人參多糖成分的含量和指紋圖譜研究

高 瑩，王本偉，逯海燕，宋真真

（1. 濟(jì)南市人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 271100；2. 山東安捷生物檢測技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南 250101；3. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實驗室，山東 濟(jì)南 250101）

人參為五加科植物人參（Panax ginsengC. A.Mey. ）的干燥根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘，微苦，微溫，歸脾，肺，心，腎經(jīng)；具有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智等功效[1]。人參的化學(xué)成分主要有人參皂苷、人參多糖、甾醇及其苷、蛋白質(zhì)、黃酮類、礦物質(zhì)和維生素等[2]。其中人參多糖是其最主要的藥效成分之一，藥理學(xué)研究表明，人參多糖有調(diào)節(jié)免疫、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老等作用[3-9]。由于單糖組分是多糖發(fā)揮藥效的關(guān)鍵，因此單糖組分檢測在人參多糖質(zhì)量控制方面有重要作用。單糖極性較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)相近，且缺乏光學(xué)活性，因此為了改善其分離度和提高檢測靈敏度，通常采用三氟乙酸（TFA）水解多糖后，加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）進(jìn)行柱前衍生化，然后進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）分析[10-13]。本研究采用快速溶劑萃取方法（ASE）提取人參多糖，然后采用TFA水解-PMP柱前衍生化對人參中多糖組成進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析和相對含量研究，并對11批人參多糖進(jìn)行聚類分析，為人參中多糖的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（HPLC，安捷倫），包括G1379B型脫氣機(jī)，G1312B型二元輸液泵，G1367E型自動進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G1314F型VWD檢測器及Chemstation數(shù)據(jù)采集軟件；賽默飛Dionex? ASE? 350快速溶劑萃取儀（ASE350，賽默飛世爾）；電子天平（XSE 105DU，梅德勒托利多）；高速冷凍離心機(jī)（5810R，Eppendorf）；Milli-Q超純水機(jī)（Advantage A10，默克化工）；恒溫水浴鍋（HH-4，常州歐邦電子）；渦旋儀[Vortex Genius 3，艾卡（廣州）]。

半乳糖醛酸（批號：111646-201702，含量：95.1 %），葡萄糖（批號：110833-202109，含量：99.9 %），半乳糖（批號：100226-201807，含量：100 %）（中國食品藥品檢定研究院）；鼠李糖（批號：R108982，含量：99 %），阿拉伯糖（批號：A115318，含量：100 %）（上海阿拉丁）；TFA（批號：210231，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；PMP（批號：P109105，含量：99 %，上海阿拉?。?；乙腈（批號：214451，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；甲醇（批號：216565，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；水，Advantage A10 Milli-Q超純水機(jī)制備的超純水；其他試劑為分析純。11批人參藥材購自吉林?。ㄅ枺篐J191001，HJ191021，HJ200911，HJ200918，HJ200925，BG-20-07-09，BG-20-10-03，BG-21-4-11，BG-21-4-12，BG-19-2-11，BG-19-4-10。編號分別為S1-S11）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液[0.1 mol/L，pH 6.7，19:81（V/V）]；柱溫：30 ℃；檢測波長：245 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣體積：20 μl；分析時間：40 min。

2.2 對照品儲備液配制

精密稱取鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖適量分別置入10 ml量瓶，加超純水稀釋至刻度，得濃度均為2.0 mg/ml單糖對照品儲備液。

2.3 人參多糖溶液制備

取本品粉末（20～40目）1.0 g，置入10 ml不銹鋼萃取池，萃取池的下端加裝纖維濾膜，設(shè)置萃取參數(shù)（提取溫度：120 ℃；沖洗體積：70 %；壓力：1500 Psi；循環(huán)次數(shù)：1次；靜態(tài)萃取時間：6 min；氮?dú)獯祾邥r間：1 min），用75 %乙醇萃取，萃取液置入25 ml量瓶，用無水乙醇定容至刻度后轉(zhuǎn)移至離心管，2～8 ℃冰箱放置24 h后，4000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀加80 %乙醇洗滌，4000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀用無水乙醇洗滌，4000 r/min離心20 min，棄去上清，最后沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶定容，搖勻，即得人參多糖溶液。

