基于羊水脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索大黃對(duì)孕鼠生殖及胚胎發(fā)育影響*

李思穎，房樺峰，種瑩，徐建亞，單進(jìn)軍

（南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所/江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南京 210023）

大黃作為中藥“四大金剛”之一，被廣泛應(yīng)用于內(nèi)科、外科、兒科、皮膚科以及婦科等方面。但近年來(lái)，關(guān)于大黃各項(xiàng)毒性的報(bào)道層出不窮。學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)，大黃蒽醌類化合物（如大黃酸、大黃素）顯示出了肝腎毒性以及生殖發(fā)育毒性[1-3]；大黃水提物長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用也會(huì)產(chǎn)生相關(guān)毒性[4]。何秋霞等[5-6]報(bào)道，大黃素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育具有毒性作用；蘆薈大黃素對(duì)未成熟斑馬魚(yú)胚胎具有致死作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，重復(fù)給與大黃水提液（給藥劑量為2 g·kg-1）14天，成年大鼠14天增重都有所降低，特別是雌性大鼠的14天增重及腎臟、子宮系數(shù)顯著降低，給藥組雄性大鼠精子數(shù)量明顯減少；血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）顯著降低。這些研究結(jié)果也提示，大黃可能會(huì)影響大鼠的生殖功能。大黃被列為妊娠禁忌中藥中的慎用藥，但目前對(duì)于妊娠禁忌中藥界定還有很大爭(zhēng)議，沒(méi)有一個(gè)普遍認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)。鑒于中藥是多成分復(fù)合體，每種成分的毒性不能完全代表中藥整體的作用效果。基于高通量篩選平臺(tái)的研究方法更適合中藥安全性的綜合評(píng)價(jià)，特別是代謝組學(xué)技術(shù)為發(fā)育毒性中藥的篩查及機(jī)制的研究提供了新的手段。羊水能夠反映胎兒的生理或病理狀態(tài)，在胚胎發(fā)育的相關(guān)研究中具有優(yōu)勢(shì)；基于羊水的代謝組學(xué)可以更加精確地檢測(cè)藥物以及毒物等對(duì)胎兒的影響[7]。

關(guān)于大黃的毒性研究不少，但目前對(duì)大黃水提物的妊娠毒性及胚胎發(fā)育毒性的相關(guān)研究仍較少，其作用機(jī)制尚未明確。

基于此，本課題組通過(guò)擬羊水代謝組學(xué)的方法探索了大黃對(duì)大鼠的生殖發(fā)育的影響，討論了孕期大黃用藥的可行性以及大黃作為妊娠禁忌中藥的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

10周齡性成熟SD大鼠共30只，體質(zhì)量300g左右；由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，SPF級(jí)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.201900840。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度為（60%±10%），自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到了南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理（動(dòng)物倫理批件號(hào)：201812A008）。

1.2 藥物制備

生大黃飲片，購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院藥房。

大黃水煎液的制備：大黃藥材500 g，10倍水浸泡2 h，煮沸10 min，倒出藥液；再加6倍水，煎煮10 min，合并藥液，過(guò)濾，低溫濃縮至濃度為0.2 g·L-1備用。

1.3 主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS）：溶于超純水中，定容1000 mL，用高壓蒸汽滅菌器滅菌，氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.56 g，磷酸二氫鉀0.1 g，在室溫下冷卻；甲基叔丁基醚（MTBE），購(gòu)自美國(guó)ROE；內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)：lysoPE（17:1）（批號(hào)：LM171LPE-11），SM（17:0）（批號(hào)：170SM-13），PE（17:0/17:0）（批號(hào)：LM170PE-19）從Avanti Polar Lipids公司購(gòu)買(mǎi)；冰醋酸（批號(hào)：15080553613，純度：99.5%）購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司。異丙醇、甲酸銨和乙酸銨均為99.8%的純質(zhì)譜，購(gòu)自美國(guó)ROE公司；甲醇和乙腈為99.8%質(zhì)譜，購(gòu)自德國(guó)默克公司。

