超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定獼猴桃中氯吡脲含量的不確定度評定

李建新，朱麗君，張曉燕，王魯霞*，李瑩瑩

（1. 菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000；2. 菏澤市行政審批踏勘評審中心，山東 菏澤 274000；3. 菏澤學院，山東 菏澤 274000）

氯吡脲，別名施特優(yōu)、吡效隆，是一種常用于獼猴桃種植，具有提高坐果率、增加膨果產(chǎn)量等作用的新型、高效、低毒的植物生長調(diào)節(jié)劑[1-4]。但過量使用氯吡脲會影響獼猴桃風味、降低硬度、縮短貯存期、提高腐爛率[5-7]；另一方面，過量攝入氯吡脲會對人體產(chǎn)生潛在危害，因此測定獼猴桃中氯吡脲的含量尤為重要。目前獼猴桃中氯吡脲含量的檢測方法有拉曼光譜法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[8-10]。

測量不確定度表征了被測量值的分散性分布，可減少判錯風險，是實驗室質(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督的重要組成部分[11-12]。一個完整有意義的結(jié)果表述同時包含被測量值及相關(guān)測量不確定度[13]，為確保檢驗結(jié)果的準確度、可信性，需采取合適的檢驗方法，并對實驗的測量不確定度進行合理評定。測量不確定度的評定方法之一是系統(tǒng)地評估所有可能的不確定性來源，明確指定被測量值與其參數(shù)之間關(guān)系的基礎公式，并使用統(tǒng)計建模技術(shù)量化所有貢獻的不確定性[14]。

本文使用QuEChERS方法（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）提取并凈化獼猴桃樣品中的待測成分氯吡脲，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定含量。建立數(shù)學模型，對全過程中各不確定度分量進行評估，如實反映了測量的置信度和準確性，為檢測結(jié)果的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（型號：Xevo-TQ S，Waters公司），十萬分之一電子分析天平（型號：AL204，梅特勒-托利多）。

1.2 試劑

氯吡脲（批號：84510070，ANPEL，濃度100 μg/ml）；乙腈（色譜純，ThermoFisher）；超純水（摩爾超純水儀制備），鹽包、QuEChERS凈化管（深圳逗點）。

2 方法

2.1 儀器條件

2.1.1 液相色譜條件 色譜柱：Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相A：0.1 %甲酸水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫程序（見表1），流速為0.3 ml/min。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 質(zhì)譜條件 電離模式：ESI+，監(jiān)測模式：MRM，離子噴霧電壓：3.0 kV，脫溶劑氣流速：900 L/h，脫溶劑氣溫度：400 ℃，其他參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.2 方法

2.2.1 待測樣品溶液制備 稱取10 g（精確至0.01 g）試樣置入50 ml離心管，加入乙腈10 ml，渦旋振蕩提取3 min；提取液中加入鹽包，渦旋1 min；4000 r/min離心5 min，取6 ml上清置入QuEChERS凈化管中，渦旋2 min，6000 r/min離心5 min，取上清過有機系濾膜, 供三重四級桿串聯(lián)超高效液相色譜檢測，標準曲線法定量。

2.2.2 空白基質(zhì)溶液的制備 稱取6份10 g（精確至0.01g）陰性樣品置入50 ml離心管，其余步驟參照2.2.1項。

2.2.3 標準系列溶液制備 準確移取氯吡脲標準溶液0.50 ml置入10 ml量瓶，乙腈定容，配制成濃度為5 μg/ml氯吡脲標準儲備A溶液，移取A 溶液1 ml置入50 ml量瓶，乙腈定容配制成濃度為100 ng/ml氯吡脲中間液B，分別準確移取0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 ml中間液B置入5 ml量瓶，用空白基質(zhì)溶液定容至刻度，配制濃度點為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/ml系列標準工作溶液。

3 不確定度分析

3.1 數(shù)學模型與不確定度來源分析

根據(jù)獼猴桃中氯吡脲測定的實驗過程，建立數(shù)學模型見式1。

式中：X為試樣中氯吡脲殘留量，μg/kg；x為從基質(zhì)標曲得到的獼猴桃中氯吡脲的質(zhì)量濃度，ng/ml；V為樣液的定容體積，ml；m為樣液代表的最終試樣的質(zhì)量，g；R為回收率。

由氯吡脲的信號強度（y）與濃度（x）成線性關(guān)系得標準曲線，并由標準曲線根據(jù)測定的氯吡脲溶液信號強度求得相應濃度。假定yi和yt分別是標準溶液和待測溶液的信號強度，xi和xt分別表示第i個標準溶液和待測溶液的濃度，i＝1～n，n為標曲的標準溶液個數(shù)；利用線性方程yt=axt+b公式推出式2。

