基于植物代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測雞骨草藥材的質(zhì)量標(biāo)志物*

徐月陽，史軍杰，彭麗華，方碧煙，陳煒璇，成金樂**

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心/嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510006；3.國家中成藥工程技術(shù)研究中心 南藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510006；4.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司 中山 528437）

雞骨草為豆科植物廣州相思子Abrus cantoniensisHance的干燥全株，始載于《嶺南采藥錄》，別名黃頭草、黃仔強(qiáng)。其味甘、微苦，性涼，歸肝、胃經(jīng)，具有利濕退黃、清熱解毒、疏肝止痛的功效，用于治療濕熱黃疸、脅肋不舒、胃脘脹痛、乳癰腫痛[1]等癥。雞骨草主要分布于廣東、廣西壯族自治區(qū)、福建及海南等地區(qū)，含有多種化學(xué)成分，如氨基酸、酚類、強(qiáng)心苷、三萜類、黃酮類、香豆素類、生物堿類、植物甾醇、多糖類等，其中生物堿類、黃酮類、三萜類是其主要化學(xué)成分[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，雞骨草具有抗癌、抗菌、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、降脂保肝、增強(qiáng)免疫等作用[4-9]。在臨床上與其他中藥配伍還可以應(yīng)用于治療慢性肝炎、黃疸型肝炎、膽囊炎、肝硬化腹水、母兒ABO血型不合[10-14]等疾病。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的概念在2016年由劉昌孝院士提出[15]，近年來，在中藥材、中藥飲片、中藥復(fù)方的研究中廣泛應(yīng)用，其從傳遞與溯源、成分特有性、有效性、可測性以及復(fù)方配伍5個(gè)方面開展科學(xué)研究[16]，為中藥全程質(zhì)量控制研究提供了新的研究思路。植物代謝組學(xué)是采用液質(zhì)、氣質(zhì)、核磁等技術(shù)方法通過對藥用植物的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，從整體上探討藥用植物化學(xué)成分的分布規(guī)律[17]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)技術(shù)結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)將藥物作用與生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)整合，綜合分析在網(wǎng)絡(luò)中藥物與節(jié)點(diǎn)或網(wǎng)絡(luò)模塊的關(guān)系，具有整體性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)，在中藥學(xué)領(lǐng)域中可應(yīng)用于闡述中藥多成分和多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系、篩選中藥的活性成分、闡述中藥藥效作用機(jī)制等[18]。

雞骨草作為藥食同源品種在民間廣泛應(yīng)用，《中國藥典》2020年版中，雞骨草僅以浸出物等作為質(zhì)量控制指標(biāo)[1]，缺乏活性成分的含量測定指標(biāo)，且目前對雞骨草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道較少。因此，本研究結(jié)合中藥的Q-Marker理念，基于植物代謝組學(xué)、多元統(tǒng)計(jì)學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法預(yù)測雞骨草藥材的潛在Q-Marker，以期為雞骨草藥材的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器與軟件

M150型中藥磨粉機(jī)（金華市旋風(fēng)藥材機(jī)械廠）；UPLC-QTOF-MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：ACQUITY UPLC HClass型超高效液相色譜串聯(lián)Xevo G2-XS QTOF型四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國waters公司）；UNIFI Portal工作站（美國waters公司）；KQ-700DE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204型萬分之一、MS105型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SPSS26.0軟件（美國IBM公司）；SIMCA14.1軟件（瑞典Umetrics公司）；TBtools軟件（https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）；Openbabel 3.1.1軟件（https://openbabel.org/wiki/Main_Page）；Cytoscape 3.8.2 軟件（Cytoscape Consortium； https:// cytoscape.org/）；Pymol 2.4.0軟件（美國Schrodinger公司；https://github.com/schrodinger/pymol-open-source），AutoDock 4.2.6軟件（美國Scripps研究所；https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/）。