ALLegra64R高速冷凍離心機(jī)（Beckman，USA）；Savant SPD1010真空離心濃縮器（Thermo Fisher Scientific，USA）；U3000高效液相色譜儀（Dionex，USA）；Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)Orbitrap高分辨率質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Scientific，USA）；Xcalibur 2.1SP1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，USA）。

1.4 分組及給藥

性成熟SD大鼠（雌性20只，雄性10只），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，每天20：00，雌、雄鼠（2:1）合籠交配，次日8：00，精子涂片，見(jiàn)精子者確定為已交配，定為妊娠0天（GD0）。確認(rèn)交配的雌鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組（CK組）和大黃水提物組（DH組），每組8只。大黃水提物組按每100 g體質(zhì)量1 mL藥液，于GD6-16天灌胃給藥每日給藥1次，劑量為2 g·kg-1體質(zhì)量；空白組給予等體積飲用水。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 一般狀態(tài)觀察

給藥期間觀察孕鼠的活動(dòng)、有無(wú)陰道出血或者流產(chǎn)等現(xiàn)象。

1.5.2 指標(biāo)檢測(cè)

孕大鼠于GD17麻醉后取血，血清樣本隔日送至南京市東南大學(xué)中大附屬醫(yī)院檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、肌酸激酶（CK）、肌酐（Cr）以及尿素氮（BUN）的含量。解剖后采集母鼠的心臟、肝臟、腎臟、卵巢及胎盤(pán)用于病理檢測(cè)，組織經(jīng)10%福爾馬林固定；48 h后送檢，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4-5 μm，HE染色，病理專業(yè)人員閱片，根據(jù)病變輕重程度，依次半定量為極輕度“±”、輕度“+”、中度“++”、重度“+++”而無(wú)病變組織標(biāo)記為“-”。取羊水用于脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)；同時(shí)記錄活胎數(shù)、吸收胎、早死胎（晚死胎），三者總和計(jì)數(shù)為胚胎植入數(shù)。采用誘導(dǎo)低溫法處死活胎后，逐個(gè)測(cè)量體質(zhì)量，鑒定外觀畸形。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別統(tǒng)計(jì)各組母體受孕率，胎仔活胎率、吸收胎率、早死胎率、平均活胎體質(zhì)量以及外觀畸形率。

1.5.3 羊水代謝組學(xué)檢測(cè)

（1）羊水LC-MS前處理

500 μL羊水凍干后，用200 μL或160 μL純凈水復(fù)溶。復(fù)溶后羊水取80 μL于1.5 mL的離心管中，加入含內(nèi)標(biāo)[lyso PE(17:1)，SM（17:0），PE(17:0/17:0)]的冰甲醇溶液225 μL，渦旋10 s，加入冰甲基叔丁基醚（MTBE）750 μL，渦旋10 s后于4℃震蕩10 min后加入冰超純水188 μL，渦旋20 s后于4℃，14000 r·min-1離心2 min，吸取上清液35 0μL至1.5 mL的離心管中（上層用于測(cè)脂質(zhì)組）；取下層水相110 μL至1.5 mL的離心管中（下層備用用于GC-MS法測(cè)極性物質(zhì)）；在離心濃縮儀中真空揮干，放置于-20℃待測(cè)。

（2）液相色譜質(zhì)譜條件

液相色譜質(zhì)譜條件參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]為了檢測(cè)脂質(zhì)，通過(guò)梯度洗脫將2 μL等份試樣溶液注入維持在60℃的反相Waters Acquity UPLCCSHC18（100 mm×2.1 mm，1.7 m）上。流動(dòng)相A為水：ACN（6:4），流動(dòng)相B為異丙醇：ACN（9:1），均含有10 mmol·L-1甲酸銨和0.1%甲酸。流速為0.3 mL·min-1，洗脫梯度如下：0-4.0 min，15% B；4.0-5.0 min，15%-48% B；5.0-22.0 min，48%-82% B；22.0-23.0 min，82%-99% B；23.0-24.0 min，99% B；24.0-24.2 min，99%-15% B；24.2-30.0 min，15% B。施加的離子源和離子轉(zhuǎn)移參數(shù)如下：噴霧電壓3.5 kV（正）和3.0 kV（負(fù)）。對(duì)于這兩種電離模式，鞘氣、輔助氣、毛細(xì)管溫度和加熱器溫度分別保持在35、15（任意單位），325℃和300℃。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析。兩組連續(xù)性計(jì)量數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)比較。Kruskal-Willis H（K）檢驗(yàn)用于胎仔活胎率，吸收胎率、早死胎率及先天畸形率的分析。其中胎仔體質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用嵌套設(shè)計(jì)（胎仔嵌套于窩，窩嵌套于組）方差分析，即先計(jì)算每窩胎仔均數(shù)，再以窩均數(shù)計(jì)算每組均數(shù)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

