QuEChERS聯(lián)用氣相色譜法同時(shí)測定枸杞中21種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留

李婷婷 ，任興權(quán)， 張?jiān)婄?，趙 俊，楊雪芬，史 蓉*，孫姍姍

（1. 酒泉市食品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 酒泉 735000；2. 中國食品藥品檢定研究院/國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全），北京 100050）

枸杞是一種食藥同源的食材，每100 g干制品中總糖含量高于24.8 g、蛋白質(zhì)含量高于10 g[1]，且因含有銅、鋅、鐵、錳等微量元素[2-3]和枸杞多糖、甜菜堿、黃酮、類胡蘿卜素等多種活性物質(zhì)而具有較高的食用價(jià)值[4-5]，在保健食品和新型食品開發(fā)方面表現(xiàn)突出[6-7]。枸杞作為甘肅省傳統(tǒng)的道地藥材，其種植面積逐年增長，產(chǎn)量提升明顯，對當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用[8]。

由于枸杞在栽培過程中易發(fā)生病蟲害，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥因具有毒效較強(qiáng)、殘效較短、廣譜性高且對環(huán)境友好等特點(diǎn)，是其栽培過程中使用頻率較高的一類殺蟲劑[9]。近年，枸杞及其深加工產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的暴露情況和膳食風(fēng)險(xiǎn)評估已引起較多關(guān)注[10-12]。雖然評估結(jié)果普遍表明，通過攝入枸杞中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對人體產(chǎn)生的膳食風(fēng)險(xiǎn)目前處于可接受水平，但長期攝入農(nóng)藥殘留量超標(biāo)的枸杞給人體健康帶來的危害仍不可忽視。在GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[13]中，將鮮枸杞歸類為漿果和其他小型類水果，規(guī)定了110余種農(nóng)藥及其代謝物的限量；將干枸杞歸類為藥用植物，規(guī)定了17種農(nóng)藥及其代謝物的限量；對以枸杞為主要原料的深加工產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的限量暫無要求。在 NY/T 1051-2014《綠色食品 枸杞及枸杞制品》[14]中規(guī)定了枸杞鮮果、枸杞干果、枸杞原汁和枸杞原粉等綠色食品中15種農(nóng)藥的殘留限量。

在已有報(bào)道中，枸杞及其制品中農(nóng)藥殘留量的測定方法有固相萃取聯(lián)用氣相色譜法[15-16]、分散液液微萃取聯(lián)用液相色譜法[17-18]、QuEChERS聯(lián)用質(zhì)譜法[19-20]、凝膠滲透色譜聯(lián)用質(zhì)譜法[21-22]和固相萃取聯(lián)用質(zhì)譜法[23-25]，而QuEChERS聯(lián)用氣相色譜法測定枸杞及其制品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的報(bào)道較少。本文以鮮枸杞、干枸杞和枸杞原漿作為測試對象，建立QuEChERS聯(lián)用氣相色譜法測定21種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量的方法，并對該方法中每種目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC-2014C氣相色譜儀（配有電子捕獲檢測器，日本島津公司）；TG16離心機(jī)（上海盧湘儀）； MV5高通量平行濃縮儀（北京萊伯泰科）；PL602E/02電子天平[梅特勒-托利多（上海）]。

1.2 試藥

21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度均為100 μg/ml，溶劑均為正己烷，天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所）；正己烷和乙腈（色譜純，德國Meker公司）；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，粒徑40～60 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，粒徑40～60 μm）、石墨化碳黑（GCB，粒徑40～120 μm）（上海麥克林）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；測試樣品有鮮枸杞、干枸杞和枸杞原漿3類，均由酒泉市瓜州昊泰生物科技有限公司提供。樣品粉碎混勻后，于-18 ℃冰箱中密封保存。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-35毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1.0 μl；柱流量：1.2 ml/min；檢測器溫度：300 ℃；尾吹氣流量為30 ml/min；柱溫箱升溫程序見表1。

表1 柱溫箱的升溫程序

2.2 樣品前處理方法及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.2.1 凈化填料用量的選擇 參照GB23200.113-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定》[26]前處理方法中的QuEChERS凈化技術(shù)，對PSA、C18和GCB的用量進(jìn)行優(yōu)化。分別向6.0 ml目標(biāo)農(nóng)藥質(zhì)量濃度均為0.05 μg/ml的樣品提取溶液中加入方案1、方案2和方案3對應(yīng)的填料凈化，溶劑置換后上機(jī)分析。同時(shí)測定相同濃度的溶劑標(biāo)液作為對照，通過比較目標(biāo)農(nóng)藥的峰面積確定凈化填料的用量。3種方案對應(yīng)的凈化填料用量見表2。

