HPLC法測(cè)定藏藥十六味杜鵑花丸中羥基紅花黃色素A的含量

楊小蘭，謝和兵,*，尼瑪次仁，白瑪?shù)┰?，姜少?/p>

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230000；2. 江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司，江蘇 南通 226133；3. 西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，西藏 聶拉木 858300；4. 南京歸禾至康生物醫(yī)藥科技有限公司，江蘇 南京 210038）

十六味杜鵑花丸是由烈香杜鵑、石榴子、紅花、石灰華，甘草、肉豆蔻、葡萄干、螃蟹、肉桂、木香、廣棗、蓽茇、肉桂、丁香、豆蔻和力嘎都等共十六味藥材制成的藏藥傳統(tǒng)丸劑[1]，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為1995年版《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥：第一冊(cè)》（WS3-BC-0193-95）[2]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只有性狀和烈香杜鵑藥材的薄層定性鑒別，無成分的定量測(cè)定，質(zhì)量控制水平較低。本文研究建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定十六味杜鵑花丸中紅花色素A含量的方法，為該藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；XSR205DU/AC梅特勒電子天平（梅特勒-托利多）；UC-250DE超聲清洗器（上海微峰）；PHS-3C雷磁酸堿計(jì)（上海儀電）；TGL-16B高速離心機(jī)（常州中捷）。

1.2 試藥

紅花（批號(hào)：20200301），石榴子（批號(hào)：20200201），石灰華（批號(hào)：20200301），葡萄干（批號(hào)：200401），螃蟹（批號(hào)：210801），廣棗（批號(hào)：20200301），蓽茇（批號(hào)：20200301），力嘎都（批號(hào)：2 0 2 0 0 4 0 1），木香（批號(hào)：20200401） ，肉桂（批號(hào)：20200301）（西藏神猴藥業(yè)）；甘草（批號(hào)：210901），沉香（批號(hào)：210801），丁香（批號(hào)：220228），豆蔻（批號(hào)：220228），烈香杜鵑（批號(hào)：211201），肉豆蔻（批號(hào)：210501）（安徽援康中藥飲片）；藥材經(jīng)江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司質(zhì)檢均符合法定標(biāo)準(zhǔn)。

羥基紅花黃色素A（批號(hào)：111637-202111，含量96.8 %，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（批號(hào)：6808CU13，色譜純），磷酸（批號(hào)：20210906，分析純）、三乙胺（批號(hào)：C13683716，分析純）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；水（娃哈哈純凈水）。十六味杜鵑花丸制劑由江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司制劑實(shí)驗(yàn)室制備（批號(hào)：20220310，20220311，20220312，規(guī)格：每丸重0.5 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：UItimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.7 %磷酸（三乙胺調(diào)節(jié)pH 6.0）（體積比27:73）；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為403 nm；柱溫25 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品10.09 mg，置入50 ml量瓶，加25 %甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為195.3424 μg/g的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取2 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液，置入10 ml量瓶，用25 %甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為39.0685 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取十六味杜鵑花丸（批號(hào)：20220310）適量，研細(xì)，過60目篩，精密稱取粉末約2.5 g，置入150 ml具塞錐形瓶中，加入50 ml水，稱定重量，加熱回流提取60 min，靜置冷卻至室溫，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾紙抽濾，作為供試品儲(chǔ)備液；精密量取續(xù)濾液5 ml，置10 ml量瓶中，用25 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照處方比例配制缺紅花藥味的陰性樣品，同2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得。

2.3 專屬性

精密量取陰性樣品溶液，對(duì)照品溶液，供試品溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品和對(duì)照品溶液的保留時(shí)間一致且峰形對(duì)稱，陰性對(duì)照在目標(biāo)峰處無干擾，理論塔板數(shù)以羥基紅花黃色素A計(jì)不低于8000，該方法的專屬性良好。見圖。

圖1 羥基紅花黃色素A專屬性色譜圖

2.4 線性范圍考察

精密移取3，4，5，7.5，10 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別置入25 ml量瓶，用25 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得線性對(duì)照品溶液1～5；取對(duì)照品儲(chǔ)備液作為線性對(duì)照品溶液6。按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定線性對(duì)照品溶液1～6，記錄色譜峰面積。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液中羥基紅花黃色素A的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，線性回歸方程為Y=29.9700X-15.3126（r=0.9996），表明羥基紅花黃色素A在23.4411～195.3424 μg/ml的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限和定量限

取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，用25 %甲醇溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，測(cè)得羥基紅花黃色素A的定量限（S/N=12.4）為 0.08 μg/ml；檢測(cè)限（S/N=3.9）為 0.02 μg/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

