含揮發(fā)油飲片草豆蔻標準湯劑的質(zhì)量評價方法研究

吳遠波，張鴻，劉宇政，焦?jié)?，冷紅文，吳克勤，吳靚

（1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，江西南昌，330006；2.丹東市市場監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部，遼寧丹東，118002）

0 引言

2021年2月，國家藥品監(jiān)督管理局在《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》（ 以下簡稱《技術(shù)要求》）［1］中，首次以官方文件的形式提出了標準湯劑的概念：“標準湯劑系遵循中醫(yī)藥理論，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范化煎煮，固液分離，經(jīng)適當濃縮制得并經(jīng)適宜方法干燥制得，為衡量單味中藥配方顆粒是否與其相對應(yīng)的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準?！痹谥兴幣浞筋w粒的研制過程中，標準湯劑起到了重要的橋連作用，中藥配方顆粒的所有藥學(xué)研究均須與標準湯劑進行對比。

草豆蔻為姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadaiHayata）的干燥近成熟種子［2，3］，具有燥濕行氣、溫中止嘔的功效，用于寒濕內(nèi)阻、脘腹脹滿冷痛、曖氣嘔逆、不思飲食［2］。草豆蔻主要含有揮發(fā)油、黃酮、二苯庚烷等［4，5］，具有保護胃黏膜、抗胃潰瘍、促胃腸動力、鎮(zhèn)吐、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用［5］。本研究選用主產(chǎn)區(qū)且符合藥典要求的10批草豆蔻飲片制備標準湯劑，以山姜素、喬松素為指標成分，并進行含量測定，計算兩成分的含量轉(zhuǎn)移率［6］，測定各批次標準湯劑揮發(fā)油含量并計算其轉(zhuǎn)移率，測定出膏率，并以標準湯劑進行HPLC指紋圖譜研究，為草豆蔻標準湯劑作為物質(zhì)基準的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

1.1.1 儀器

Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher 公司，包括四元梯度泵，WPS-3000SL自動進樣器，TCC-3000RS柱溫箱，DAD-3000檢測器）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）； EX125ZH電子天平（奧豪斯儀器有限公司，感量0.01mg）；LE204E/02電子天平（梅特勒-托利多儀器〈上?！涤邢薰?，感量0.1mg）；CP213電子天平（奧豪斯儀器有限公司，感量 1mg）；SZCL-3A型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DKM610C干燥箱（重慶雅馬拓科技有限公司）；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.1.2 試劑與樣品

試藥：山姜素對照品（批號：PS010886，純度大于98%）、喬松素（批號：PS010411，純度大于98%）、小豆蔻明對照品（批號：PS000964，純度大于98%）、榿木酮對照品（批號：PS010412，純度大于98%）、草豆蔻對照藥材（批號：PS030099），均購自成都普思生物科技股份有限公司。乙腈和甲醇為色譜純，水為怡寶純凈水，甲醇及無水乙醇等其他試劑均為分析純。

樣品：10批不同來源草豆蔻飲片，經(jīng)丹東市市場監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部焦?jié)鞴苤兴帋熻b定為草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）的干燥近成熟種子，草豆蔻信息見表1。

表1 10 批草豆蔻來源信息表

1.2 實驗過程

1.2.1 草豆蔻飲片的檢測

取草豆蔻飲片按《中國藥典》2020年版一部“草豆蔻”飲片項下［2］標準進行檢測，結(jié)果符合藥典規(guī)定。

1.2.2 草豆蔻飲片標準湯劑的制備［7-9］

取草豆蔻飲片，搗碎，稱取100.0g，加8倍量水浸泡30min，接揮發(fā)油提取器回流提取2h，接出揮發(fā)油，水提液趁熱過濾，在藥渣中再加6倍量水，接揮發(fā)油提取器回流提取30min，接出揮發(fā)油，水提液趁熱過濾，合并兩次濾液［10］，減壓濃縮至適量，將2次提取的揮發(fā)油合并，加入濃縮液中，定容至500mL，充分搖勻，得到規(guī)格為0.2g/mL的草豆蔻飲片標準湯劑。

1.2.3 草豆蔻標準湯劑指標成分含量測定

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-水（60：40）；檢測波長為300nm；柱溫為30℃；流速為1.0mL/min；進樣量為5μL。該色譜條件下，供試品溶液各指標成分峰分離良好，見圖1。

圖1 山姜素對照品與喬松素對照品（A）、草豆蔻標準湯劑（B）HPLC圖

1.2.3.2 對照品溶液的制備

取適量山姜素、喬松素對照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含山姜素40μg、喬松素40μg的混合對照品溶液，即得。

