基于轉(zhuǎn)錄組的黨參NBS-LRR家族基因鑒定及表達(dá)分析*

趙光輝，董林林，寧康，懷浩，程宇飛，張娟，郭笑彤**

（1.魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院 煙臺(tái) 264025；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

黨參（CODONOPSIS RADIX）是我國(guó)常用的補(bǔ)氣益血的中藥材，為桔?？撇荼局参稂h參（Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.）、素花黨參Codonopsis pilosulaNannf.var.modesta （Nannf.）L.T.Shen或川黨參Codonopsis tangshenOliv.的干燥根，含有多糖、炔苷類、生物堿類、黃酮類、木質(zhì)素類等多種活性成分，在調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)糖代謝、延緩衰老、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)胃腸黏膜等方面發(fā)揮重要作用，主要用于治療氣血不足、脾胃虛弱、食少疲乏等[1]。2020年1月6日，國(guó)家衛(wèi)生健康委、國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局聯(lián)合發(fā)布了《關(guān)于對(duì)黨參等9種物質(zhì)開(kāi)展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)工作的通知》，對(duì)甘肅黨參定義為藥食同源物質(zhì)并展開(kāi)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)試點(diǎn)工作。

隨著黨參市場(chǎng)需求的逐漸增加，黨參的種植面積也持續(xù)擴(kuò)大。然而連作障礙問(wèn)題日益突出，導(dǎo)致黨參病害泛濫，嚴(yán)重制約黨參產(chǎn)業(yè)發(fā)展，其中根腐病害已經(jīng)成為致使黨參減產(chǎn)的主要原因[2]，而尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是黨參根腐病的主要致病菌[3]。目前主要通過(guò)栽培管理措施優(yōu)化和化學(xué)農(nóng)藥噴施等方法來(lái)減少黨參病害的發(fā)生[3-4]，但是效果并不理想。因此，高抗病的黨參新品種培育是解決黨參根腐病害難題的迫切需要，而抗病機(jī)制解析是黨參優(yōu)良高抗新品種培育的前提條件之一。

在植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)化過(guò)程中，常受各類病原微生物的威脅，產(chǎn)生一系列的免疫調(diào)控反應(yīng)[5]。在植物的免疫反應(yīng)過(guò)程中，抗病基因R在抵御病原菌入侵的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6-8]。目前已經(jīng)有100多種植物的抗病基因被克隆出來(lái)，如大豆[9-10]、谷子[11]、馬鈴薯[12]、擬南芥[13]、大麥[14]、甘藍(lán)[15]、水稻[16]等。植物的抗病基因家族蛋白具備一些共有的結(jié)構(gòu)域，包括卷曲螺旋（Coiled-coil，CC），核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（Nucleotide-binding sites，NBS），Toll-白介素-1受體（Toll-interleukin-1 receptor，TIR），富含亮氨酸的重復(fù)單元（Leucine-rich repeat，LRR）等[17]。根據(jù)這些抗病基因不同的結(jié)構(gòu)域?qū)⒅参锏目共』騌所編碼的蛋白分為5類，其中NBS-LRR家族基因數(shù)目最多[18]，具有重要的研究意義。NBS-LRR家族根據(jù)N端的結(jié)構(gòu)不同分為T(mén)IR類（含TIR結(jié)構(gòu)域）和Non-TIR類（含有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)CC或其他特殊結(jié)構(gòu)）[17]。有研究把NBS-LRR家族成員分為T(mén)NL（TIR-NBS-LRR）、CNL（CC-NBS-LRR）和RNL（RPW8-NBS-LRR）三個(gè)亞家族[19-20]。NBSLRR家族基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析為植物抗逆機(jī)制解析提供數(shù)據(jù)支撐。在中藥研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)人參NBSLRR家族抗病基因具有明顯的功能分化和器官特異性[21]。本研究針對(duì)黨參NBS-LRR家族中的TNL和CNL兩個(gè)亞家族進(jìn)行分析，通過(guò)研究其編碼蛋白的理化性質(zhì)、研究其基因結(jié)構(gòu)、析系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系、探究抗病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及表達(dá)模式，以闡明黨參NBS-LRR家族基因的特性，為黨參抗病機(jī)制的解析，根腐病害難題的解決和黨參抗病品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 黨參NBS-LRR家族抗病基因鑒定、基因理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

