酶解北芪菇蛋白抗氧化肽制備及其抗氧化活性研究

繆文玉，程繼安，陳 超，張娜郡，秦 楠 *

（1. 太原城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院管理工程系，山西 太原 030027；2. 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司奶粉事業(yè)部，湖北 宜昌 443000；3. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 榆次 030619）

北芪菇是在平菇培養(yǎng)基中加入黃芪培育而成的一類新型食用菌類，產(chǎn)于山西省大同市渾源縣[1]。北芪菇既具有普通食用菌無脂肪、無膽固醇的特點(diǎn)，還具備黃芪的藥理作用，具有藥食同源價(jià)值[2]。近年，安全、高效的功能活性肽成為研究熱點(diǎn)[3]。來源于食源性蛋白質(zhì)的抗氧化肽具有安全性高、活性高、功能性強(qiáng)等特點(diǎn)，能清除體內(nèi)自由基，有效防止脂質(zhì)氧化，并進(jìn)一步延緩細(xì)胞衰老和死亡[4-8]。關(guān)于北芪菇的研究主要集中在成分研究及提取工藝[1-2,9-10]，基于北芪菇抗氧化功能制備抗氧化肽的研究較少。本文以北芪菇蛋白為原料，以復(fù)合蛋白酶[11]高效酶解蛋白，研究制備北芪菇蛋白抗氧化性多肽的最佳工藝條件，為北芪菇蛋白的深加工和抗氧化肽的深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試藥 北芪菇（渾源縣澤青芪業(yè)開發(fā)有限公司）；木瓜蛋白酶（6000 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（60 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）、ABTS（北京索萊寶）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·，東京化成工業(yè)）；抗壞血酸、過硫酸鉀、鐵氰化鉀（天津科密歐）。

1.1.2 儀器 LXJ-IIB離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PHS-3C型pH計(jì)（上海盛磁）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇杰瑞爾）；Ultra-3660紫外可見分光光度計(jì)（北京普源精電）；AR223CN電子天平（奧豪斯儀器）。

1.2 方法

1.2.1 北芪菇蛋白肽的制備 北芪菇干粉按1:12加蒸餾水溶解，用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0[12]，2700 r/min離心5 min，取上清加鹽酸調(diào)pH至4.5，5000 r/min離心15 min，取沉淀加蒸餾水配制為濃度為2 %的溶液，調(diào)節(jié)pH，加入蛋白酶，在最適溫度下酶解，反應(yīng)完成后，95 ℃水浴滅酶15 min，5000 r/min離心15 min，取上清，得到北芪菇蛋白肽。

1.2.2 復(fù)合蛋白酶選擇

1.2.2.1 蛋白酶篩選 選取木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶，在最適溫度和pH值下進(jìn)行酶解，其他條件為底物濃度2 %，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間2 h，檢測DPPH·清除率和水解度[13]。

1.2.2.2 加酶方式選擇 選出兩種最佳蛋白酶后，根據(jù)表1的加酶方式進(jìn)行酶解[14]，其他條件為底物濃度2 %，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間2 h，檢測DPPH·清除率和水解度。

表1 加酶方式

1.2.2.3 加酶比例選擇 確定加酶方式后，分別按兩種酶比例1:1，1:2，1:3，2:1，3:1進(jìn)行酶解，其他條件為底物濃度2 %，加酶量5000 U/g，酶解時(shí)間2 h，檢測DPPH·清除率和水解度。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 研究不同酶解時(shí)間（1，1.5，2，2.5，3 h），復(fù)合酶加酶量（3000，4000，5000，6000，7000 U/g），溫度（30，35，40，45，50 ℃），pH（7，7.5，8，8.5，9）對(duì)北芪菇蛋白酶解的影響。固定研究因素底物濃度2 %，pH 7.5，加酶量5000 U/g，反應(yīng)溫度40 ℃，酶解時(shí)間2 h，檢測DPPH·清除率及水解度[15]。

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 自變量為酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度、pH值，響應(yīng)值為DPPH·清除率，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析[10,14]，具體設(shè)定見表2。結(jié)果采用Design-Expert.8.0.6.1軟件進(jìn)行分析。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

1.2.5 DPPH·清除率的測定 按表3加樣，震蕩，混勻后避光保存30 min，于517 nm處每3 min測一次吸光度（A），直至A值保持穩(wěn)定。每一A值需進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)以減小誤差。計(jì)算公式[16]見式1。