1.2.3.3 供試品溶液的制備

取草豆蔻標準湯劑搖勻，精密量取1mL，置于10mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至接近刻度，超聲處理（功率500W，頻率40KHz）10min，冷卻，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得［11，12］。

1.2.3.4 線性關(guān)系考察

取適量山姜素、喬松素對照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含山姜素100.0μg、喬松素105.6μg的混合對照品溶液。精密吸取該溶液配成系列濃度的對照品溶液，按“1.2.3.1”項下選定的條件測定，進樣5μL，記錄峰面積。以每個對照品的進樣量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到2個成分的線性回歸方程及線性范圍，見表2。

表2 山姜素、喬松素的線性回歸方程及線性范圍

1.2.3.5 儀器精密度試驗

精密吸取同一份對照品溶液5μL，按“1.2.3.1”項下選定的條件，連續(xù)進行6次的進樣測定，記錄2個指標成分的峰面積。山姜素、喬松素的峰面積的RSD分別為0.8%、0.9%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

1.2.3.6 重復(fù)性

取同一批樣品（批號：2302001），按“1.2.3.3”項下的方法制備供試品溶液6份，按“1.2.3.1”項下選定的條件進行測定，記錄山姜素、喬松素的峰面積，計算2個指標成分的含量。結(jié)果顯示，山姜素的平均含量為0.31mg/mL，RSD為1.0%；喬松素的平均含量為0.31mg/mL，RSD為0.9%。結(jié)果表明該含量測定方法的重復(fù)性良好。

1.2.3.7 穩(wěn)定性試驗

取草豆蔻標準湯劑同一份供試品溶液，分別在制備后0h、4h、8h、12h、24h，按“1.2.3.1”項下選定的條件進樣5μL，記錄2個指標成分的峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性。計算得山姜素、喬松素的峰面積的RSD分別為1.3%、1.4%。結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.3.8 加樣回收率試驗

取6份已知含量的樣品（批號：2302001）搖勻，取6份，每份精密量取0.5mL，根據(jù)標準湯劑中山姜素、喬松素的含量按1：1的比例添加對照品［6］（山姜素159.9μg、喬松素160.1μg），按“1.2.3.3”項下的方法制備，按“1.2.3.1”項下選定的條件測定，計算得山姜素平均回收率為103.6%，RSD為1.8%；喬松素平均回收率為101.1%，RSD為1.2%。結(jié)果表明本法具有良好的回收率。

1.2.3.9 樣品測定

取10批草豆蔻標準湯劑樣品，精密量取1mL，按“1.2.3.3”項下的方法制備，按“1.2.3.1”項下選定的條件測定，記錄山姜素、喬松素的峰面積，計算10批標準湯劑中山姜素和喬松素的含量。結(jié)果見表3。

表3 草豆蔻標準湯劑山姜素、喬松素含量及轉(zhuǎn)移率

1.2.4 指標成分及揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率和出膏率

根據(jù)標準湯劑中山姜素和喬松素的含量測定結(jié)果，計算兩個指標成分的含量轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。根據(jù)標準湯劑中揮發(fā)油含量測定結(jié)果，計算揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表4。

表4 草豆蔻標準湯劑出膏率及揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果

出膏率測定方法：取草豆蔻標準湯劑適量，搖勻，精密吸取10mL置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3h，取出，置于干燥器中冷卻30min，稱定重量［13，14］。出膏率結(jié)果見表4。

1.2.5 草豆蔻標準湯劑HPLC指紋圖譜測定

1.2.5.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～45min，40%～52%A；45～60min，52%～100%A）；檢測波長為262nm，柱溫為40℃，流速為0.8mL/min；進樣量為10μL?；旌蠈φ掌放c標準湯劑色譜圖見圖2。

經(jīng)查閱文獻［2，15］，并比對對照品色譜圖，判別1、2、6、8號峰分別為山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮。以保留時間適中、出峰穩(wěn)定、有對照品的2號峰（喬松素）為參照峰（S），計算草豆蔻標準湯劑中主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積［16］。

1.2.5.2 參照物溶液的制備

取山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含山姜素40μg、喬松素40μg、小豆蔻明20μg、榿木酮20μg的混合溶液，即得對照品參照物溶液。取草豆蔻對照藥材0.5g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，超聲處理（功率500W，頻率40KHz）30min，放冷［17］，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得對照藥材參照物溶液。