接菌實(shí)驗(yàn)是對(duì)黨參根部接種尖孢鐮刀菌（F.oxysporum），分別于接菌后0、6、24、72、120 h采集黨參根部樣品，提取RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（此實(shí)驗(yàn)為本課題組先前的研究結(jié)果，未發(fā)表，用于解析黨參對(duì)根腐病尖孢鐮刀菌的響應(yīng)機(jī)制）。利用R基因家族Pfam號(hào)在黨參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索PF01582、PF13676（TIR domain）；PF00931（NB-ARC domain）；PF00560、PF12799、PF07723、PF13855、PF13306、PF13516、PF14580（LRR domain）；PF05659（RPW8 domain），獲得黨參抗病家族候選基因ID和基因信息。將候選基因的蛋白序列輸入在線網(wǎng)站NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Web CD-Search Tool（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）以及SMART網(wǎng)站（http://smart.emblheidelberg.de/）使用Sequence analysis工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果分析整理刪除沒(méi)有NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域的基因。使用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）驗(yàn)證預(yù)測(cè)的結(jié)果，按其含有的TIR、CC、LRR不同結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分類整理，得到黨參NBS-LRR家族基因。

對(duì)黨參結(jié)構(gòu)較完整的CNL及TNL類基因分析其理化性質(zhì)、預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位結(jié)果，整理黨參CNL及TNL類基因的編碼蛋白序列，使用在線工具ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/），獲得黨參CNL及TNL類基因的氨基酸數(shù)量（Size）、等電點(diǎn)（pI）以及分子量（Mw）和疏水性（GRAVY）等信息，利用CELLO v2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)黨參CNL及TNL類基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果。

1.2 黨參CNL及TNL亞家族基因motif預(yù)測(cè)

利用MEME網(wǎng)站（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）設(shè)置motif number為10，輸入基因結(jié)構(gòu)序列信息，預(yù)測(cè)黨參TNL及CNL類基因的保守基序蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.3 黨參NBS-LRR家族進(jìn)化分析

使用TBtools在本課題組前期接菌實(shí)驗(yàn)得到的轉(zhuǎn)錄組蛋白庫(kù)中檢索黨參NBS-LRR家族基因ID，得到黨參NBS-LRR家族的蛋白序列。使用MEGA7.0.14對(duì)這些蛋白序列進(jìn)行CLustalW多序列比對(duì)，選擇默認(rèn)參數(shù)分析，用NJ鄰接法（Neighbor-joining method）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，Bootstrap method（步長(zhǎng)檢驗(yàn)）設(shè)置為1000，選擇p-distance模型，方法選擇Partial deletion，程度為50%。通過(guò)在線工具EvolVIew（https://evolgenius.info//evolview-v2/）進(jìn)行黨參NBS-LRR系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的分析美化。

用MEGA7.0.14對(duì)黨參NBS-LRR家族與擬南芥NBS-LRR家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。擬南芥NBSLRR家族通過(guò)TAIR（https://www.arabidopsis.org/）網(wǎng)站在線獲得。

1.4 在尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）脅迫下黨參NBSLRR家族基因的表達(dá)差異分析

利用前期本課題組對(duì)黨參進(jìn)行接菌實(shí)驗(yàn)，并選取0、6、24、72、120 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，取FPKM的平均值，利用聯(lián)川云生物平臺(tái)（https://www.omicstudio.cn/index）繪制熱圖，分析黨參NBS-LRR家族的基因表達(dá)模式。數(shù)據(jù)處理方法為L(zhǎng)og2，數(shù)據(jù)處理按行處理。

1.5 NBS-LRR家族基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

提取黨參NBS-LRR家族的同源擬南芥編碼蛋白序列，利用STRING（https://string-db.org/），獲得與黨參同源擬南芥蛋白的互作蛋白，使用Cytoscape軟件，進(jìn)行黨參與擬南芥NBS-LRR蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參NBS-LRR家族基因鑒定、理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果