脂質(zhì)注釋后，建立了一個(gè)小型數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含脂質(zhì)名稱，保留時(shí)間（RT）和準(zhǔn)確的質(zhì)荷比（m/z）。使用ABF轉(zhuǎn)換器（可從http://www.reifycs.com/AbfConverter訪問(wèn)）將從Xcalibur 2.2軟件（Thermo Scientific）獲得的原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為ABF格式。對(duì)于數(shù)據(jù)處理，使用了MS-DIAL（V.2.78）軟件程序。在這項(xiàng)研究中，只有定義為m/z-RT對(duì)的脂質(zhì)特征才能針對(duì)相同的脂質(zhì)進(jìn)行比對(duì)。生成的高質(zhì)量時(shí)間校準(zhǔn)檢驗(yàn)脂質(zhì)的輸出數(shù)據(jù)表及其相應(yīng)的RT，m/z和每個(gè)樣品的峰面積均經(jīng)過(guò)了進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析[8]。

使用MetaboAnalyst 5.0（http：//www.metaboanalyst.ca）進(jìn)行多變量分析。使用基于R語(yǔ)言的LOESS（局部加權(quán)回歸）歸一化數(shù)據(jù)矩陣[9-10]。進(jìn)行了無(wú)偏差主成分分析PCA和偏最小二乘法分析OPLS-DA，并使用置換策略進(jìn)行了模型評(píng)估。通過(guò)U檢驗(yàn)和FDR校準(zhǔn)選擇差異脂質(zhì)，P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.4。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠一般情況

給藥期間孕鼠的活動(dòng)、行為無(wú)異常表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)陰道出血、流產(chǎn)等現(xiàn)象；正常組的3只孕大鼠于GD17解剖前發(fā)現(xiàn)已經(jīng)或者正在生產(chǎn)，可能是前期受孕日判斷有誤。

2.2 孕鼠血清生化指標(biāo)

如表1所示，與對(duì)照組相比，大黃組孕大鼠ALT顯著升高（P＜0.01）；其余各項(xiàng)生化指標(biāo)與對(duì)照組均無(wú)顯著性差異。

表1 孕大鼠血清生化結(jié)果（±s，n=8）

注：與CK組比較，**P＜0.01。

組別CK組DH組劑量（g·kg-1）-2 ALT（IU·L-1）44.88±7.32 58.00±7.05**AST（IU·L-1）97.14±17.86 114.50±16.43 CK（IU·L-1）473.71±166.66 497.20±187.95 BUNmmol·L-1 4.71±0.87 4.83±0.94 Crμmol·L-1 26.13±2.23 23.63±3.02

2.3 孕鼠組織病理學(xué)結(jié)果

組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，大黃組孕大鼠心、肝、腎、卵巢無(wú)明顯的與藥物有因果關(guān)系的病理性損傷。但是大黃組兩例胎盤(pán)有重度瘀血（圖1），這兩例對(duì)應(yīng)于沒(méi)有活胎，只有吸收胎和早死胎的兩只孕大鼠。

圖1 給藥11天后孕鼠胎盤(pán)組織病理變化（200×）

2.4 對(duì)孕鼠妊娠及胚胎發(fā)育的影響

如表2所示，與CK組比較，DH組的活胎數(shù)率顯著降低，吸收胎及早死胎率顯著升高（P＜0.05）；DH組窩胎仔體質(zhì)量也顯著低于CK組（P＜0.01）；外觀畸形率也低于CK組，但無(wú)顯著差異。