1.2 試劑與試樣

甲醇、乙腈（質(zhì)譜級(jí)，美國默克公司）；水（屈臣氏，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲酸（質(zhì)譜級(jí)，德國默克公司）；葫蘆巴堿（純度：98%，上海源葉生物科技有限公司）；維采寧-2（批號(hào)：PS012054，純度：98.0%）；下箴刺桐堿（批號(hào)：PS000241，純度：98.0%）；異夏佛塔苷（批號(hào)：PS001083，純度：98.0%）均購自成都普思生物科技股份有限公司；相思子堿（批號(hào)：111808-202003）；夏佛塔苷（批號(hào)：111912-201703，純度：95.6%）均購自中國食品藥品鑒定研究院；實(shí)驗(yàn)用11批次雞骨草藥材采集于主產(chǎn)地廣西壯族自治區(qū)靈山、平南等地，經(jīng)中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司賈世清中藥師鑒定為豆科植物廣州相思子（Abrus cantoniensisHance），藥材來源信息詳見表1。

表1 11批次雞骨草藥材來源信息

2 方法

2.1 雞骨草藥材供試品和對照品溶液的制備

取雞骨草藥材適量，粉碎，過3號(hào)篩，精密稱取粉末1 g，置150 mL的具塞錐形瓶中，加入30%甲醇15 mL，精密稱定重量，超聲提取45 min（功率560 W，頻率40 kHz），冷卻，再稱定重量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，倒入50 mL的離心管中，離心5 min（9000 r·min-1），取上清液2 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

用十萬分之一電子天平精密稱取葫蘆巴堿、維采寧-2、相思子堿、下箴刺桐堿、夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品適量，分別置于10 mL的容量瓶中，后用甲醇定容至刻度線，超聲處理15 min，得對照品濃度依次為0.988 mg·mL-1、1.167 mg·mL-1、1.201 mg·mL-1、1.370 mg·mL-1、1.089 mg·mL-1、1.182 mg·mL-1的對照品儲(chǔ)備液，于4℃貯藏，備用。取配置好的對照品儲(chǔ)備溶液各1 mL于20 mL的容量瓶中，后加甲醇定容至刻度線，混勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得葫蘆巴堿濃度為49.40 μg·mL-1、維采寧-2濃度為58.35 μg·mL-1、相思子堿濃度為60.05 μg·mL-1、下箴刺桐堿濃度為68.50 μg·mL-1、夏佛塔苷濃度為54.45 μg·mL-1、異夏佛塔苷濃度為59.10 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）色譜柱；ACQUITY UPLC柱在線過濾器；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?-8 min:0%-8%（A）；8-10 min:8%-12%（A）；10-18 min:12%-19%（A）；18-20 min:19%-24%（A）；20-32 min:24%-38%（A）；32-41 min: 38%-52%（A）；41-45 min: 52%-67%（A）；45-60 min:67%-90%（A）；60-63 min:90%-0%；63-70 min:0%-0%（A）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），毛細(xì)管電壓：3.0 kV（ESI+），離子源溫度：140℃，錐孔電壓：40 V，錐孔氣流速：50 L·h-1，脫溶劑氣溫度：450℃，脫溶劑氣流速：800 L·h-1，高能量通道碰撞電壓：20-40 eV，低能量通道碰撞電壓：6 eV，質(zhì)量掃描范圍100-1200 m·z-1，采用亮氨酸-腦啡肽進(jìn)行精確質(zhì)量校正（[M-H]-為554.2620，[M+H]+為556.2766）。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取適量雞骨草藥材，按2.1項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，并按2.2項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行測定，計(jì)算6個(gè)已知化學(xué)成分（與對照品比對）的保留時(shí)間和響應(yīng)值的RSD值分別為0.1%-0.4%和1.62%-3.35%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一雞骨草樣品適量，按2.1項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，平行制備6份，并按2.2項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算6個(gè)已知化學(xué)成分（與對照品比對）的保留時(shí)間和響應(yīng)值的RSD值分別為0.11%-0.13%和1.75%-5.24%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量雞骨草藥材，按2.1項(xiàng)下供試品制備方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h下按2.2項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算6個(gè)已知化學(xué)成分（與對照品比對）的保留時(shí)間和響應(yīng)值的RSD值分別為0.61%-1.22%和2.31%-4.99%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 雞骨草化合物鑒定解析

