、DOX組（2.5 μmol·L-1，溶解于生理鹽水中）及大黃素低、中、高劑量組（5、15、25 μmol·L-1，溶解于0.1% DMSO中）。

2.3 多柔比星誘導(dǎo)的心臟毒性細(xì)胞模型的建立

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳多柔比星處理濃度為2.5 μmol·L-1建立心臟毒性模型，誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞損傷16 h。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將H9C2細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞·mL-1的密度接種于96孔板中培養(yǎng)24 h。用不同濃度大黃素（5、15、25 μmol·L-1，溶解于0.1% DMSO中）預(yù)孵育細(xì)胞8 h，然后加入DOX（2.5 μmol·L-1，溶解于生理鹽水中）處理細(xì)胞16 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，37℃下孵育4 h，在490 nm處檢測(cè)各孔吸光度（OD）。計(jì)算：細(xì)胞活力（%）=（DOX組OD值-調(diào)零組OD值）/（對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值）×100%。

2.5 測(cè)量cTnT、LDH、CK、SOD、MDA、GSH和GSH-Px水平

取細(xì)胞培養(yǎng)液上清加入96孔板，按試劑盒說明書向各孔中加入相應(yīng)檢測(cè)試劑，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)心肌肌鈣蛋白（cTnT）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）水平；按試劑盒說明書對(duì)H9C2進(jìn)行細(xì)胞裂解操作，將細(xì)胞裂解液與相應(yīng)檢測(cè)試劑加入96孔板中，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）的濃度。

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）檢測(cè)

將H9C2細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞·mL-1的密度接種于24孔板中，并用不同濃度大黃素（5、15、25 μmol·L-1）預(yù)孵育8 h，然后加入DOX處理細(xì)胞16 h。去除培養(yǎng)液，加入含DCFH-DA（10 μmol·L-1）的無血清培養(yǎng)液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。最終通過倒置熒光顯微鏡以200倍放大倍率分析樣品。

2.7 Caspase-3、Caspase-9活性檢測(cè)

將H9C2細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞·mL-1的密度接種于24孔板中。根據(jù)試劑盒說明書，使用比色法測(cè)定H9C2細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9活性。

2.8 TUNEL染色

將H9C2細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞·mL-1的密度接種于24孔板中。其余步驟按照試劑盒流程進(jìn)行：PBS洗滌1次，用免疫染色固定液固定細(xì)胞30 min。加入免疫染色強(qiáng)力通透液，室溫孵育5 min。用PBS洗滌2次。每孔加50 μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min后加入含DAPI的抗熒光淬滅封片液。置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片。

2.9 RT-qPCR測(cè)定miR-29a-5p、VEGFB的mRNA表達(dá)水平

使用總RNA提取試劑提取H9C2細(xì)胞中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以生成第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA），使用SYBR qPCR Master Mix在ABI Q6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。PCR引物序列如下（Rat）：miR-29a-5p：F：5’-CGCCGTAGCACCATCTGAAA-3’，R：5’-CAGCCAC AAAAGAGCACAAT-3'，逆轉(zhuǎn)錄引物5’-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCT GAAC-3’；U6：F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAA AAT-3’，R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，逆轉(zhuǎn)錄引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；VEGFB：F：5’-TGGAACTCATGGGTAATGTGGTCAAAC-3’，R：5’-CTGGCTTCACAGCACTCTCCTTTC-3’；GAPDH：F：5’-GTCCATGCCATCACTGCCACTC-3’，R：5’-CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’。

2.10 Western blot法檢測(cè)H9C2細(xì)胞中VEGFB、Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白的表達(dá)

將H9C2細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞·mL-1的密度接種于6孔板中，用不同濃度大黃素（5、15、25 μmol·L-1，溶解于0.1% DMSO中）預(yù)孵育細(xì)胞8 h，然后加入DOX（2.5 μmol·L-1，溶解于生理鹽水中）處理細(xì)胞16 h。使用含蛋白酶和蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度。測(cè)定含量后，經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗VEGFB、Bax、Bcl-2、Bcl-xl，4℃孵育過夜。室溫下加入二抗孵育1 h后，使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用Image J軟件對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