表2 大黃水提物對(duì)大鼠妊娠及胚胎發(fā)育的影響（±s，n=8）

表2 大黃水提物對(duì)大鼠妊娠及胚胎發(fā)育的影響（±s，n=8）

注：與CK組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別CK DH-2 g·kg-1受孕率（%）100%100%著床數(shù)104 111活胎數(shù)/率（%）104（100%）71（64%）*吸收胎數(shù)/率（%）0（0）18（16.2%） *早死胎數(shù)/率（%）0（0）22（19.8%） *胎仔體質(zhì)量（g）0.94±0.06 0.78±0.05**外觀畸形率（%）0 5.6

2.5 羊水代謝組學(xué)結(jié)果

2.5.1 羊水中脂質(zhì)成分的分析

對(duì)照組和大黃組的樣品通過(guò)混合四極桿活性O(shè)rbitrap質(zhì)譜（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）進(jìn)行檢測(cè)。樣品以正離子和負(fù)離子模式隨機(jī)分配。使用MS-DIAL軟件和超過(guò)200000個(gè)MS/MS光譜的LipidBlast數(shù)據(jù)庫(kù)分析了原始數(shù)據(jù)。圖2A和圖2B分別顯示了在正離子模式和負(fù)離子模式下不同時(shí)間段的總離子流圖（TIC）。與公共LipidBlast文庫(kù)的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)和MS/MS匹配用于脂質(zhì)注釋和鑒定。

圖2 MS-DIAL軟件中大鼠羊水QC樣品的典型脂質(zhì)總離子流（TIC）

431種脂質(zhì)分子以陽(yáng)離子模式被包被，主要涉及以下類別：心磷脂（CAR）；膽固醇酯（CE）；神經(jīng)酰胺（CER）；二酰基甘油（DG）；溶血磷脂酰膽堿（lysoPC）；溶血磷脂酰乙醇胺（lysoPE），磷脂酰膽堿（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）；磷脂酰肌醇（PI）；磷脂酰絲氨酸（PS）；磷脂酰絲氨酸（PS）；鞘磷脂（SM）和甘油三酸酯脂質(zhì)，例如甘油三酸酯（TG）。

負(fù)離子模式覆蓋了270種脂質(zhì)，主要涉及以下類別：脂肪酸（FA）、溶血磷脂酰膽堿（lysoPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysoPE）、磷脂酰膽堿（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和鞘磷脂（SM）脂質(zhì)。

2.5.2 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)使用3種方法來(lái)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)操作誤差并研究?jī)x器的穩(wěn)定性：①進(jìn)入實(shí)驗(yàn)樣品之前使用先進(jìn)的10針QC樣品平衡系統(tǒng)；②監(jiān)測(cè)所有樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰高，以計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）；③每10個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品后注入空白溶劑樣品和QC樣品。

為了評(píng)估系統(tǒng)穩(wěn)定性和可重復(fù)性，使用了不同的歸一化方法來(lái)計(jì)算羊水的QC樣品的RSD值。在正模式下，PQN歸一化后的RSD值最小，為10.04%，但與沒(méi)有任何歸一化方法的結(jié)果相似。在負(fù)模式下，線性歸一化后的RSD值最小，為7.011%。歸一化后，QC樣品在正電離和負(fù)電離中都聚集在一起。這表明LC-MS系統(tǒng)的穩(wěn)定性在整個(gè)分析過(guò)程中都很好。