基于黨參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及NBS-LRR家族不同結(jié)構(gòu)域，在PF01582（TIR domain）中共檢索到34個(gè)基因；在PF00931（NB-ARC domain）中檢索到123個(gè)基因，在PF00560、PF12799、PF13306、PF13855和PF14580（LRR domain）中檢索到85個(gè)基因；在PF05659（RPW8 domain）中檢索到3個(gè)基因。對(duì)所有篩選到的245個(gè)基因通過(guò)預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)，共鑒定到88個(gè)黨參NBS-LRR家族基因（表1）。其中，N類基因64個(gè)（含N型50個(gè)、NL型14個(gè)），CNL類基因15個(gè)（含CN型1個(gè)、CNL型14個(gè)），TNL類基因7個(gè)（含TN型4個(gè)、TNL型3個(gè)）、PN類基因（含RPW8/NBS結(jié)構(gòu)域）2個(gè)。從整體分析，黨參TNL類基因7個(gè)，約占黨參NBS-LRR家族數(shù)量的8%，CNL類基因數(shù)量15個(gè)，約占NBS-LRR家族的17%，而RNL類基因只有2個(gè)，約占黨參NBS-LRR家族的2%。其中黨參CNL類基因數(shù)目（15個(gè)）約是TNL類基因數(shù)目（7個(gè)）的2倍，這與模式作物擬南芥中的TNL亞家族成員數(shù)目約是CNL亞家族成員數(shù)目的2倍[13]差別較大。黨參CNL亞家族成員數(shù)目大于TNL亞家族數(shù)目，表明在黨參發(fā)育進(jìn)化過(guò)程中，為適應(yīng)環(huán)境增強(qiáng)抗病性，CNL亞家族在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生擴(kuò)增。

表1 黨參NBS-LRR家族基因分類

黨參CNL及TNL類基因理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（表2），前15個(gè)基因?yàn)辄h參CNL類型基因，后7個(gè)為黨參TNL類型基因。黨參NBS-LRR家族基因氨基酸長(zhǎng)度范圍是1161-4800，編碼蛋白的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度范圍為425-4011，氨基酸數(shù)是141-1223，蛋白質(zhì)分子量范圍16 365.91-139 922.52 kDa，等電點(diǎn)是5.17-9.46，總平均疏水指數(shù)為（-0.377）-（-0.121），表明黨參CNL及TNL類蛋白全是親水性蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示黨參CNL及TNL家族蛋白全部定位在細(xì)胞質(zhì)。對(duì)黨參CNL及TNL類基因理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為其功能分析提供研究基礎(chǔ)。

表2 黨參TNL及CNL類基因信息表

2.2 黨參NBS-LRR家族motif預(yù)測(cè)

研究發(fā)現(xiàn)在NBS-LRR家族中，NB-ARC保守域有8個(gè)常見(jiàn)的保守基序分別為P-loop、Kinase2、GLPL、MHDV、RNBS-A、RNBS-B、RNBS-C、RNBS-D[22]。對(duì)黨參NBS-LRR家族中基因結(jié)構(gòu)較完整的CNL及TNL類基因使用MEME工具分析，共預(yù)測(cè)到10個(gè)保守motif（圖1）。Motif 1序列為GSKDVRVISIVGMGGJGK TTJAKKVYN，含GxxxGKT/S序列，符合P-loop的結(jié)構(gòu)模型。Motif 3的氨基酸含有的序列CGGLPLAIVVJGG LL是GLPL保守序列。Motif 5的氨基酸序列為PWFDPGSKIIJTTRNEEVAK，含有的GSxxxTTR是RNBS-B的序列特征。Motif 6是典型的富亮氨酸重復(fù)序列為L(zhǎng)RR結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。Motif 7含有的為KLMMHQLLR DMGREIVRQE序列是MHDV的序列特點(diǎn)。Motif 8的氨基酸序列為JKDALRGKRYLLVLDDVWS，含有的LVVLD序列是與ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的激酶Knase 2的結(jié)構(gòu)單元。Motif 9的氨基酸序列PHRLKLLSEDESWELFCKKAF為RNBS-C結(jié)構(gòu)單元。Motif預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，前14個(gè)基因是黨參CNL類基因，后七個(gè)基因是黨參TNL類基因（圖2）。在黨參CNL類基因中共預(yù)測(cè)到7個(gè)保守motif（不含motif 4，motif 7，motif 10），并以motif 1（P-loop）-motif 8（Kinase2）-motif 5（RNBS-B）-motif 9（RNBS-C）-motif 3（GLPL）-motif 2-motif 6（LRR）的順序排列。有3個(gè)基因沒(méi)有預(yù)測(cè)到LRR結(jié)構(gòu)單元，所有CNL亞家族基因全部含有其它6個(gè)motif。在TNL中共預(yù)測(cè)到了9個(gè)motif（不含motif 2），并以motif 4-motif 10-motif 1（P-loop）-motif 8（Kinase2）-motif 5（RNBS-B）-motif 9（RNBS-C）--motif 3（GLPL）-motif 7（MHDV）-motif 6（LRR）的順序排列，有11個(gè)基因預(yù)測(cè)到LRR結(jié)構(gòu)。motif 4、motif 10為T(mén)NL類基因特有的TIR結(jié)構(gòu)，TNL類基因中有6個(gè)基因含有Motif 7（MHDV），有3個(gè)基因（TNL型）含有LRR結(jié)構(gòu)，4個(gè)基因（TN型）不含LRR結(jié)構(gòu)，證實(shí)了本研究的預(yù)測(cè)分類結(jié)果。研究結(jié)果表明黨參NBSLRR類基因在發(fā)育進(jìn)化過(guò)程中結(jié)構(gòu)比較保守。