2.11 miR-29a-5p模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染的目的是上調(diào)或下調(diào)miR-29a-5p的表達(dá)水平。將miR-29a-5p模擬物、模擬陰性對(duì)照物、miR-29a-5p抑制劑或抑制劑陰性對(duì)照物分別溶于在Opti-MEM中。向每種溶液中加入LipoRNAi轉(zhuǎn)染試劑。加入6孔板中后在室溫下孵育20 min。在無雙抗培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞。37℃培養(yǎng)48 h。檢測(cè)miR-29a-5p模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染效率、VEGFB mRNA和蛋白表達(dá)水平。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s，n=6）表示。使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃素減輕了DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞心臟毒性

如圖1A所示，DOX以時(shí)間和劑量依賴性的方式降低了H9C2細(xì)胞的活力（P＜0.01）。前期研究顯示，2.5 μmol·L-1DOX處理H9C2細(xì)胞8 h條件下無法達(dá)到造模要求；同時(shí)H9C2細(xì)胞在2.5 μmol·L-1DOX處理24 h條件下，大黃素對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷又難以逆轉(zhuǎn)；而在2.5 μmol·L-1DOX處理H9C2細(xì)胞16 h條件下，15 μmol·L-1的大黃素可以顯著提高H9C2細(xì)胞的活力（P＜0.01），如圖1B所示，故選擇DOX誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞16 h作為本實(shí)驗(yàn)的造模時(shí)間。大黃素低、中、高劑量下單獨(dú)處理H9C2細(xì)胞沒有產(chǎn)生明顯的毒性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如圖1C所示。此外，與對(duì)照組相比，DOX組cTnT、LDH、CK水平均明顯升高；然而，大黃素顯著降低了H9C2細(xì)胞中cTnT、LDH、CK釋放水平（P＜0.01），如圖1D-1F。結(jié)果 表明，大黃素減輕了DOX誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷，改善了DOX引起的心臟毒性。

圖1 大黃素保護(hù)H9C2細(xì)胞免受DOX誘導(dǎo)的損傷的影響（±s，n=6）

3.2 大黃素減輕了DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷

如圖2A-2D所示，與DOX組相比，大黃素顯著降低了H9C2細(xì)胞中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的表達(dá)水平，同時(shí)顯著增加了SOD、GSH和GSH-Px等抗氧化酶的水平（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，DOX組H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS釋放量明顯升高；然而，與DOX組相比，大黃素顯著降低了DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中ROS水平升高的情況（P＜0.01），如圖2E-2F。這些結(jié)果表明，大黃素可以減輕DOX誘導(dǎo)的氧化損傷。

圖2 大黃素減輕了DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞氧化損傷（±s，n=6）

3.3 大黃素抑制了DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡

TUNEL染色顯示，大黃素抑制了DOX誘導(dǎo)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量的升高，初步顯示了大黃素的抗凋亡作用（P＜0.01），如圖3A-3B所示。與DOX組相比，大黃素顯著抑制了Caspase-3和Caspase-9活性的升高（P＜0.01），如圖3C-3D。Western blot結(jié)果顯示，DOX明顯降低了抗凋亡蛋白BCL-2、BCL-xl的表達(dá)水平，增加了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平。但是這些情況被大黃素逆轉(zhuǎn)（P＜0.01），如圖3E-3F。這些發(fā)現(xiàn)表明，心肌細(xì)胞損傷程度的降低與大黃素抑制H9C2心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

3.4 大黃素降低了DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中miR-29a-5p水平并提高VEGFB水平

圖4A顯示，DOX顯著上調(diào)了H9C2細(xì)胞中miR-29a-5p的表達(dá)水平，但是在低、中、高劑量大黃素作用下被顯著下調(diào)（P＜0.01）。RT-qPCR與Western Blot結(jié)果顯示，大黃素顯著提高了H9C2細(xì)胞中DOX誘導(dǎo)的VEGFB表達(dá)水平的下調(diào)（P＜0.01），如圖4B-4C。此外，單獨(dú)給予H9C2細(xì)胞大黃素處理能夠在15 μmol·L-1劑量下顯著提高H9C2細(xì)胞中VEGFB的表達(dá)（P＜0.05），如圖4D所示。這些結(jié)果初步顯示了大黃素對(duì)miR-29a-5p/VEGFB信號(hào)通路的調(diào)控作用。