2.4.1 雞骨草化合物的檢索和整理

利用中國知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）、PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SciFinder（https://scifinder-n.cas.org/）、PubMed（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、ChemSpider（http://www.chemspider.com/）等網(wǎng)站檢索雞骨草化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)，收集文獻(xiàn)中有關(guān)雞骨草化學(xué)成分的分子式、CAS號(hào)、化學(xué)名等信息匯總到Excel表格中，共103個(gè)化合物信息。登錄SciFinder網(wǎng)站，根據(jù)收集到的有關(guān)雞骨草化學(xué)成分的CAS號(hào)檢索化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式，下載結(jié)構(gòu)式的mol文件格式，將化學(xué)成分Excel信息表和結(jié)構(gòu)式文件放入同一個(gè)文件夾中導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件中，補(bǔ)充UNIFI軟件本地中藥數(shù)據(jù)庫的雞骨草化學(xué)成分信息。

2.4.2 11批次雞骨草藥材化學(xué)成分的鑒定分析

按照“2.2”項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣后，得到11批次雞骨草藥材樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，后將質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過UNIFI軟件處理，與文獻(xiàn)收集的成分和本地雞骨草數(shù)據(jù)庫化學(xué)成分信息比對，設(shè)置鑒定參數(shù)為響應(yīng)值≥5000，質(zhì)量差≤5 ppm，并進(jìn)一步通過對照品及文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)比對精確分子質(zhì)量、特征碎片離子、保留時(shí)間等信息進(jìn)行鑒定。將所鑒定的成分結(jié)果導(dǎo)出并匯總到Excel表中，通過分析11批次雞骨草藥材的化學(xué)成分，篩選得到共有成分。為了比較不同批次間所含共有成分的含量差異，利用TBtools軟件根據(jù)其響應(yīng)值對成分進(jìn)行熱圖分析。

2.5 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS26.0軟件，以11批次雞骨草藥材中共有成分的響應(yīng)值為變量，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，選用Ward聯(lián)結(jié)法作為聚類方法，以平方歐式距離計(jì)算測量區(qū)間，進(jìn)行聚類分析。利用SIMCA14.1軟件，以11批次雞骨草藥材中共有成分的響應(yīng)值為變量進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis，OPLS-DA），找出造成雞骨草藥材分類的主要含量差異成分。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.6.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測

通過PubChem網(wǎng)站查詢上述主要含量差異成分的smiles號(hào)，將smiles號(hào)輸入Swiss ADME數(shù)據(jù)庫（http://www.swissadme.ch/）中以判斷其是否具有活性，以胃腸道吸收（GI absorption）顯示為“High”，類藥性（Druglikeness）項(xiàng)下的5個(gè)參數(shù)（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）至少滿足兩個(gè)“Yes”為標(biāo)準(zhǔn)篩選出符合條件的潛在活性成分。將潛在活性成分的smiles號(hào)輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）中設(shè)置物種為“Homo sapiens”進(jìn)行預(yù)測，以表格中“Probability＞0”作為篩選標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測化合物的靶點(diǎn)信息。

2.6.2 “含量差異潛在活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

在Excel表中整理11批次雞骨草藥材中含量差異潛在活性成分和潛在靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)信息表及類型表，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行繪制“含量差異潛在活性成分-潛在靶點(diǎn)”的網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6.3 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析（Protein-Protein Interaction，PPI）及核心靶點(diǎn)篩選