表3 DPPH·清除率試驗(yàn)加樣表

1.2.6 水解度測定 選用pH-stat滴定法[17]，計(jì)算公式見式2。

式中，V（ml）=消耗堿的體積；C（mol/L）=消耗堿的濃度；m（g）=蛋白質(zhì)總量；h=每克蛋白中肽鍵數(shù)（7.52 mmol/g）[18]；α是α-氨基酸的平均解離度，α=10pH-pKa/(1+10pH-pKa)，pH是反應(yīng)初始的pH值，pKa=7.8+2400×(298-T)/298T，T=273.15+t，t為反應(yīng)環(huán)境的溫度。

1.2.7 抗氧化試驗(yàn) ABTS·+清除率試驗(yàn) 采用ABTS法[19]測定北芪菇蛋白水解液的抗氧化性，以抗壞血酸作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品進(jìn)行比較。

用磷酸鹽緩沖溶液制得7 mmol/LABTS溶液40 ml，加入2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液40 ml混勻，再用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至734 nm處A為0.70±0.02，制成ABTS·+溶液。按表4加樣，于734 nm處測定A值。計(jì)算公式見式3。

表4 ABTS加樣表

1.2.8 抗氧化試驗(yàn) 總還原力試驗(yàn) 對(duì)北芪菇蛋白水解液進(jìn)行總還原力的測定[20]，以抗壞血酸作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品進(jìn)行測定。

取2 ml待測液加2.5 ml pH為6.6的PBS緩沖液和2.5 ml 1%鐵氰化鉀溶液，混合后50 ℃水浴20 min，冷卻后加入1 ml 10%的三氯乙酸溶液，5000 r/min離心10 min，取2.5 ml上清，加入2.5 ml蒸餾水和0.5 ml 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，放置10 min后在700 nm波長處測定A。以80 %的乙醇溶液作為空白組對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合蛋白酶的選擇

2.1.1 蛋白酶的篩選 由圖1可見，中性蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)北芪菇蛋白的DPPH·清除率和水解能力均高于其他兩種酶，所以選擇中性蛋白酶和堿性蛋白酶復(fù)合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 酶的種類對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響

2.1.2 加酶方式的選擇 由圖2可見，在DPPH·清除率指標(biāo)中，中性加堿性酶比堿性加中性酶要高，但是在水解度指標(biāo)中，堿性加中性酶比中性加堿性酶高。綜合考慮，選擇復(fù)合酶在中性蛋白酶最適合的溫度40 ℃和pH值7.5條件下水解。

圖2 加酶方式對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響

2.1.3 加酶比例的選擇 由圖3可見，加酶比例為1:1時(shí)DPPH·清除率比2:1略高，明顯高于其他組，且水解度最高。因此，確定最適的加酶比例為中性蛋白酶:堿性蛋白酶=1:1。

圖3 加酶比例對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響 由圖4可見，隨反應(yīng)時(shí)間的延長，DPPH·清除率先上升后緩慢下降，在反應(yīng)1.5 h處達(dá)到最大值，1.5 h以后DPPH·清除率逐漸降低可能是抗氧化性多肽又進(jìn)一步被分解為氨基酸或者小分子多肽[21]。水解度先增加后保持不變，在反應(yīng)2 h處達(dá)到峰值并穩(wěn)定，可能是因?yàn)榈孜锱c蛋白酶充分反應(yīng)。因此，選擇1.5 h為合適的酶解時(shí)間。

圖4 時(shí)間對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響

2.2.2 加酶量對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響 由圖5可見，DPPH·清除率先上升后下降，在加酶量5000 U/g處達(dá)到峰值，可能是北芪菇蛋白在酶量剛開始增加時(shí)先被水解成具有抗氧化性的多肽[22]，隨著酶量的逐漸增加，抗氧化性的多肽又進(jìn)一步被水解為氨基酸和小分子肽。隨著酶用量的增加，水解度先增大后基本保持穩(wěn)定，添加量在4000 U/g時(shí)達(dá)到最大值，可能是因?yàn)榈孜锱c蛋白酶已經(jīng)充分反應(yīng)。綜合考慮，選擇5000 U/g為合適的加酶量。