取2.2.1項(xiàng)下制備好的對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)6次，記錄峰面積，RSD為0.41 %（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液配制方法平行制備6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件對(duì)6份供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算羥基紅花黃色素A的含量，分別為1403.1175，1386.0262，1406.4210，1410.7525，1384.2949，1385.2870 μg/g，RSD為0.75 %（n=6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取十六味杜鵑花丸粉末2.0 g和羥基紅花黃色素A對(duì)照品0.5 mg，置入150 ml具塞錐形瓶，再精密量取50 ml水，稱定重量，加熱回流提取60 min，靜置冷卻至室溫，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾紙抽濾，作為供試品儲(chǔ)備液；精密量取續(xù)濾液5 ml，置入10 ml量瓶，用25 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。平行制備6份。按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。結(jié)果，回收率在98.0 %～101.7 %之間，平均回收率為99.9 %，RSD為1.4 %（n=6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表1。

表1 羥基紅花黃色素A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密移取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，于室溫條件下，分別在0，2，4，6，8，10，12，14，24，30，72 h進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積考察供試品溶液和對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性。測(cè)得對(duì)照品峰面積和供試品峰面積的RSD分別為0.48 %（n=11），0.37 %（n=11），表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 耐用性

按2.1項(xiàng)下色譜條件，單因素變化檢測(cè)波長(zhǎng)±2 nm、流速±0.2 ml/min、柱溫±2 ℃、有機(jī)相比例±2 %、0.7 %磷酸pH±0.2，并更換ShimNex CS C18色譜柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，島津（上海）]，羥基紅花黃色素A含量的RSD均小于2.0 %，表明此法在單因素變化條件下的耐用性良好。

2.11 中間精密度

精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品和供試品適量，在不同分析人員，不同高效液相色譜儀和不同工作日的條件下按2.7項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)并記錄羥基紅花黃色素A化合物的峰面積，結(jié)果表明，兩位分析人員所得的12份溶液中羥基紅花黃色素A含量RSD為1.78 %。表明此法的精密度良好。

2.12 樣品的含量測(cè)定

取批號(hào)為20220310，20220311，20220312的十六味杜鵑花丸樣品，每批各2份，按照2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，3批樣品羥基紅花黃色素A含量分別為1407.9624， 1378.7066，1394.2544 μg/g。

3 討論

3.1 色譜條件的研究

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)配制的39.0685 μg/ml的羥基紅花黃色素A 對(duì)照品溶液，在 200～600 nm波長(zhǎng)內(nèi)進(jìn)行全掃描，結(jié)果表明，羥基紅花黃色素A在403 nm處有較強(qiáng)的可見光吸收，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇403 nm進(jìn)行測(cè)定。

3.1.2 流動(dòng)相、柱溫的選擇 本實(shí)驗(yàn)研究參考2020年版《中國(guó)藥典》一部“紅花”含量測(cè)定項(xiàng)下羥基紅花黃色素A的測(cè)定方法，以甲醇-乙腈-0.7 %磷酸（體積比26:2:72）為流動(dòng)相，結(jié)果表明，目標(biāo)峰羥基紅花黃色素A峰形不對(duì)稱，拖尾因子有逐漸偏大的趨勢(shì)。參考文獻(xiàn)[3]調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，pH 6.0時(shí)，目標(biāo)峰型對(duì)稱性最佳，但目標(biāo)峰處仍有干擾、分離度不佳的問題。在此基礎(chǔ)上，參考文獻(xiàn)[4-15]，以分離度、耐用性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究調(diào)節(jié)柱溫和流動(dòng)相的組成、比例，結(jié)果表明，柱溫25 ℃時(shí)，流動(dòng)相為甲醇-0.7 %磷酸（體積比27:73），目標(biāo)峰的分離度最佳。

3.2 供試品的處理研究

針對(duì)紅花色素A的理化性質(zhì)[10-11]，考察供試品的提取方式、提取溶劑。結(jié)果表明，水回流提取羥基紅花黃色素A含量更高，峰形更好，理論塔板數(shù)和拖尾因子均達(dá)到理想效果，且無干擾；加水量與羥基紅花色素A的得率呈正相關(guān)，當(dāng)加水量為供試品重量的20倍及以上時(shí)，羥基紅花黃色素A的得率無顯著性差異。因此，最終優(yōu)選的供試品處理方法為加水20倍，加熱回流提取1 h，提取一次即可。

3.3 其他

羥基紅花色素A是紅花藥材中的主要有效成分，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究制定了十六味杜鵑花丸中羥基紅花色素A的定量檢測(cè)方法，提高了產(chǎn)品的質(zhì)控水平，但十六味杜鵑花丸中含有大量含揮發(fā)性成分的藥材，針對(duì)揮發(fā)性有效成分的定量研究尚需進(jìn)一步的研究。