表2 3種方案的凈化填料用量

2.2.2 樣品前處理方法 準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，置入50 ml離心管，干枸杞樣品需加入10.0 ml水浸潤30 min、鮮枸杞和枸杞漿不需要加水浸潤，加入10.0 ml乙腈，2000 r/min渦旋提取5 min，加入1顆陶瓷均質(zhì)子后再加入1.0 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉、6 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈震蕩1 min，4000 r/min離心5 min。于15 ml離心管中準(zhǔn)確吸取上層有機(jī)相6.0 ml，并向其中加入800 mg無水硫酸鎂、450 mg PSA、450 mg C18和45 mg GCB，2000 r/min渦旋1 min，8000 r/min離心5 min。取2.0 ml凈化液置入試管，40 ℃下加氮?dú)饩従彺抵两珊鬁?zhǔn)確加入1.0 ml正己烷復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)分析。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 空白基質(zhì)溶液：空白干枸杞樣品經(jīng)2.2.2項(xiàng)方法制得樣品溶液，于4 ℃冰箱保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別吸取α-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六等21種擬除蟲菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.20 ml，用正己烷定容至10.0 ml，混勻，得到質(zhì)量濃度為2.0 μg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃冰箱中保存。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.025，0.125，0.25，1.25，2.50 ml混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用正己烷定容至5.0 ml，混勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.010，0.050，0.10，0.50，1.0 μg/ml的溶劑混標(biāo)系列工作液（試劑標(biāo)液），臨用現(xiàn)配。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.025，0.125，0.25，1.25，2.50 ml混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用空白基質(zhì)溶液定容至5.0 ml，混勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.010，0.050，0.10，0.50，1.0 μg/ml的溶劑混標(biāo)系列工作液（基質(zhì)標(biāo)液），臨用現(xiàn)配。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)

在進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)前，用空白基質(zhì)溶液連續(xù)進(jìn)樣以飽和襯管上的活性位點(diǎn)，待連續(xù)進(jìn)樣時(shí)目標(biāo)化合物的峰面積穩(wěn)定后，依次在最優(yōu)的儀器條件下進(jìn)樣試劑標(biāo)液和基質(zhì)標(biāo)液。以目標(biāo)農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（ME）。

其中，km表示基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，ks質(zhì)表示匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

一般認(rèn)為：當(dāng)ME大于100 %，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME小于100 %，為基質(zhì)減弱效應(yīng)；當(dāng)ME位于-20 %～+20 %的范圍內(nèi)，基質(zhì)效應(yīng)不顯著；當(dāng)ME位于-50 %～-20 %或+20 %～+50 %的范圍內(nèi)，為較強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，即基質(zhì)效應(yīng)顯著；當(dāng)ME大于+50 %或小于-50 %時(shí)，為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，即基質(zhì)效應(yīng)非常顯著[28-29]。

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

選取空白干枸杞作為測試樣品，分別進(jìn)行0.02，0.10和0.40 mg/kg 3個(gè)含量水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)。待測物的含量通過下式計(jì)算：

式中，X：待測物含量，mg/kg；C：樣品測試溶液中待測物質(zhì)量濃度，μg/ml；V1：提取溶劑體積，ml，V1=10.0 ml；V2：用于氮吹的凈化液體積，ml，V2=2.0 ml；V3：樣品測試溶液復(fù)溶體積，ml，V3=1.0 ml；m：稱樣質(zhì)量，g；1000：單位換算系數(shù)；f：稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 柱溫箱升溫程序

通過降低柱溫箱的升溫速率和延長保持時(shí)間可使得性質(zhì)相近的目標(biāo)農(nóng)藥實(shí)現(xiàn)有效分離。在測定實(shí)際樣品時(shí)，目標(biāo)組分的保留時(shí)間與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間差應(yīng)小于±0.05 min。21種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的氣相色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的氣相色譜圖

3.2 凈化填料用量

枸杞樣品中糖、蛋白質(zhì)等組分含量較高且樣品提取溶液顏色較深，故應(yīng)在前處理過程盡量降低樣品測試溶液中基質(zhì)的含量，進(jìn)而消除基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果和分析儀器帶來的不利影響。目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)3種凈化方案和溶劑置換后的峰面積見圖2。由圖2可見，經(jīng)不同凈化方案得到的樣品測試溶液中目標(biāo)農(nóng)藥的峰面積與其相同質(zhì)量濃度的試劑標(biāo)液的峰面積比較呈不同的變化趨勢。本文涉及的21種擬除蟲菊酯農(nóng)藥中有15種目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)方案3凈化后峰面積之比在80 %～120 %之間，有3種目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)方案3凈化后的峰面積之比不在80 %～120 %范圍內(nèi)，其余3種目標(biāo)農(nóng)藥經(jīng)所有方案凈化后的峰面積之比均不在80 %～120 %的范圍內(nèi)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用方案3作為樣品提取溶液凈化的最佳選擇，即當(dāng)吸取的樣品提取溶液體積為6.0 ml時(shí)，加入的PSA、C18和GCB的用量分別為450，450和45 mg。