圖4 大黃素降低了DOX誘導(dǎo)的miR-29a-5p水平并提高VEGFB水平（±s，n=6）

3.5 VEGFB是miR-29a-5p靶向蛋白

我們使用了兩種不同的數(shù)據(jù)庫（miRmap、miRDB）來預(yù)測(cè)miR-29a-5p的靶向蛋白，發(fā)現(xiàn)miR-29a-5p與VEGFB的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）有結(jié)合位點(diǎn)，如圖5A。然后給予H9C2細(xì)胞miR-29a-5p mimic與inhibitor轉(zhuǎn)染以確定miR-29a-5p對(duì)VEGFB表達(dá)的影響，首先使用RT-qPCR法驗(yàn)證了miR-29a-5p mimic與inhibitor的轉(zhuǎn)染效率（P＜0.01），如圖5B-5C所示。然后采用Western blot法檢測(cè)了VEGFB蛋白的表達(dá)量，使用miR-29a-5p mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞后，VEGFB蛋白的表達(dá)水平顯著降低/升高（P＜0.01）；RT-qPCR檢測(cè)VEGFB mRNA表達(dá)水平顯示了相同的趨勢(shì)（P＜0.01），如圖5D-5G所示。這些結(jié)果表明了miR-29a-5p對(duì)靶蛋白VEGFB具有調(diào)控作用。

圖5 miR-29a-5p靶向VEGFB（±s，n=6）

3.6 大黃素逆轉(zhuǎn)了miR-29a-5p模擬物的作用

為了進(jìn)一步驗(yàn)證大黃素對(duì)miR-29a-5p/VEGFB介導(dǎo)的信號(hào)通路的調(diào)控作用，我們使用miR-29a-5p mimic轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)大黃素在15 μmol·L-1劑量下仍然可以顯著提升H9C2細(xì)胞活力，減輕了DOX誘導(dǎo)的心臟毒性（P＜0.01），如圖6A。RT-qPCR結(jié)果顯示，與DOX+miR-29a-5p mimic組相比，大黃素在15 μmol·L-1劑量時(shí)明顯逆轉(zhuǎn)了其抑制VEGFB mRNA表達(dá)水平升高的情況；Western blot檢測(cè)顯示了相同的趨勢(shì)，如圖6B-6C所示（P＜0.01）。結(jié)果 顯示，過表達(dá)miR-29a-5p加重了DOX誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷，然而大黃素可以通過miR-29a-5p/VEGFB途徑逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證了大黃素對(duì)miR-29a-5p/VEGFB途徑的調(diào)控作用。

圖6 大黃素逆轉(zhuǎn)了miR-29a-5p模擬物的作用（±s，n=6）

4 討論

多柔比星（DOX）是一種蒽環(huán)類化療藥物，在抗腫瘤方面中發(fā)揮了重要作用。然而這種藥物的治療作用受到了其心臟毒性副作用的限制。研究表明給予DOX治療后2-3天出現(xiàn)急性心臟毒性，給藥后數(shù)月甚至數(shù)周產(chǎn)生慢性心臟毒性[20]，并且其他器官也會(huì)受到損傷，例如嚴(yán)重的肝腎毒性[21]。因此，找到一種能夠?qū)笵OX心臟毒性的活性化合物是迫切且必要的。

大黃素是大黃中含量最高的組分，根據(jù)之前的研究，大黃素能夠通過調(diào)節(jié)多個(gè)通路來調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，從而顯示出對(duì)多器官損傷有效的保護(hù)作用[22-25]，據(jù)此我們提出了大黃素能夠改善多柔比星（DOX）誘導(dǎo)的心臟毒性的假說。本研究探索了大黃素對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明大黃素顯著改善了DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，提高了H9C2細(xì)胞的活力，降低了cTnT、LDH、CK的釋放水平。