圖1 黨參CNL及TNL類基因10個(gè)保守基序模型

圖2 黨參CNL及TNL類基因的保守基序分析

2.3 黨參NBS-LRR家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

利用MEGA7.0.14工具對(duì)黨參NBS-LRR家族基因的編碼蛋白序列建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，對(duì)88個(gè)黨參NBS-LRR家族基因建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖3）。黨參NBS-LRR家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中15個(gè)CNL類基因聚集在灰色分枝包括：DN65402_c8_g2、DN59886_c 0_g1、DN64893_c0_g2、DN52173_c3_g4、DN51331_c0_g4、DN55845_c0_g2、DN58409_c0_g1、DN48620_c0_g 6、DN61518_c1_g3、DN53685_c0_g3、DN65190_c1_g2、DN61931_c0_g1、DN56519_c1_g1、DN57137_c1_g10和DN63147_c0_g1，7個(gè)TNL類基因聚集在粉色分枝包括：DN63121_c0_g2、DN58543_c1_g2、DN64213_c0_g 1、DN59598_c1_g2、DN58543_c1_g1、DN54844_c1_g1、DN60120_c0_g1，含特殊結(jié)構(gòu)域RPW8的RN類只有2個(gè)基因分別為DN62129_c0_g1和DN51381_c1_g2。在CNL和TNL分枝還含有N和NL類基因，推測(cè)這些基因在發(fā)育進(jìn)化過(guò)程中可能丟失了部分CC或TIR結(jié)構(gòu)，也可能是N和NL型基因進(jìn)化出了部分CC或TIR結(jié)構(gòu)。黨參CNL類基因與TNL類基因聚集在不同的分枝，表明在黨參進(jìn)化過(guò)程中，NBS-LRR家族基因中CNL亞家族和TNL亞家族可能遵循不同的進(jìn)化方式和路徑。

圖3 黨參NBS-LRR家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

黨參與擬南芥的NBS-LRR家族的基因系統(tǒng)發(fā)育分析獲得系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖4）。共發(fā)現(xiàn)了5對(duì)同源基因（紅色），分別是AT5G17680.1和DN54844c1g1；AT1G27180.1和DN65008c1g2；AT1G33560.1和DN5138 1c1g2；AT5G36930.2和DN54844c1g2/DN57200c0g1；DN5 8546c0g3和AT5G66910.1/AT5G66900.3/AT5G66900.2/AT5G66900.1。

圖4 黨參與擬南芥NBS-LRR家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.4 在尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）脅迫下黨參NBSLRR家族基因的表達(dá)差異分析

尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）侵染0、6、24、72、120 h后，黨參NBS-LRR基因表達(dá)模式不同（圖5）。在黨參響應(yīng)病原菌侵染的過(guò)程中，隨著時(shí)間的增加部分基因的表達(dá)模式表現(xiàn)為逐漸增加然后降低，例如DN56071c1g8、DN64591c1g1和DN48464c1g1等基因在病原菌侵染后24 h達(dá)到最高，24 h后逐漸降低；而部分基因表達(dá)模式表現(xiàn)為先減低后增加的規(guī)律，例如DN58543c1g1、DN63324c2g1和DN64213c0g1等基因在病原菌侵染后0-24 h表達(dá)量逐漸降低，在24-120 h表達(dá)量又逐漸增加。在黨參侵染尖孢鐮刀菌6 h時(shí)，DN53844c0g3、DN58543c1g2、DN53844c0g1、DN64786c1g 6、DN64786c1g5、DN48234c0g2、DN54844c1g2、DN65008c1g2、DN59747c0g3與侵染前相比表達(dá)水平提高；在黨參侵染尖孢鐮刀菌24 h時(shí)，DN56071c1g8、DN64591c1g1、DN48464c1g1、DN59886c0g1存在高表達(dá)；病原菌侵染72 h后黨參DN61931c0g1、 DN65190c1 g2、DN48620c0g6、DN65370c0g1和DN57200c0g1等基因高表達(dá)。病原菌侵染120 h后DN53844c0g4、DN53844c0 g3、DN64840c1g2、DN58543c1g1、DN64422c2g5和DN63324c2g1等基因高表達(dá)。在侵染前期（6-24 h）高表達(dá)的基因DN64786c1g6、DN64786c1g5、DN48234c0g 2、DN54844c1g2、DN59747c0g3、DN56071c1g8、DN64591c1g1、DN48464c1g1、DN59886c0g1對(duì)尖孢鐮刀菌具有明顯的響應(yīng)，推測(cè)這些在病原菌侵染前期（6-24 h）高表達(dá)的基因在黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

圖5 黨參NBS-LRR基因在尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）脅迫下0、6、24、72、120 h的表達(dá)模式熱圖

2.5 NBS-LRR基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

為探究黨參NBS-LRR家族基因的生物學(xué)功能，基于擬南芥互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)同源分析的方法，預(yù)測(cè)了蛋白之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖6）。共發(fā)現(xiàn)了12個(gè)擬南芥的同源蛋白分別是DN64893c0g2、DN64490c0g3、DN49453c0g1、DN65343c1g2、DN54844c1g2、DN64422c 2g6、DN60170c0g1、DN65402c8g2、DN49778c1g1、DN65307c2g1、DN65418c4g2和DN59747c0g3，以及42個(gè)相關(guān)的互作蛋白?；プ鞯鞍字蠭KU2（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族），是編碼富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）激酶；GLR家族作為谷氨酸門(mén)控受體可以調(diào)節(jié)鈣離子流入細(xì)胞；CYTC-1和CYTC-2是線粒體電子傳遞鏈中的最終載體蛋白；MPK3參與氧化應(yīng)激介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)（如臭氧），并參與細(xì)菌鞭毛蛋白受體FLS2下游的先天免疫M(jìn)AP激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)（MEKK1、MKK4/MK5和MPK3/MPK6）。黨參的抗病蛋白DN54844c1g2可能與GLR家族互作，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流參與免疫調(diào)控；DN64786c1g5可能與CYTC-1和CYTC-2互作，進(jìn)而通過(guò)參與氧化還原反應(yīng)參與黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程；DN59747c0g3可能與MPK3互作，進(jìn)而通過(guò)參與MAP信號(hào)級(jí)聯(lián)、磷酸化WRKY轉(zhuǎn)錄因子以及參與超敏反應(yīng)（HR），在黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。表明黨參NBS-LRR家族基因可能通過(guò)參與復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程來(lái)調(diào)控抗病。DN54844c1g2、DN64786c1g 5、DN64786c1g5是黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程中具有重要作用的抗病基因。表明黨參NBS-LRR家族基因可能通過(guò)參與復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程來(lái)調(diào)控抗病。DN54844c1 g2、DN64786c1g5、DN64786c1g5是黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程中具有重要作用的抗病基因。

圖6 NBS-LRR基因互作網(wǎng)絡(luò)

3 討論

基于黨參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，共鑒定到88個(gè)黨參NBS-LRR家族基因，CNL類基因數(shù)量（15個(gè)）約為T(mén)NL類基因數(shù)量（7個(gè)）的2倍，與擬南芥中TNL亞家族基因數(shù)量約是CNL亞家族基因數(shù)量的2倍[13]相差較大，與人參中CNL亞家族基因數(shù)量（50個(gè)）是TNL亞家族基因數(shù)量（21個(gè)）[21]的2.4倍相差不大。植物NBS-LRR家族基因的數(shù)量多少在一定程度上表現(xiàn)出植物的抗病能力大小[22]。與模式物種相比較，黨參CNL類基因較TNL類基因發(fā)生明顯擴(kuò)增，與人參中TNL和CNL亞家族基因的發(fā)育進(jìn)化路徑比較一致。

