李婷婷 ,任興權(quán), 張?jiān)婄?,趙 俊,楊雪芬,史 蓉*,孫姍姍
(1. 酒泉市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,甘肅 酒泉 735000;2. 中國(guó)食品藥品檢定研究院/國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食品質(zhì)量與安全),北京 100050)
枸杞是一種食藥同源的食材,每100 g干制品中總糖含量高于24.8 g、蛋白質(zhì)含量高于10 g[1],且因含有銅、鋅、鐵、錳等微量元素[2-3]和枸杞多糖、甜菜堿、黃酮、類胡蘿卜素等多種活性物質(zhì)而具有較高的食用價(jià)值[4-5],在保健食品和新型食品開(kāi)發(fā)方面表現(xiàn)突出[6-7]。枸杞作為甘肅省傳統(tǒng)的道地藥材,其種植面積逐年增長(zhǎng),產(chǎn)量提升明顯,對(duì)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用[8]。
由于枸杞在栽培過(guò)程中易發(fā)生病蟲(chóng)害,擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥因具有毒效較強(qiáng)、殘效較短、廣譜性高且對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn),是其栽培過(guò)程中使用頻率較高的一類殺蟲(chóng)劑[9]。近年,枸杞及其深加工產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的暴露情況和膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已引起較多關(guān)注[10-12]。雖然評(píng)估結(jié)果普遍表明,通過(guò)攝入枸杞中擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥對(duì)人體產(chǎn)生的膳食風(fēng)險(xiǎn)目前處于可接受水平,但長(zhǎng)期攝入農(nóng)藥殘留量超標(biāo)的枸杞給人體健康帶來(lái)的危害仍不可忽視。在GB 2763-2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[13]中,將鮮枸杞歸類為漿果和其他小型類水果,規(guī)定了110余種農(nóng)藥及其代謝物的限量;將干枸杞歸類為藥用植物,規(guī)定了17種農(nóng)藥及其代謝物的限量;對(duì)以枸杞為主要原料的深加工產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的限量暫無(wú)要求。在 NY/T 1051-2014《綠色食品 枸杞及枸杞制品》[14]中規(guī)定了枸杞鮮果、枸杞干果、枸杞原汁和枸杞原粉等綠色食品中15種農(nóng)藥的殘留限量。
在已有報(bào)道中,枸杞及其制品中農(nóng)藥殘留量的測(cè)定方法有固相萃取聯(lián)用氣相色譜法[15-16]、分散液液微萃取聯(lián)用液相色譜法[17-18]、QuEChERS聯(lián)用質(zhì)譜法[19-20]、凝膠滲透色譜聯(lián)用質(zhì)譜法[21-22]和固相萃取聯(lián)用質(zhì)譜法[23-25],而QuEChERS聯(lián)用氣相色譜法測(cè)定枸杞及其制品中擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留的報(bào)道較少。本文以鮮枸杞、干枸杞和枸杞原漿作為測(cè)試對(duì)象,建立QuEChERS聯(lián)用氣相色譜法測(cè)定21種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留量的方法,并對(duì)該方法中每種目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
GC-2014C氣相色譜儀(配有電子捕獲檢測(cè)器,日本島津公司);TG16離心機(jī)(上海盧湘儀); MV5高通量平行濃縮儀(北京萊伯泰科);PL602E/02電子天平[梅特勒-托利多(上海)]。
21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度均為100 μg/ml,溶劑均為正己烷,天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所);正己烷和乙腈(色譜純,德國(guó)Meker公司);乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA,粒徑40~60 μm)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18,粒徑40~60 μm)、石墨化碳黑(GCB,粒徑40~120 μm)(上海麥克林);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;測(cè)試樣品有鮮枸杞、干枸杞和枸杞原漿3類,均由酒泉市瓜州昊泰生物科技有限公司提供。樣品粉碎混勻后,于-18 ℃冰箱中密封保存。
色譜柱:DB-35毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:280 ℃;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣體積:1.0 μl;柱流量:1.2 ml/min;檢測(cè)器溫度:300 ℃;尾吹氣流量為30 ml/min;柱溫箱升溫程序見(jiàn)表1。
表1 柱溫箱的升溫程序
2.2.1 凈化填料用量的選擇 參照GB23200.113-2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定》[26]前處理方法中的QuEChERS凈化技術(shù),對(duì)PSA、C18和GCB的用量進(jìn)行優(yōu)化。分別向6.0 ml目標(biāo)農(nóng)藥質(zhì)量濃度均為0.05 μg/ml的樣品提取溶液中加入方案1、方案2和方案3對(duì)應(yīng)的填料凈化,溶劑置換后上機(jī)分析。同時(shí)測(cè)定相同濃度的溶劑標(biāo)液作為對(duì)照,通過(guò)比較目標(biāo)農(nóng)藥的峰面積確定凈化填料的用量。3種方案對(duì)應(yīng)的凈化填料用量見(jiàn)表2。
表2 3種方案的凈化填料用量