DOX已被證明可以通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的途徑產(chǎn)生心臟毒性[26-27]。因此我們研究了大黃素對(duì)DOX誘導(dǎo)心臟毒性的抗凋亡作用。有證據(jù)表明細(xì)胞凋亡和程序性細(xì)胞死亡是DOX誘導(dǎo)心臟毒性至關(guān)重要的一個(gè)環(huán)節(jié)[28]。細(xì)胞凋亡在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中受到一系列蛋白質(zhì)的調(diào)控，BCL-2家族在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[29]。BCL-2蛋白家族是線粒體驅(qū)動(dòng)的內(nèi)源性凋亡[30]和下游半胱天冬酶活化（Caspase）的主要調(diào)節(jié)劑，包括促凋亡（Bax）和抗凋亡（BCL-2和BCL-xl）蛋白[31]。本課題研究結(jié)果顯示，DOX導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞凋亡程度加重，這一點(diǎn)可以通過Caspase-3、Caspase-9活性和Bax表達(dá)增強(qiáng)以及Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)降低來體現(xiàn)。這些結(jié)果與其他研究一致[32-35]。重要的是，大黃素治療顯著改善了DOX誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡，這可以通過Caspase-3、Caspase-9活性和Bax表達(dá)降低以及Bcl-2、Bcl-xl表達(dá)水平恢復(fù)來證明。這些都有助于DOX誘導(dǎo)心臟毒性的改善。

miRNA可以與靶基因的3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)[36]。越來越多的證據(jù)表明miRNA是治療心臟疾病的潛在藥物靶點(diǎn)。研究顯示miR-410-3p可加劇心臟肥大的發(fā)生發(fā)展過程[37]。此外，據(jù)報(bào)道m(xù)iR-499-5p和miR-17-5p在DOX誘導(dǎo)的心臟毒性中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用[38-39]。文獻(xiàn)顯示，DOX誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中miR-29a-5p表達(dá)水平顯著升高，可能是治療DOX誘導(dǎo)的心臟毒性的新靶點(diǎn)[8]。因此，對(duì)miR-29a-5p抑制劑的篩選為治療DOX誘導(dǎo)的心臟毒性提供了更多的潛在候選藥物。我們的工作顯示大黃素顯著抑制了miR-29a-5p表達(dá)水平，同時(shí)抗凋亡蛋白VEGFB的表達(dá)顯著增加。在轉(zhuǎn)染miR-29a-5p模擬物和抑制劑后，VEGFB的表達(dá)分別出現(xiàn)了降低和升高，表明VEGFB是miR-29a-5p的靶基因。此外，轉(zhuǎn)染miR-29a-5p模擬物后，給予DOX處理的H9C2細(xì)胞活力與凋亡蛋白VEGFB表達(dá)水平降低更為明顯。然而，與MIMIC+DOX組相比，大黃素顯著提高了H9C2細(xì)胞的活力，上調(diào)了VEGFB水平，表明大黃素逆轉(zhuǎn)了miR-29a-5p模擬物的作用，證明大黃素能夠?qū)iR-29a-5p/VEGFB信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)控作用并抑制H9C2細(xì)胞凋亡。

大量研究也證明，DOX誘導(dǎo)心臟毒性的潛在機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[40]?？寡趸瘎┡c活性氧（ROS）之間的失衡是產(chǎn)生氧化應(yīng)激重要的原因之一[41]。內(nèi)源性抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽（GSH）在心臟中表達(dá)水平較低，所以更易受到DOX誘導(dǎo)的氧化損傷[42]。我們的結(jié)果顯示，大黃素顯著下調(diào)了DOX引起的ROS水平升高的情況，同時(shí)提高了SOD、GSH、GSH-Px等抗氧化酶水平。此外，大黃素可以顯著降低脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA的表達(dá)水平。這些結(jié)果均表明大黃素顯著減輕了DOX誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞氧化損傷。不足的是，我們的研究僅對(duì)大黃素對(duì)抗DOX誘導(dǎo)的心肌氧化損傷進(jìn)行了表型的探索，尚未對(duì)其深層機(jī)制進(jìn)行探討，miR-29a-5p/VEGFB途徑是否能夠調(diào)控氧化應(yīng)激以及氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系均是日后需要解決的關(guān)鍵問題。

綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明大黃素通過調(diào)節(jié)miR-29a-5p/VEGFB介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡顯著降低了DOX誘導(dǎo)的心臟毒性，同時(shí)大黃素還展現(xiàn)出很強(qiáng)的清除ROS的能力。這些都證明了大黃素的臨床治療潛力。當(dāng)然，這種天然產(chǎn)物對(duì)抗DOX引起的心臟毒性的深層機(jī)制和臨床應(yīng)用仍需要進(jìn)一步探究。