2.5.3 非靶向脂質(zhì)組學(xué)代謝分析

在羊水脂質(zhì)組學(xué)研究中，以正離子和負(fù)離子模式比較了CK組和DH組之間的羊水脂質(zhì)代謝產(chǎn)物。通過(guò)無(wú)偏PCA（圖3A，3B）和OPLS-DA（圖4A，4B）分析了正離子和負(fù)離子模式下每組的數(shù)據(jù)集。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本。本研究發(fā)現(xiàn)，在正離子和負(fù)離子模式下的OPLS-DA模型在1000個(gè)排列后適應(yīng)性良好（在正離子模式下R2Y=0.877，在負(fù)離子模式下R2Y=0.997）和良好的預(yù)測(cè)（在正離子模式下Q2=0.649，在負(fù)離子模式下Q2=0.794）；但可能存在過(guò)擬合的風(fēng)險(xiǎn)（P＞0.05）（圖4C，4D）。初步的PCA模型和OPLS-DA模型均顯示，在正電離和負(fù)電離下，CK組和DH組中羊水的總體脂質(zhì)變化具有較一致的分離。這提示CK組和DH組的羊水有代謝差異。

圖3 兩組羊水脂質(zhì)分布的PCA評(píng)分圖

圖4 兩組羊水脂質(zhì)譜的OPLS-DA評(píng)分圖和模型驗(yàn)證

2.5.4 脂質(zhì)差異代謝物分析

用U-檢驗(yàn)和FDR校正法測(cè)定CK組和DH組羊水的脂質(zhì)差異。選擇差異脂質(zhì)的基礎(chǔ)是P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.4和CK和CP組的峰高（FC）的倍數(shù)變化＞1.5。在正離子和負(fù)離子模式下，分別獲得了13和31種差異脂質(zhì)（表3和表4）。其中，圖5A顯示了5種在正離子模式下FC＞2.0的脂質(zhì)，例如PC、TG和PI。圖5B顯示了8種在負(fù)離子模式下FC＞2的脂質(zhì)，即PC，LPC，PI、PE和SM等。通過(guò)分析羊水中不同脂質(zhì)的相對(duì)種類和變化趨勢(shì)，本課題組發(fā)現(xiàn)，CK組和DH組之間存在著顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 羊水中脂質(zhì)明顯改變的歸一化峰強(qiáng)度圖

表3 羊水中差異代謝物（正離子模式）

表4 羊水中差異代謝物（負(fù)離子模式）

根據(jù)前25種差異脂質(zhì)的峰高繪制熱圖（圖6）。圖中的每個(gè)正方形代表每組樣品的相應(yīng)強(qiáng)度，紅色或藍(lán)色分別代表濃度的增加或降低。顏色越深，代謝物濃度的增加/降低越強(qiáng)。差異脂質(zhì)分別以正離子和負(fù)離子模式聚集。正離子模式下的差異脂質(zhì)聚類，結(jié)果熱圖如圖6A所示。從圖中可以看出，CK組與DH組明顯不同，被分為兩個(gè)束。DH組羊水的代謝產(chǎn)物（LPC、TG、DG等）的水平顯著高于對(duì)照組；而PC、CE、PI以及個(gè)別TG顯著下調(diào)。負(fù)離子模式下的差異脂質(zhì)聚類，結(jié)果熱圖如圖6B所示。與正離子模式類似，以負(fù)離子模式分析的脂質(zhì)進(jìn)一步證明對(duì)照組和DH組之間存在顯著差異，熱圖也分為兩束。與CK組相比，DH組的多數(shù)PE呈下降趨勢(shì)，而PC呈上升趨勢(shì)。結(jié)果 提示，大黃給藥后大鼠羊水中的脂質(zhì)（如PI、PC、LPC、TG和PE等）可能代謝異常。

圖6 羊水中鑒定出的前25種差異性脂質(zhì)的熱圖

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃給藥組活胎數(shù)明顯減少，出現(xiàn)吸收胎、早死胎等不正?，F(xiàn)象，表明妊娠期應(yīng)用大黃，會(huì)造成孕鼠的的胚胎發(fā)育異常。與閆麗偉等[11]研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用LC-MS技術(shù)檢測(cè)了羊水脂質(zhì)組，共鑒定出701種脂質(zhì)成分，正、負(fù)離子模式下分別有431、270種。差異分析顯示，羊水脂質(zhì)中主要有PI、PC、PE等磷脂及甘油三酯TG表現(xiàn)出代謝紊亂；大黃給藥后胚胎發(fā)育的異?？赡芘c這些脂質(zhì)的代謝異常相關(guān)。