圖2 3種凈化方案對目標(biāo)物峰面積的影響

3.3 樣品前處理方法

本實(shí)驗(yàn)測定的樣品包含鮮枸杞、干枸杞和枸杞原漿，其中干枸杞的含水量較低，直接用乙腈提取效果不佳，因此在提取過程中應(yīng)考慮復(fù)水量的影響。根據(jù)GB 23200.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)桑枝、金銀花、枸杞子和荷葉中488種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[30]和相關(guān)研究[20]，當(dāng)復(fù)水量為稱樣量的2～2.5倍時(shí)，可獲得較高的提取效率。因此，在處理干枸杞樣品時(shí)，稱樣后加入10 ml水浸泡30 min再加入乙腈提取。

較NY/T 761-2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》[31]的前處理方法而言，本文設(shè)計(jì)的前處理方法具備以下優(yōu)勢：（1）將50.00 g的稱樣量降至5.00 g，同時(shí)將乙腈的用量從50.00 ml調(diào)整為10.00 ml，為節(jié)約試劑、降低檢測成本起到積極作用；（2）干制樣品在復(fù)水后進(jìn)行提取，使提取溶劑乙腈與樣品組織充分接觸，進(jìn)而獲得更高的提取效率；（3）在樣品提取溶液凈化時(shí)，采用QuEChERS技術(shù)代替了傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)，在減小有機(jī)試劑用量和縮短樣品凈化時(shí)間方面表現(xiàn)更突出。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

在實(shí)際樣品測定時(shí)，目標(biāo)農(nóng)藥表現(xiàn)出的基質(zhì)效應(yīng)因其自身性質(zhì)[32]和含量水平[33]、樣品種類[34]及測試儀器[35]等因素而異。因此，明確目標(biāo)農(nóng)藥在相應(yīng)測試樣品中的基質(zhì)效應(yīng)非常必要。本文涉及的21種擬除蟲菊酯農(nóng)藥表現(xiàn)出不同的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)或基質(zhì)減弱效應(yīng)，結(jié)果見表3。對于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的目標(biāo)農(nóng)藥，采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量是較常用的消除基質(zhì)效應(yīng)對測定結(jié)果不利影響的方法之一。因此，本實(shí)驗(yàn)在加標(biāo)回收試驗(yàn)和實(shí)際樣品測定時(shí)，均采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

表3 目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性方程、相關(guān)系數(shù)、方法定量限及基質(zhì)效應(yīng)

3.5 方法的分析特性

21種擬除蟲菊酯農(nóng)藥在0.010～1.0 μg/ml的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。以10倍的信噪比作為儀器的定量限，將其作為樣品測試溶液濃度，代入2.4項(xiàng)樣品中目標(biāo)物含量的計(jì)算公式即得到方法檢出限。21種目標(biāo)農(nóng)藥的方法檢出限均在0.005～0.010 mg/kg之間，與GB 23200.113-2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》[26]給出的方法定量限處于同一水平。21種目標(biāo)農(nóng)藥的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和方法定量限見表3。

通過低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和精密度，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定3次。3個(gè)加標(biāo)水平下所有目標(biāo)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率均在80.14 %～116.38 %之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.38 %～8.76 %之間，符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[36]的要求。

3.6 實(shí)際樣品測定

選取2份干枸杞、2份鮮枸杞和1份枸杞原漿作為實(shí)際樣品，采用本文優(yōu)化方法分析。在1份干枸杞中檢出了氯氰菊酯和高效氯氰菊酯，含量為0.096 mg/kg，小于GB 2763-2021[13]中規(guī)定的枸杞（干）中氯氰菊酯和高效氯氰菊酯的最大殘留限量2 mg/kg；其余4份樣品中均未檢出本文涉及的目標(biāo)農(nóng)藥。

4 結(jié)論

本文建立了一種氣相色譜法同時(shí)測定枸杞及枸杞制品中21種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量的方法，優(yōu)化了采用QuEChERS技術(shù)凈化樣品提取溶液時(shí)所用到的PSA、C18和GCB的用量，并明確了目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí)，通過加標(biāo)回收試驗(yàn)考察此法的準(zhǔn)確度和精密度，并測定實(shí)際樣品。此法前處理簡單，準(zhǔn)確度高且靈敏度好，可滿足枸杞中21種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量的同時(shí)測定，可為枸杞及其制品中相關(guān)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的陽性篩查和定量測定提供積極的幫助。