2.4 人參多糖水解及衍生化

精密量取人參多糖溶液0.5 ml置入5 ml安剖瓶，加入1.0 ml 2 mol/L TFA，熔封后100 ℃水浴加熱6 h，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加2 ml甲醇，蒸干，重復(fù)3次，以除去TFA。加入1 ml超純水溶解，搖勻，取100 μl置入10 ml具塞玻璃管，加0.6 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl，0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μl，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)120 min；取出放冷，加200 μl的0.3 mol/L鹽酸中和，然后加900 μl超純水，加入1.5 ml氯仿萃取，4000 r/min離心10 min，棄氯仿相，依法萃取3次，再用0.5 ml超純水洗滌玻璃管2次，合并水相，置入蒸發(fā)皿，50 ℃水浴條件下蒸干，殘留物精密加入1 ml超純水溶解，混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，13200 r/min離心5 min，取上清，即得。

2.5 人參多糖指紋圖譜的構(gòu)建和評價

2.5.1 精密度 取人參藥材粉末適量，按2.3項方法制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以葡萄糖峰為參照峰，考察各色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的一致性。結(jié)果：各色譜峰相對保留時間的變異系數(shù)均小于0.9 %，相對峰面積的變異系數(shù)均小于1.7 %，表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性 取人參藥材粉末適量，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以葡萄糖峰為參照峰，考察各色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的一致性。結(jié)果：各色譜峰相對保留時間的變異系數(shù)均小于1.0 %，相對峰面積的變異系數(shù)均小于2.5 %。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性 取人參藥材粉末6份，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以葡萄糖峰為參照峰，評價各色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的一致性。結(jié)果：各色譜峰相對保留時間的變異系數(shù)均小于1.5 %，相對峰面積的變異系數(shù)均小于3.0 %，由于半乳糖醛酸在提取過程中容易降解，其相對峰面積的變異系數(shù)為6.5 %。

2.5.4 指紋圖譜的建立及共有峰的確認(rèn) 取單糖混合對照品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；取11批人參藥材粉末，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。混合對照品色譜圖和供試品色譜圖見圖1。

圖1 5種單糖的HPLC色譜圖

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012年版）對11批不同人參多糖指紋圖譜建立共有模式，做出對照指紋圖譜。11批人參多糖的指紋圖譜疊加見圖2。

圖2 11批人參多糖樣品的 HPLC 指紋圖譜

以葡萄糖色譜峰為參照，標(biāo)定出5個共有峰，生成對照指紋圖譜。經(jīng)與對照品相比較，歸屬了5個單糖，確定2，3，4，5，6號共有峰分別為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。與葡萄糖的相對保留時間分別為0.716，0.832，1.000，1.129，1.229。

2.6 聚類分析

以11批人參多糖樣品的5個共有峰的相對峰面積為變量，采用組間對比法結(jié)合平方歐氏距離進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，11批人參多糖共聚為三大類：第一類為S1，S2，S3，S5，S7，S9，第二類為S4，S6，S11，第三類為S8和S10。

2.7 相似度計算

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版，國家藥典委員會）對11批不同人參多糖建立對照指紋圖譜，將11批人參多糖圖譜與其進(jìn)行比較，計算相似度。11批人參多糖的相似度均大于0.90，相似度計算結(jié)果見表1。

表1 人參多糖相似度計算結(jié)果

2.8 人參多糖中單糖成分的含量測定

2.8.1 線性關(guān)系考察 取單糖對照品儲備液，用超純水稀釋成6個不同濃度的混合對照品溶液，取100 μl對照品溶液置入10 ml具塞玻璃管，加0.6 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl，0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μl，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)120 min；取出放冷，加200 μl的0.3 mol/L鹽酸中和，然后加900 μl超純水，加入1.5 ml氯仿渦旋，4000 r/min離心10 min，棄氯仿相，依法萃取3次，再用0.5 ml超純水洗滌玻璃管2次，合并水相，置入蒸發(fā)皿，50 ℃水浴條件下蒸干，殘留物精密加入1 ml超純水溶解，混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，13200 r/min離心5 min，取上清進(jìn)樣分析。以濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表2。