Motif預(yù)測(cè)得到10個(gè)保守的motif序列，包括Ploop、GLPL、Kinase2、RNBS-B、RNBS-C、MHDV以及LRR和TIR典型的結(jié)構(gòu)單元，符合植物NBS-LRR家族基因典型的結(jié)構(gòu)特征，如谷子[23]，甘薯[8]等，這種結(jié)果意味著黨參的NBS-LRR家族基因在發(fā)育進(jìn)化過(guò)程中保持較高的保守性。同一亞家族NBS-LRR基因motif排列具有一定的順序性，并且親緣關(guān)系越近序列越相似，序列上的相似性意味著功能上的相似性[24]。研究表明LRR結(jié)構(gòu)域具有特異識(shí)別病原微生物的作用[17]，本研究中共有14個(gè)基因含有LRR結(jié)構(gòu)域，占總數(shù)的67%，含LRR結(jié)構(gòu)域的基因數(shù)量越多推測(cè)其識(shí)別病原菌發(fā)揮抗病能力越強(qiáng)。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黨參CNL和TNL類基因聚集分布于不同的進(jìn)化分枝，TNL和CNL亞家族基因發(fā)育進(jìn)化路徑可能不同，這與醋栗番茄的研究結(jié)果相似[25]，黨參與擬南芥NBS-LRR家族系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)同源基因?qū)?，在醋栗番茄與擬南芥的系統(tǒng)進(jìn)化分析中也發(fā)現(xiàn)了5個(gè)同源基因?qū)Α?/p>

目前研究發(fā)現(xiàn)，NBS-LRR家族基因在野生二粒小麥[26]、人參[21]等植物中存在時(shí)空表達(dá)差異。本研究結(jié)果表明黨參NBS-LRR家族基因在尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）脅迫下具有時(shí)間表達(dá)模式差異，NBS-LRR基因參與調(diào)控黨參響應(yīng)根腐病的過(guò)程，其中DN64786c1g6、DN64786c1g5、DN48234c0g2、DN54844 c1g2、DN59747c0g3、DN56071c1g8、DN64591c1g1、DN48464c1g1、DN59886c0g1等基因在尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）侵染的前期（6-24 h）高表達(dá)，表明這些基因在黨參抗病響應(yīng)過(guò)程中存在重要的表達(dá)調(diào)控作用。

NBS-LRR家族基因可與多種抗病相關(guān)蛋白互作，構(gòu)建植物復(fù)雜的抗病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[27]。本研究預(yù)測(cè)NBS-LRR互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)12個(gè)黨參抗病蛋白可能與42個(gè)互作蛋白具有相互作用，黨參與擬南芥同源的基因之間可能存在相似的結(jié)構(gòu)和作用模式并具備相同的功能。DN54844c1g2可能與GLR家族互作，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流參與免疫調(diào)控；DN64786c1g5可能與CYTC-1和CYTC-2互作，進(jìn)而通過(guò)參與氧化還原反應(yīng)參與黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程；DN59747c0g3可能與MPK3互作，進(jìn)而通過(guò)參與MAP信號(hào)級(jí)聯(lián)、磷酸化WRKY轉(zhuǎn)錄因子以及參與超敏反應(yīng)（HR），在黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前在桃[28]、擬南芥[29]等植物響應(yīng)脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步探究其在黨參響應(yīng)根腐病過(guò)程中的作用機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定黨參NBS-LRR基因家族、分析其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、表達(dá)模式及互作網(wǎng)絡(luò)，確定黨參NBS-LRR家族包含88個(gè)基因，黨參CNL及TNL類基因結(jié)構(gòu)比較保守；黨參CNL亞家族基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生擴(kuò)增；在尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）脅迫下黨參NBS-LRR家族基因表達(dá)模式具有時(shí)間差異，并確定了響應(yīng)病原菌的高表達(dá)基因，通過(guò)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)了DN54844c1g2、DN64786c1g 5、DN59747c0g3的重要作用。本研究為揭示黨參抗病機(jī)制、黨參遺傳育種及改良提供基礎(chǔ)。