將a和b帶入式2得到氯吡脲濃度C的計算式3。

根據(jù)獼猴桃中氯吡脲的測定過程和式1～3，分析全過程的不確定度來源見圖1。

圖1 不確定度來源分析

3.2 標準溶液制備引入的不確定度

3.2.1 采購的對照品溶液引入的不確定度 實驗用氯吡脲對照品濃度為100 μg/ml，證書標示其擴展不確定度為3.0 μg/ml，假定為矩形分布，取則其相對不確定度：

3.2.2 標準溶液制備引入的不確定度 標準物質(zhì)配制過程中量器引入的不確定度包括器具示差偏差的不確定度、實際使用溫度及校準溫度差異等方面的不確定度。根據(jù) JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[15]和JJG 646-2006《移液器》[16]要求，各器具的容量允差ΔV、使用次數(shù)見表3，取三角分布，包含因子，量取或定容體積為V（ml），其相對不確定度為，實驗室的溫度波動為（20±4）℃，即ΔT=4，乙腈膨脹系數(shù)β=0.00137oC-1，取矩形分布，產(chǎn)生的不確定度為：，用特定量器移取相應體積的溶液，其合成不確定度為：

表3 標準溶液制備所引入的不確定度

結(jié)合3.2.1項、3.2.2項的計算結(jié)果，標準溶液制備引入的相對不確定度為：

3.3 樣品前處理引入的不確定度

稱樣量m為10 g，實驗用天平檢定證書顯示其最大允許誤差為±0.001 g，按矩形分布，取，其相對不確定度為：

標示值V=10 ml A級移液管的最大容量允差為±0.015 ml，取三角分布，其相對不確定度為：

實驗過程中的溫度為（20±4）oC，即ΔT=4，取矩形分布，乙腈的膨脹系數(shù)β為0.00137/oC，其相對不確定度為：

則樣品前處理過程引入的合成相對不確定為：

3.4 測定儀器引入的不確定度

測定所用儀器（超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀）的校準證書顯示其擴展不確定度為 15 %，k=2，故測定儀器引入的不確定度為：

3.5 回收實驗引入的不確定度

取6份陰性樣品，每份樣品添加5 μg/kg的氯吡脲，制備獼猴桃陽性樣品，按照步驟2.2.1項制備6份平行樣品上機測定，計算回收率見表4。

表4 回收率結(jié)果分析

相對不確定度為：

根據(jù)《化學分析中不確定度的評估指南》[17]，通過t檢驗確定平均回收率與1.0是否有顯著差異，本實驗t值為：

t值大于2.57（t分布表取置信區(qū)95 %，自由度為5時查出），表明平均回收率ˉ與 1.0 有顯著差異性，故需要用回收率校正結(jié)果[18]。

3.6 標準曲線擬合引入的不確定度

分別取2.2.2項標準系列溶液各進樣1次，以各標準溶液的濃度xi對峰面積yi，線性最小二乘法擬合作標準曲線，得到回歸方程y=ax+b及相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果見表5。

表5 標準曲線擬合數(shù)據(jù)

標準曲線擬合的標準偏差為：

由標準曲線擬合引入的相對不確定度[19]為：

其中：n=6，為標準曲線的點數(shù)；p=6，為樣品平行測定的次數(shù)；yi為標準曲線對應的峰面積；x 0為樣品測得的平均質(zhì)量濃度，見表4，為4.75 ng/ml；為標準曲線的平均濃度，見表5，為6.42 ng/ml；a=100380，為標準曲線的斜率。

3.7 擴展不確定度與測量結(jié)果表示

由3.2項到3.6項分析，各分量不確定度的評定結(jié)果見表6。

表6 不確定度分量結(jié)果比對

計算的各分量的合成不確定度，計算合成不確定度為：

根據(jù)JJF 1135-2005《化學分析測量不確定度評定》[20]，在95 %置信水平下，取包含因子k=2，計入回收率修正，則相對擴展不確定度

所測獼猴桃樣液中氯吡脲含量的測定結(jié)果表述為4.98±0.88 μg/kg。

4 結(jié)論

對獼猴桃中氯吡脲含量測定過程中的可能的不確定度來源進行了分析、評定，包括測定儀器、標準曲線擬合、標準溶液的制備、樣品前處理、回收實驗等引入的不確定度。為提高實驗結(jié)果的準確性，可以采取標準物質(zhì)核查、準確控制實驗室溫濕度、定期開展儀器的校準和期間核查等措施。另外通過培訓和定期考核以提高實驗人員的操作規(guī)范性，以降低實驗過程的偏差。