2.8.2 精密度 取人參藥材粉末（S6）適量，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計算峰面積的變異系數(shù)。結(jié)果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.4 %，1.6 %，0.3 %，0.8 %，0.8 %，表明該儀器的精密度良好。

2.8.3 穩(wěn)定性 取人參藥材粉末（S6）適量，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計算峰面積的變異系數(shù)。結(jié)果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.8 %，2.5 %，1.1 %，1.0 %，1.7 %，表明供試品溶液衍生化后在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.8.4 重復(fù)性 取人參藥材粉末（S6）6份，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計算峰面積的變異系數(shù)。結(jié)果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為2.8 %，6.5 %，2.4 %，2.9 %，2.4 %，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8.5 加樣回收率 取已知含量的人參藥材粉末（S6）6份，分別按已知含量相同的量加入單糖對照品，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計算各單糖成分的回收率。結(jié)果表明鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分別為104.8 %，92.6 %，96.4 %，105.3 %，96.6 %，回收率的RSD分別為2.6 %，5.4 %，2.7 %，2.5 %，2.2 %，表明本方法的加樣回收率良好。

2.8.6 含量測定 取11批人參藥材粉末適量，按2.3項制備人參多糖溶液，然后按2.4項和2.1項條件，進(jìn)樣分析，測定不同樣品中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量。結(jié)果鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量分別為0.148，1.236，3.373，0.558，0.549 mg/g。含量測定結(jié)果見表3。

表3 人參多糖中單糖含量/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 水解條件的選擇

多糖水解是檢測單糖的關(guān)鍵步驟，硫酸水解法采用高濃度硫酸易導(dǎo)致多糖炭化，出現(xiàn)較多雜峰，低濃度硫酸水解效果較差，導(dǎo)致分析結(jié)果偏差。因此，采用TFA水解，并嚴(yán)格控制水解條件。

TFA的濃度分別考察了1，1.5，2，2.5，3 mol/L，水解時間分別考察了2，4，6，8，12 h，通過綜合評價各單糖的峰面積及各單糖峰面積之和選擇最佳水解條件。結(jié)果表明選擇2 mol/L的TFA，水解6 h人參多糖基本水解完全，因此選擇2 mol/L的TFA，水解6 h作為最終水解條件。

3.2 衍生化條件的選擇

PMP是一種弱酸性的化合物，在堿性條件下可與還原糖的醛基定量反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收，而且糖鏈的其他部位不會被破壞，過量的試劑易于除去，衍生化產(chǎn)物非常穩(wěn)定，無立體異構(gòu)。本實驗主要考察了衍生化時間和溫度。

衍生化時間分別考察了0.5，1，2，3，4 h，衍生化溫度分別考察了30，50，70，90 ℃，通過綜合評價各單糖的峰面積及各單糖峰面積之和選擇最佳衍生化條件。結(jié)果表明PMP在70 ℃衍生化2 h各單糖的峰面積最大，因此選擇70 ℃，衍生化2 h作為最終衍生化條件。

3.3 指紋圖譜及含量測定結(jié)果分析

中藥指紋圖譜的構(gòu)建和評價對于提高中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有非常重要的意義。本研究建立了11批人參多糖的指紋圖譜，通過分析發(fā)現(xiàn)，11批樣品的相似度均大于0.90，表明不同批次的人參多糖化學(xué)組成基本相同。通過和對照品的色譜圖比對，共確認(rèn)了5種成分，分別為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。為進(jìn)一步比較不同批次人參藥材的質(zhì)量差異，本研究建立了鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5種單糖成分的含量測定方法。含量測定結(jié)果表明葡萄糖的含量最高，約占5種單糖總含量的50 %以上，總體而言，不同批次的人參藥材單糖含量基本一致，表明不同批次的人參藥材質(zhì)量穩(wěn)定可控。

綜上所述，本研究成功建立了人參多糖的指紋圖譜，并測定了鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5種單糖成分的含量，所建的方法具有分離效率高、分析時間短、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)?？捎糜谌藚⒍嗵浅煞值馁|(zhì)量控制。