為了進(jìn)一步篩選出核心靶點(diǎn)，在STRING數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）中導(dǎo)入上述潛在靶點(diǎn)信息的基因名，物種選擇“Homo sapiens”，將獲得的PPI數(shù)據(jù)下載其信息文件后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行繪制PPI圖，使用軟件工具中的“Analyze Network”分析其拓?fù)鋮?shù)，下載信息表并用Excel表處理，計(jì)算靶點(diǎn)信息的Degree值和Betweenness Centrality（中介中心性）值的中位數(shù)，以同時(shí)滿足大于等于兩者2倍中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶點(diǎn)。

2.6.4 核心靶點(diǎn)的基因本體（Gene ontology，GO）功能富集分析與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

在Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）中上傳核心靶點(diǎn)的基因名，物種選擇“H.sapiens”，點(diǎn)擊“Custom Analysis”，在“Enrichment”界面分別進(jìn)行GO分析和KEGG分析，點(diǎn)擊Analysis Report Page，下載所有的注釋結(jié)果（All in One Zip），根據(jù)所得結(jié)果繪制GO分析柱狀圖及KEGG分析氣泡圖。

2.6.5 “核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

篩選出富集核心靶點(diǎn)蛋白較多的前20條信號(hào)通路，在Excel表中整理核心靶點(diǎn)相關(guān)的前20條核心通路和涉及相關(guān)核心成分的網(wǎng)絡(luò)信息表及類型表，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行繪制“核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6.6 分子對接驗(yàn)證

以上述“核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名靠前的兩個(gè)核心成分為配體，在PubChem網(wǎng)站中下載其3D結(jié)構(gòu)的sdf文件格式，并在Openbabel 3.1.1軟件中轉(zhuǎn)換sdf格式為pdb格式。以網(wǎng)絡(luò)圖中Degree值排名前五的核心靶點(diǎn)作為受體，并在RCSB PDB網(wǎng)站（https://www.rcsb.org/）中下載核心靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)的pdb文件。利用Pymol 2.4.0軟件對核心靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水、去配體處理，用AutoDock 4.2.6軟件對配體和處理過的受體進(jìn)行加氫、加電荷等操作，并進(jìn)行分子對接，以獲得最佳活性位點(diǎn)，得到配體與受體的結(jié)合能。并將2個(gè)核心成分最優(yōu)結(jié)合模式的對接結(jié)果導(dǎo)入Pymol 2.4.0軟件，繪制成三維圖進(jìn)行可視化展示。

3 結(jié)果

3.1 雞骨草化學(xué)成分分析

通過對11批次雞骨草藥材的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定分析，將所鑒定的成分結(jié)果導(dǎo)出并匯總到Excel表中，篩選得到39個(gè)共有成分，以ACH1樣品為例，總離子流圖見圖1，共有化學(xué)成分鑒定結(jié)果詳見表2，分別為17個(gè)三萜皂苷類、10個(gè)黃酮類、3個(gè)異黃烷醌類、2個(gè)生物堿類、2個(gè)色原酮類、2個(gè)醇類、1個(gè)氨基酸類、1個(gè)蒽醌類、1個(gè)三萜類成分。通過熱圖分析（見圖2），圖中顏色越深表示響應(yīng)值越大，從圖中看出Soyasaponin I、Quebrachitol、Abrine、Isoschaftoside、Isobiflorin、Hypaphorine、Schaftoside、Biflorin、Arginine這9個(gè)化學(xué)成分在不同批次間成分含量均較高。

圖1 雞骨草ACH1樣品的UPLC-Q-TOF-MSE總離子流圖

圖2 11批次雞骨草藥材中39個(gè)共有成分的熱圖分析

表2 11批次雞骨草藥材的共有成分

3.2 多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3.2.1 聚類分析

利用SPSS26.0軟件，以11批次雞骨草藥材中39個(gè)共有成分的響應(yīng)值為變量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3，當(dāng)平方歐式距離為15時(shí)，11批次雞骨草樣品被分為4類，ACH1、2、3、4聚為一類，ACH5為一類，ACH6、9、10、11聚為一類。ACH7、8聚為一類，說明不同來源雞骨草藥材之間存在一定的差異。