3.1 磷脂酰肌醇（PI）

PI是膜磷脂的重要組成，參與細(xì)胞膜的形成，脂質(zhì)合成和細(xì)胞生長(zhǎng)，在維持細(xì)胞形態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞分化中起到至關(guān)重要的作用[12]。細(xì)胞內(nèi)肌醇衍生物主要分為磷脂酰肌醇（PI）、4-磷酸磷脂酰肌醇（PIP）和4,5-二磷酸脂酰肌醇（PIP2）[13]，參與不同的生物代謝途徑，行使其功能。發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和心肌中的高肌醇濃度強(qiáng)調(diào)了胚胎對(duì)這種營(yíng)養(yǎng)素的高需求[14]。有研究發(fā)現(xiàn)PI(4,5)P2即4,5-二磷酸磷脂酰肌醇是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[15-17]。PI(4,5)P2通過(guò)產(chǎn)生脂質(zhì)第二信使如二?；视停―G）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）[18]以及3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組、膜運(yùn)輸、細(xì)胞黏附、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及通道的活性和凋亡等過(guò)程，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和凋亡[19]，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。PI(4,5)P2局部濃度的高低，對(duì)不同的細(xì)胞通路及細(xì)胞功能至關(guān)重要[20-21]。在圍孕期補(bǔ)充肌醇可能會(huì)降低胎兒受神經(jīng)管缺陷（NTD）影響的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，胚胎攝取肌醇對(duì)胚胎發(fā)育至關(guān)重要[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃干預(yù)后，羊水中PI濃度下降，可能大黃抑制了PI的合成和分泌，這可能是其引起胚胎吸收和早期死亡的重要原因。

3.2 磷脂酰膽堿（PC）

PC也是真核細(xì)胞膜磷脂的重要組成。PC是神經(jīng)突起生長(zhǎng)和神經(jīng)元再生的重要分子[23]，如果在體內(nèi)的生物合成受影響，在胚胎后發(fā)育中表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷[24]。PC分子具有多樣性和復(fù)雜性，其中最豐富的磷脂種類是PC（16:0/16:0），也稱為二棕櫚酰卵磷脂（DPPC）。DPPC與多種疾病有關(guān)。DPPC可能通過(guò)摻入質(zhì)膜并影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性來(lái)抑制由氣道上皮細(xì)胞和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[25]。有研究表明[26]，循環(huán)PC水平與心血管事件呈正相關(guān)；含飽和脂肪酰鏈和單不飽和脂肪酰鏈的PC與心因死亡率高度正相關(guān)；而含有高度不飽和脂肪酰的PC具有心血管保護(hù)作用[27]。本實(shí)驗(yàn)中本課題組發(fā)現(xiàn)大黃干預(yù)后，羊水中循環(huán)PC包括含單不飽和脂肪酰鏈的PC如PC 32:1，PC 36:1等含量顯著高于正常對(duì)照組；但高度不飽和的PC如PC 40:9含量反而下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大黃可能通過(guò)改變循環(huán)PC以及高度不飽和PC的水平，影響胚胎心血管系統(tǒng)的發(fā)育。

3.3 磷脂酰乙醇胺（PE）

PE是磷脂的一種，又稱腦磷脂，可以改善記憶力并對(duì)肝硬化，或動(dòng)脈粥樣硬化等疾病有調(diào)控作用，主要組成成分為脂肪酸和乙醇胺[28]。有研究表明，腦磷脂合成主要器官是大腦，提示其在腦組織中含量豐富，其是腦細(xì)胞膜的重要組成部分，許多基本生命過(guò)程均與腦細(xì)胞膜有關(guān)[29]。在保健品中添加腦磷脂，可以改良大腦，智力也會(huì)得到一定程度的提升[30]。也有研究發(fā)現(xiàn)，腦磷脂的缺失可能會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病[31]。本實(shí)驗(yàn)中，大黃組磷脂酰乙醇胺PE下降，提示大黃可能通過(guò)改變PE水平，影響胚胎腦組織發(fā)育。