2.2.2 樣品前處理方法 準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品,置入50 ml離心管,干枸杞樣品需加入10.0 ml水浸潤(rùn)30 min、鮮枸杞和枸杞漿不需要加水浸潤(rùn),加入10.0 ml乙腈,2000 r/min渦旋提取5 min,加入1顆陶瓷均質(zhì)子后再加入1.0 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉、6 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉,劇烈震蕩1 min,4000 r/min離心5 min。于15 ml離心管中準(zhǔn)確吸取上層有機(jī)相6.0 ml,并向其中加入800 mg無(wú)水硫酸鎂、450 mg PSA、450 mg C18和45 mg GCB,2000 r/min渦旋1 min,8000 r/min離心5 min。取2.0 ml凈化液置入試管,40 ℃下加氮?dú)饩従彺抵两珊鬁?zhǔn)確加入1.0 ml正己烷復(fù)溶,過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,上機(jī)分析。
2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 空白基質(zhì)溶液:空白干枸杞樣品經(jīng)2.2.2項(xiàng)方法制得樣品溶液,于4 ℃冰箱保存。
混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別吸取α-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六等21種擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.20 ml,用正己烷定容至10.0 ml,混勻,得到質(zhì)量濃度為2.0 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃冰箱中保存。
溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別吸取0.025,0.125,0.25,1.25,2.50 ml混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用正己烷定容至5.0 ml,混勻,得到質(zhì)量濃度分別為0.010,0.050,0.10,0.50,1.0 μg/ml的溶劑混標(biāo)系列工作液(試劑標(biāo)液),臨用現(xiàn)配。
基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別吸取0.025,0.125,0.25,1.25,2.50 ml混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用空白基質(zhì)溶液定容至5.0 ml,混勻,得到質(zhì)量濃度分別為0.010,0.050,0.10,0.50,1.0 μg/ml的溶劑混標(biāo)系列工作液(基質(zhì)標(biāo)液),臨用現(xiàn)配。
在進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)前,用空白基質(zhì)溶液連續(xù)進(jìn)樣以飽和襯管上的活性位點(diǎn),待連續(xù)進(jìn)樣時(shí)目標(biāo)化合物的峰面積穩(wěn)定后,依次在最優(yōu)的儀器條件下進(jìn)樣試劑標(biāo)液和基質(zhì)標(biāo)液。以目標(biāo)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME)。
其中,km表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率,ks質(zhì)表示匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。
一般認(rèn)為:當(dāng)ME大于100 %,為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)ME小于100 %,為基質(zhì)減弱效應(yīng);當(dāng)ME位于-20 %~+20 %的范圍內(nèi),基質(zhì)效應(yīng)不顯著;當(dāng)ME位于-50 %~-20 %或+20 %~+50 %的范圍內(nèi),為較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),即基質(zhì)效應(yīng)顯著;當(dāng)ME大于+50 %或小于-50 %時(shí),為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),即基質(zhì)效應(yīng)非常顯著[28-29]。
選取空白干枸杞作為測(cè)試樣品,分別進(jìn)行0.02,0.10和0.40 mg/kg 3個(gè)含量水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)。待測(cè)物的含量通過(guò)下式計(jì)算:
式中,X:待測(cè)物含量,mg/kg;C:樣品測(cè)試溶液中待測(cè)物質(zhì)量濃度,μg/ml;V1:提取溶劑體積,ml,V1=10.0 ml;V2:用于氮吹的凈化液體積,ml,V2=2.0 ml;V3:樣品測(cè)試溶液復(fù)溶體積,ml,V3=1.0 ml;m:稱樣質(zhì)量,g;1000:?jiǎn)挝粨Q算系數(shù);f:稀釋倍數(shù)。
通過(guò)降低柱溫箱的升溫速率和延長(zhǎng)保持時(shí)間可使得性質(zhì)相近的目標(biāo)農(nóng)藥實(shí)現(xiàn)有效分離。在測(cè)定實(shí)際樣品時(shí),目標(biāo)組分的保留時(shí)間與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間差應(yīng)小于±0.05 min。21種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的氣相色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的氣相色譜圖
枸杞樣品中糖、蛋白質(zhì)等組分含量較高且樣品提取溶液顏色較深,故應(yīng)在前處理過(guò)程盡量降低樣品測(cè)試溶液中基質(zhì)的含量,進(jìn)而消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果和分析儀器帶來(lái)的不利影響。目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)3種凈化方案和溶劑置換后的峰面積見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),經(jīng)不同凈化方案得到的樣品測(cè)試溶液中目標(biāo)農(nóng)藥的峰面積與其相同質(zhì)量濃度的試劑標(biāo)液的峰面積比較呈不同的變化趨勢(shì)。本文涉及的21種擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥中有15種目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)方案3凈化后峰面積之比在80 %~120 %之間,有3種目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)方案3凈化后的峰面積之比不在80 %~120 %范圍內(nèi),其余3種目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)所有方案凈化后的峰面積之比均不在80 %~120 %的范圍內(nèi)。因此,本實(shí)驗(yàn)選用方案3作為樣品提取溶液凈化的最佳選擇,即當(dāng)吸取的樣品提取溶液體積為6.0 ml時(shí),加入的PSA、C18和GCB的用量分別為450,450和45 mg。