圖3 11批次雞骨草藥材的聚類分析圖

3.2.2 主成分分析和正交偏最小二乘判別分析

利用SIMCA14.1軟件，以11批次雞骨草藥材中39個(gè)共有成分的響應(yīng)值為變量進(jìn)行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，結(jié)果見圖4和圖5所示，圖中不同顏色的圓點(diǎn)代表不同產(chǎn)地的雞骨草藥材，主成分分析計(jì)算結(jié)果顯示4個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為83.7%，且從圖中看出可以將11批次雞骨草藥材分為4類，ACH1、2、3、4為一類，ACH5為一類，ACH6、9、10、11為一類。ACH7、8為一類，分類結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致。為進(jìn)一步找出造成分類差異的因素，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，模型的主成分回歸系數(shù)Q2Y＝0.628＞0.5，說明模型的預(yù)測能力較強(qiáng)，反映樣本具明確分離的趨勢；R2Y＝0.919，說明模型對因變量變異貢獻(xiàn)的百分比為91.9%，模型的擬合度較好，對建立的模型進(jìn)行200次的置換檢驗(yàn)，得到Q2回歸線的截距為負(fù)值（見圖6），表明所構(gòu)建的OPLS-DA模型具有較好的預(yù)測能力及有效可用。從OPLS-DA圖中提取重要性變量的VIP（Variable Importance for the Projection）值，結(jié)果見圖7，對其變量的VIP值進(jìn)行排序，顯示化學(xué)成分Quebrachitol（2.335 98）、Arginine（2.209 89）、Abrine（1.997 67）、Isobiflorin（1.925 93）、SoyasaponinⅠ（1.809 06）、Hypaphorine（1.759 42）、Isoschaftoside（1.668 29）、Biflorin（1.579 85）、Schaftoside（1.532 21）的VIP值大于1，結(jié)合上述熱圖分析結(jié)果表明雞骨草藥材中以上9個(gè)化學(xué)成分的含量差異是影響11批次雞骨草藥材分類的主要因素。

圖4 11批次雞骨草藥材PCA-X得分圖

圖5 11批次雞骨草藥材OPLS-DA得分圖

圖6 OPLS-DA模型的排列檢驗(yàn)圖

圖7 11批次雞骨草藥材共有成分的VIP得分圖

3.3 含量差異成分的活性篩選與靶點(diǎn)預(yù)測

利用Swiss ADME數(shù)據(jù)庫以判斷上述9個(gè)含量差異成分是否具有活性，結(jié)果這9個(gè)化合物均為潛在活性成分。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測這9個(gè)潛在活性成分的靶點(diǎn)信息，預(yù)測出的靶點(diǎn)刪除重復(fù)值后共得到166個(gè)靶點(diǎn)信息。

3.4 含量差異潛在活性成分的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將9個(gè)潛在活性成分及166個(gè)潛在靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，構(gòu)建“含量差異潛在活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖如圖8所示，并進(jìn)行“Analyze Network”分析其拓?fù)鋮?shù)，圖中共產(chǎn)生了175個(gè)節(jié)點(diǎn)，223條邊，其中紅色代表活性成分，藍(lán)色代表靶點(diǎn)基因。每個(gè)成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)平均作用于2個(gè)成分，存在多成分多靶點(diǎn)相互作用的現(xiàn)象。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)以度值（Degree）計(jì)算，Degree值表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與靶點(diǎn)相連的邊數(shù)，Degree值越大，其節(jié)點(diǎn)形狀越大，顏色越深，進(jìn)一步說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中的作用大。從圖中看出Hypaphorine（degree 103）、Abrine（degree 71）這2個(gè)成分作用的靶點(diǎn)多，影響大。