3.4 甘油三脂（TG）

TG體內(nèi)儲(chǔ)量最大，是產(chǎn)能最多的能源物質(zhì)，也是胎兒生長(zhǎng)的重要因素。懷孕早期，胎兒無(wú)法合成脂質(zhì)。胎兒的脂肪生成始于妊娠足月的肝臟和脂肪組織[32]。有研究認(rèn)為妊娠期母親TG升高似乎會(huì)增加先兆子癇和早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[33]。另有研究發(fā)現(xiàn)小于胎齡（SGA）新生兒的TG升高[34]，可能是由低密度脂蛋白（LPL）活性受損和隨后的胎兒脂肪團(tuán)發(fā)育造成的。羊水中關(guān)于TG的研究很少，Rodie等[35]研究了懷有hemoglobin Bart’s diseases胎兒孕婦的羊水脂質(zhì)組時(shí)發(fā)現(xiàn)，代謝物TG較對(duì)照組有明顯變化，而且不飽和程度高的TG主要呈下調(diào)趨勢(shì)而飽和程度高的TG主要呈上調(diào)趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也類似，與對(duì)照組相比，大黃干預(yù)后孕大鼠羊水中大量的TG也發(fā)生代謝異常，主要表現(xiàn)為含高不飽和脂肪酸（5個(gè)以上雙鍵）的TG主要呈下調(diào)趨勢(shì)，而含有飽和脂肪酸或低不飽合脂肪酸（4個(gè)以下雙鍵）的TG主要呈上調(diào)趨勢(shì)（見(jiàn)表3）。大黃引起羊水中TG代謝的紊亂，但不同TG之間的差別以及對(duì)胚胎發(fā)育的影響等，有待進(jìn)一步研究。

3.5 其他

以往有研究表明，許多細(xì)胞毒性和DNA損傷劑會(huì)導(dǎo)致鞘磷脂（SM）水平發(fā)生顯著變化[36]。本研究中，羊水中兩種氧化型的長(zhǎng)鏈SM在大黃干預(yù)后顯著上調(diào)。SM是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分，其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)生理和病理過(guò)程的多種細(xì)胞功能[37]，包括在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡、細(xì)胞衰老、炎癥、免疫反應(yīng)、代謝、對(duì)應(yīng)激刺激和自噬的反應(yīng)等。SM也是神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)變性的驅(qū)動(dòng)因素[38]，SM在組織內(nèi)堆積，嚴(yán)重者影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，甚至危及生命[39]。SM在皮膚的屏障功能中也具有重要的作用[40]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大黃可能通過(guò)干擾SM的代謝，對(duì)胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及皮膚屏障功能產(chǎn)生不利的影響。

此外，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大黃組羊水中溶血磷脂酰膽堿LPC 20:3/0:0顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)LPC 20:3/0:0與雄性后代的頭圍有關(guān)，可能影響大腦的發(fā)育[41]。

3.6 結(jié)論

綜上所述，本研究建立了一種利用UHPLC-QExactive Orbitrap MS高分辨率質(zhì)譜分析羊水脂質(zhì)組學(xué)的方法。利用MS-DIAL軟件和LipidBlast數(shù)據(jù)庫(kù)，本課題組分別鑒定了431種正離子模式和270種負(fù)離子模式的脂質(zhì)。其主要成分為磷脂、鞘磷脂、脂肪酸及甘油三酯等。通過(guò)對(duì)脂質(zhì)的鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)大黃干預(yù)后可能導(dǎo)致孕鼠羊水脂質(zhì)（如PI、PC等）代謝紊亂。鑒于脂質(zhì)在胚胎發(fā)育中具有重要作用，推測(cè)脂質(zhì)代謝的紊亂可能影響大鼠胚胎的正常發(fā)育。但是本課題組的研究還有較大的局限性：本實(shí)驗(yàn)屬于非靶標(biāo)脂質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)，鑒定的脂質(zhì)進(jìn)行了相對(duì)定量而非絕對(duì)量化；此外，上述推論尚缺乏藥理毒理實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)，將來(lái)需進(jìn)一步分析生物樣本中的發(fā)育毒性相關(guān)脂質(zhì)，探討在細(xì)胞功能和病理生理中的作用。