圖2 3種凈化方案對(duì)目標(biāo)物峰面積的影響
本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的樣品包含鮮枸杞、干枸杞和枸杞原漿,其中干枸杞的含水量較低,直接用乙腈提取效果不佳,因此在提取過(guò)程中應(yīng)考慮復(fù)水量的影響。根據(jù)GB 23200.10-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)桑枝、金銀花、枸杞子和荷葉中488種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[30]和相關(guān)研究[20],當(dāng)復(fù)水量為稱樣量的2~2.5倍時(shí),可獲得較高的提取效率。因此,在處理干枸杞樣品時(shí),稱樣后加入10 ml水浸泡30 min再加入乙腈提取。
較NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》[31]的前處理方法而言,本文設(shè)計(jì)的前處理方法具備以下優(yōu)勢(shì):(1)將50.00 g的稱樣量降至5.00 g,同時(shí)將乙腈的用量從50.00 ml調(diào)整為10.00 ml,為節(jié)約試劑、降低檢測(cè)成本起到積極作用;(2)干制樣品在復(fù)水后進(jìn)行提取,使提取溶劑乙腈與樣品組織充分接觸,進(jìn)而獲得更高的提取效率;(3)在樣品提取溶液凈化時(shí),采用QuEChERS技術(shù)代替了傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù),在減小有機(jī)試劑用量和縮短樣品凈化時(shí)間方面表現(xiàn)更突出。
在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí),目標(biāo)農(nóng)藥表現(xiàn)出的基質(zhì)效應(yīng)因其自身性質(zhì)[32]和含量水平[33]、樣品種類[34]及測(cè)試儀器[35]等因素而異。因此,明確目標(biāo)農(nóng)藥在相應(yīng)測(cè)試樣品中的基質(zhì)效應(yīng)非常必要。本文涉及的21種擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥表現(xiàn)出不同的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)或基質(zhì)減弱效應(yīng),結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的目標(biāo)農(nóng)藥,采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量是較常用的消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定結(jié)果不利影響的方法之一。因此,本實(shí)驗(yàn)在加標(biāo)回收試驗(yàn)和實(shí)際樣品測(cè)定時(shí),均采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。
表3 目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限及基質(zhì)效應(yīng)
21種擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥在0.010~1.0 μg/ml的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。以10倍的信噪比作為儀器的定量限,將其作為樣品測(cè)試溶液濃度,代入2.4項(xiàng)樣品中目標(biāo)物含量的計(jì)算公式即得到方法檢出限。21種目標(biāo)農(nóng)藥的方法檢出限均在0.005~0.010 mg/kg之間,與GB 23200.113-2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[26]給出的方法定量限處于同一水平。21種目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和方法定量限見(jiàn)表3。
通過(guò)低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和精密度,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定3次。3個(gè)加標(biāo)水平下所有目標(biāo)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率均在80.14 %~116.38 %之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.38 %~8.76 %之間,符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[36]的要求。
選取2份干枸杞、2份鮮枸杞和1份枸杞原漿作為實(shí)際樣品,采用本文優(yōu)化方法分析。在1份干枸杞中檢出了氯氰菊酯和高效氯氰菊酯,含量為0.096 mg/kg,小于GB 2763-2021[13]中規(guī)定的枸杞(干)中氯氰菊酯和高效氯氰菊酯的最大殘留限量2 mg/kg;其余4份樣品中均未檢出本文涉及的目標(biāo)農(nóng)藥。
本文建立了一種氣相色譜法同時(shí)測(cè)定枸杞及枸杞制品中21種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留量的方法,優(yōu)化了采用QuEChERS技術(shù)凈化樣品提取溶液時(shí)所用到的PSA、C18和GCB的用量,并明確了目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí),通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)考察此法的準(zhǔn)確度和精密度,并測(cè)定實(shí)際樣品。此法前處理簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確度高且靈敏度好,可滿足枸杞中21種擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥殘留量的同時(shí)測(cè)定,可為枸杞及其制品中相關(guān)擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的陽(yáng)性篩查和定量測(cè)定提供積極的幫助。