圖8 “含量差異潛在活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

3.5 蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將上述9個(gè)潛在活性成分的166個(gè)潛在靶點(diǎn)信息的基因名導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI分析，結(jié)果獲得159個(gè)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)互作信息，下載其信息文件后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行繪制PPI圖，通過分析其拓?fù)鋮?shù)，以同時(shí)滿足大于等于靶點(diǎn)信息的Degree值和Betweenness Centrality值的中位數(shù)的2倍為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶點(diǎn)，結(jié)果見圖9，共篩選出29個(gè)核心靶點(diǎn)（見表3）。

圖9 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)互作核心靶點(diǎn)篩選圖

表3 29個(gè)核心靶點(diǎn)信息

3.6 GO功能和KEGG通路分析結(jié)果

利用Metascape數(shù)據(jù)庫對29個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG分析，GO分析包括生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）3個(gè)部分，GO分析共富集480個(gè)條目，其中BP有368個(gè)條目，主要富集在血管發(fā)育、細(xì)胞激活、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移酶活性等過程，CC有61個(gè)條目，主要富集在膜筏、膜微區(qū)、突觸膜等區(qū)域，MF有51個(gè)條目，主要富集在蛋白激酶結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等功能，分別選取BP、CC、MF的LogP值最小的排名前10的條目繪制柱狀圖（見圖10）。KEGG分析共富集了86條通路，主要涉及的通路有癌癥通路（Pathways in cancer）、血脂和動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、肺小細(xì)胞癌（Small cell lung cancer）、軸突引導(dǎo)（Axon guidance）、糖尿病并發(fā)癥AGR受體信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）等，通過Excel表處理選取LogP值最小的排名前20的核心通路并繪制氣泡圖（見圖11），結(jié)果表明，雞骨草藥材中的化學(xué)成分通過作用于多靶點(diǎn)進(jìn)而調(diào)控多條通路從而發(fā)揮治病療效。

圖10 GO功能富集分析柱狀圖

圖11 KEGG通路富集分析氣泡圖

3.7 雞骨草“核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)分析

將29個(gè)核心靶點(diǎn)相關(guān)的前20條核心通路和涉及的4個(gè)核心成分分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2 軟件進(jìn)行繪制“核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見圖12，圓形代表核心成分，菱形代表靶點(diǎn)，V形代表通路，共有53個(gè)節(jié)點(diǎn)，178條邊，并進(jìn)行“Analyze Network”分析其拓?fù)鋮?shù)，結(jié)果顯示，Degree值較大的前兩個(gè)成分為Hypaphorine（degree 17）、Abrine（degree 12），前兩個(gè)靶點(diǎn)為PIK3CA（degree 20）、JUN（degree 13）、前兩個(gè)通路為Pathways in cancer（degree 15）、Lipid and atherosclerosis（degree 10）。雞骨草具有清熱解毒的功效，清熱解毒類中藥大多具有抗腫瘤的作用[19]，通過提取主要的節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)（見圖13），Hypaphorine通過作用于PIK3CA、ITGB1、PTGS2、MMP9、PPARG、CXCL8、RHOA靶點(diǎn)及Abrine作用于CTNNB1、CDK2、NOS2靶點(diǎn)進(jìn)而對癌癥通路產(chǎn)生作用，從而發(fā)揮雞骨草清熱解毒的功效。Hypaphorine還通過作用于PIK3CA、ITGB1靶點(diǎn)及Abrine作用于CDK2靶點(diǎn)進(jìn)而對PI3K-Akt信號(hào)通路產(chǎn)生作用。PI3K-Akt信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞的基本進(jìn)程，其中包括細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖及糖原代謝等，相關(guān)研究表明PI3K-Akt信號(hào)通路在癌癥如胰腺癌[20]、胃癌[21-22]、肝癌[23]、宮頸癌[24]等，糖脂代謝[25-26]，帕金森癥[27]，肌少-骨質(zhì)疏松癥[28]等發(fā)揮重要作用。并且從圖12中顯示Hypaphorine作用于PIK3CA、CXCL8、MMP9靶點(diǎn)及Abrine作用于CDK2靶點(diǎn)也對乙型肝炎信號(hào)通路產(chǎn)生作用，結(jié)合雞骨草疏肝止痛的功效作用進(jìn)一步說明下箴刺桐堿（Hypaphorine）和相思子堿（Abrine）為雞骨草藥材的主要活性成分。