圖5 加酶量對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響

2.2.3 溫度對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響 由圖6可見，隨著溫度的升高，DPPH·清除率和水解度先增大后減小，在溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，DPPH·清除率和水解度均達(dá)到峰值。原因可能是溫度過低時(shí)酶活性較低，隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)加快，水解度增大，得到更多的抗氧化性多肽，超過最適溫度后，酶活性會(huì)降低，甚至?xí)Щ睿瑢?dǎo)致水解度減小，抗氧化性多肽數(shù)量減少[23]。綜合考慮，選擇40 ℃為合適的酶解溫度。

圖6 溫度對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響

2.2.4 pH對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響 由圖7可見，隨pH值的增大，DPPH·清除率和水解度先增大后降低。pH為7.5時(shí)，DPPH·清除率達(dá)到最大值，pH值為8時(shí)，水解度達(dá)到最大值。原因可能是蛋白酶有最適pH值，遠(yuǎn)離最適pH值會(huì)降低水解能力，水解蛋白的數(shù)量減少，得到的抗氧化性多肽數(shù)量也會(huì)減少，因而導(dǎo)致DPPH·清除率降低[24]。綜合考慮，選擇7.5為最適pH。

圖7 pH對(duì)DPPH·清除率和水解度的影響

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶解時(shí)間、加酶量、酶解溫度、pH值為自變量，DPPH·清除率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert.8.0.6.1軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得回歸方程：DPPH·清除率（%）Y=57.20-2.49A+1.88B-4.49C-0.83D-3.38AB+5.25AC+0.35AD+1.22BC-1.55BD+1.80CD-8.06A2-13.85B2-17.69C2-13.40D2。

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。一次項(xiàng)A、B、C，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2和交互項(xiàng)AB、AC對(duì)DPPH·清除率具有極顯著影響。此回歸模型P＜0.0001，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該模型可靠。R2=0.9944，表明擬合值與試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有高度擬合性。R2Adj=0.9887，表明該模型能解釋98.87%的響應(yīng)值變化。因此，用此模型優(yōu)化酶解北芪菇蛋白制備抗氧化肽的工藝是可行的。

表6 回歸模型方差分析結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)曲面圖結(jié)果 各因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響見圖8。AC的響應(yīng)面曲線較陡，且等高線圖更偏橢圓形，因此AC的交互作用對(duì)DPPH·清除率的影響最為顯著。其中，溫度對(duì)DPPH·清除率的影響大，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面的梯度較陡峭，等高線較密度較大；時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面的梯度較平，等高線密度較小[25]。交互作用對(duì)DPPH·清除率的影響大小順序?yàn)椋篈C＞AB＞CD＞BD＞BC＞AD。

圖8 各因素對(duì)DPPH·清除率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 運(yùn)用Design-Expert.8.0.6.1軟件分析由模型預(yù)測可見，在時(shí)間1.39 h，加酶量5091 U/g，溫度39.2 ℃，pH 7.47的條件下酶解，DPPH·清除率可達(dá)57.95 %。考慮到試驗(yàn)條件和現(xiàn)實(shí)情況，確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為時(shí)間1.5 h，5100 U/g，溫度40 ℃，pH 7.5。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，DPPH·清除率為58.20 %±0.23 %，與預(yù)測值相差較小，結(jié)果可靠。

2.4 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果見表7，表明北芪菇蛋白水解液所得的多肽具有抗氧化性。

表7 抗氧化指標(biāo)

3 結(jié)論

本文采用復(fù)合酶解的方式，研究制備北芪菇蛋白抗氧化性多肽的最佳工藝條件，并驗(yàn)證所得多肽抗氧化活性。確定制備北芪菇蛋白抗氧化肽的最佳工藝參數(shù)為：酶解時(shí)間1.5 h，復(fù)合酶添加量5100 U/g，酶解溫度40 ℃，pH 7.5。在此條件下，得到的抗氧化性多肽的DPPH·清除率為58.20 % ±0.23 %，ABTS·+清除率為81.13 %±1.09 %，總還原力為0.3393±0.0023，可以說明北芪菇蛋白水解液所得的多肽具有抗氧化性。

本研究為酶法制備北芪菇蛋白抗氧化肽提供最佳工藝條件，為進(jìn)一步研究其抗氧化性提供理論基礎(chǔ)。之后可以就北芪菇抗氧化肽在體內(nèi)抗氧化作用及作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，為北芪菇的深加工以及抗氧化肽的發(fā)展提供技術(shù)和理論支持。