圖12 “核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”網(wǎng)絡(luò)圖

圖13 核心網(wǎng)絡(luò)圖

3.8 分子對接結(jié)果

以上述核心網(wǎng)絡(luò)圖中相思子堿和下箴刺桐堿為配體，核心靶點(diǎn)PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1為受體，將這2個(gè)核心成分與5個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表4，根據(jù)文獻(xiàn)研究表明[29]，結(jié)合能＜0表示配體和靶點(diǎn)蛋白能自發(fā)進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合能≤-4.0 kcal·mol-1表示配體和靶點(diǎn)蛋白具有較好的結(jié)合活性，數(shù)值越低結(jié)合強(qiáng)度越大。相思子堿與核心靶點(diǎn)RHOA、ITGB1及下箴刺桐堿與核心靶點(diǎn)RHOA、ITGB1、JUN的結(jié)合能均小于-4.0 kcal·mol-1，使用Pymol 2.4.0軟件對相思子堿和下箴刺桐堿與核心靶點(diǎn)蛋白R(shí)HOA得到的最優(yōu)結(jié)合模式進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖14，表明雞骨草藥材中相思子堿和下箴刺桐堿具有較好的生物活性。

圖14 成分與靶點(diǎn)分子對接圖

表4 成分與核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能

4 Q-Marker的預(yù)測分析

本研究通過對11批次雞骨草藥材的共有成分進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得了造成多批次雞骨草藥材分類的主要含量差異性成分，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，建立“核心成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，大豆皂苷I（Soyasaponin Ⅰ）為豆科植物中常見的化學(xué)成分[30]，精氨酸（Arginine）在植物中廣泛存在均不易作為雞骨草藥材的Q-marker。根據(jù)度值的大小，相思子堿和下箴刺桐堿在網(wǎng)絡(luò)圖中起主要作用，且通過液質(zhì)分析表明11批次雞骨草藥材中相思子堿和下箴刺桐堿的響應(yīng)值均較高，為不同來源11批次雞骨草藥材所共有，這兩個(gè)成分通過作用靶點(diǎn)進(jìn)而對與雞骨草藥材清熱解毒、疏肝止痛功效相關(guān)的通路產(chǎn)生作用。并根據(jù)Q-Marker理念中的可測性、有效性結(jié)合文獻(xiàn)研究對這2個(gè)化合物進(jìn)行分析，黃平等[31]采用反相高效液相色譜法，色譜柱選用Kromasil C18，以甲醇-乙腈-水-冰醋酸-三乙胺為流動(dòng)相，檢測波長為220 nm，流速為1.0 mL·min-1，建立了雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿的含量測定方法。徐柯心等[32]采用超高效液相色譜法，選用色譜柱為HSS T3柱，以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長為270 nm，建立了能同時(shí)測定雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿的含量測定方法，體現(xiàn)了所預(yù)測的雞骨草藥材Q-Marker的可測性。鐘正賢等[33]、陳學(xué)芬等[34]將雞骨草提取物中分離出的相思子堿和下箴刺桐堿分別作用于小鼠耳廓腫脹、小鼠肝損傷及黃疸小鼠模型，結(jié)果表明相思子堿和下箴刺桐堿均能明顯減少小鼠耳廓腫脹的重量，能降低肝損傷小鼠和黃疸小鼠模型血清中的總膽紅素含量及轉(zhuǎn)氨酶活性，還通過測定其對小鼠溶血素抗體生成的影響，發(fā)現(xiàn)相思子堿和下箴刺桐堿均能增加免疫器官胸腺、脾臟的重量，表明相思子堿和下箴刺桐堿具有抗炎、退黃降酶、抗肝損傷及免疫增強(qiáng)的作用，體現(xiàn)了所預(yù)測的雞骨草藥材Q-Marker的有效性。以上文獻(xiàn)研究為所預(yù)測雞骨草藥材的Q-Marker提供了有利依據(jù)，也進(jìn)一步表明所預(yù)測雞骨草藥材Q-Marker的合理性。

5 討論

中藥質(zhì)量是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的生命線，中藥質(zhì)量的好壞在中醫(yī)發(fā)揮臨床療效的方面至關(guān)重要，中藥作為天然產(chǎn)品，其質(zhì)量受諸多因素的影響。因此，為保證生產(chǎn)出質(zhì)量優(yōu)良且療效穩(wěn)定的中藥品種，需要建立科學(xué)的質(zhì)量評價(jià)體系，中藥質(zhì)量標(biāo)志物（QMarker）的提出，為中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制研究提供了新的科研思路。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS方法分析11批次雞骨草藥材的化學(xué)成分，獲得39個(gè)共有成分，主要為三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類成分。雞骨草中皂苷類成分具有抗肝癌、抗乙型病毒性肝炎、保護(hù)化學(xué)性及免疫性肝損傷等[35-37]作用，黃酮類成分具有抗氧化、保護(hù)肝損傷、防治胃潰瘍等[38-40]作用，生物堿類成分具有抗炎、退黃降酶、抗肝損傷及免疫增強(qiáng)的作用[33-34]。以共有成分作為Q-Marker的備選成分，先以共有成分的響應(yīng)值為變量進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，初步篩選出影響多批次雞骨草藥材分類的主要9個(gè)化學(xué)成分，且這9個(gè)化學(xué)成分在雞骨草藥材中的含量均較高選為QMarker的候選化學(xué)成分，后進(jìn)一步通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合文獻(xiàn)研究預(yù)測相思子堿和下箴刺桐堿為雞骨草藥材的Q-Marker。Q-Marker相思子堿和下箴刺桐堿，均具有抗炎、退黃降酶、抗肝損傷及免疫增強(qiáng)的作用。

核心靶點(diǎn)PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1與雞骨草Q-Marker抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗肝癌作用等相關(guān)。核心靶點(diǎn)PIK3R1與癌癥、免疫缺陷、發(fā)育障礙有關(guān)[41]，CTNNB1與結(jié)直腸癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌相關(guān)，JUN與惡性腫瘤相關(guān)，RHOA與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)，ITGB1與促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、食管癌相關(guān)[42-43]。分子對接驗(yàn)證了雞骨草Q-Marker與核心靶點(diǎn)PIK3CA、JUN、RHOA、ITGB1、CTNNB1均能自發(fā)進(jìn)行結(jié)合，并與RHOA、ITGB1有較好的結(jié)合活性，理論上證實(shí)了Q-Marker較好的生物活性，且這些核心靶點(diǎn)作用于與雞骨草藥材清熱解毒功效相關(guān)的主要核心通路癌癥通路（Pathways in cancer）?；虮倔w富集分析中生物過程主要涉及細(xì)胞激活、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控、正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移酶活性等；分子功能涉及蛋白激酶結(jié)合，配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等；細(xì)胞組成主要為膜筏、膜微區(qū)、突觸膜等。由此可知核心靶點(diǎn)、核心通路、Q-Marker存在緊密的相關(guān)性，后期可在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究證明其關(guān)聯(lián)性。

本研究首次結(jié)合植物代謝組學(xué)、多元統(tǒng)計(jì)學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從化學(xué)、數(shù)理統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)的角度預(yù)測分析了雞骨草藥材的Q-Marker，后結(jié)合文獻(xiàn)證明其合理性，為雞骨草藥材及相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升和質(zhì)量控制研究提供了科學(xué)依據(jù)。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果所獲得的靶點(diǎn)和通路，可為后續(xù)雞骨草藥材的藥效和藥理作用機(jī)制研究提供參考。