1.2.5.3 供試品溶液的制備

取“1.2.3.3”項制得的溶液，即得。

1.2.5.4 儀器精密度試驗

精密吸取草豆蔻標準湯劑同一份供試品溶液10μL，按“1.2.5.1”項下選定的條件，連續(xù)進行6次進樣測定，記錄液相色譜圖。以喬松素峰為參照，求得其余7個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，相對保留時間RSD＜0.5%，相對峰面積RSD＜5%，這表明精密度較好。

1.2.5.5 重復(fù)性試驗

取同一批草豆蔻標準湯劑樣品，按“1.2.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.5.1”項下選定的條件進行測定。以喬松素峰為參照，求得其余7個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，相對保留時間RSD＜0.5%，相對峰面積RSD＜5%，這表明重復(fù)性良好。

1.2.5.6 穩(wěn)定性試驗

取草豆蔻標準湯劑（同一份供試品溶液），分別于制備后0h、4h、8h、12h、24h，按“1.2.5.1”項下選定的條件進樣10μL。以喬松素峰為參照，求得其余7個共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，相對保留時間RSD＜0.5%，相對峰面積RSD＜5%，這表明標準湯劑供試液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.5.7 樣品測定與分析

取10批草豆蔻標準湯劑，按“1.2.3.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“1.2.5.1”項下選定的條件進行測定，記錄10批色譜圖，用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723版）”進行分析［18］，生成對照指紋圖譜，具體見圖3、圖4。10批標準湯劑指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度依次為0.978、0.934、0.969、0.987、0.984、0.988、0.989、0.991、0.930、0.920。草豆蔻標準湯劑指紋圖譜中確定了8個共有峰，10批草豆蔻標準湯劑與對照圖譜之間的相似度均＞0.9［16］。

圖3 10批草豆蔻飲片標準湯劑（S1～S10）的高效液相指紋圖譜及對照指紋圖譜（R）

圖4 草豆蔻標準湯劑對照指紋圖譜

1.2.5.8 對照藥材、標準湯劑指紋圖譜比較

取對照藥材參照物溶液，按“1.2.5.1”項下選定的條件進行測定，記錄色譜圖，見圖5。結(jié)果顯示，對照藥材具有與標準湯劑相同的8個共有峰，表明兩者化學(xué)成分無明顯變化，具有一定的等效性與相關(guān)性［19］。

圖5 草豆蔻對照藥材指紋圖譜（A）與標準湯劑對照指紋圖譜（B）

2 結(jié)果與討論

草豆蔻富含揮發(fā)油，為了更好地保留這類成分，制備標準湯劑時，需要將其單獨提取出來，參考文獻中的提取工藝［7-9］，將提取得到的草豆蔻揮發(fā)油兌入濃縮的湯劑中。本研究所用的10批草豆蔻飲片的揮發(fā)油含量為1.01%～1.72%（mL/g），草豆蔻標準湯劑的揮發(fā)油含量為0.66%～0.98%（mL/g），揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率為50.6%～79.2%。數(shù)據(jù)顯示，草豆蔻標準湯劑揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率較高。

草豆蔻飲片標準湯劑是以水為溶媒經(jīng)標準化工藝提取的，其提取物大部分為水溶性物質(zhì)。在《中國藥典》2020年版草豆蔻飲片［2］的4個含量測定指標成分中，我們選取了水溶性相對高的山姜素和喬松素作為標準湯劑的指標成分，考察其含量轉(zhuǎn)移率。而小豆蔻明和榿木酮的水溶性較差，含量轉(zhuǎn)移率較低，我們將該兩種成分放在指紋圖譜測定中加以監(jiān)控。

在指紋圖譜分析方法建立過程中，使用DAD檢測器在190～400nm全紫外波長掃描樣品光譜圖，提取254nm、262nm、280nm、300nm處的色譜圖進行比對，并參考相關(guān)文獻［15］，綜合考慮色譜峰數(shù)、色譜信號、分離情況、基線平穩(wěn)情況等方面因素，最終選擇262nm作為檢測波長，同時，考察30℃、35℃、40℃柱溫對色譜分離的影響。結(jié)果顯示，柱溫對色譜分離效果有較大影響，40℃時所得指紋圖譜的分離效果較好，故建議柱溫設(shè)定為40℃。

3 結(jié)論

本研究選取10批合格的草豆蔻作為研究用樣品，建立了質(zhì)量評價方法，得出山姜素的含量轉(zhuǎn)移率范圍為31.7%～56.3%，喬松素的含量轉(zhuǎn)移率范圍為15.5%～35.6%，揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率范圍為50.6%～79.2%，出膏率范圍為8.8%～13.7%，均符合《技術(shù)要求》的范圍要求；建立了HPLC指紋圖譜，標定了8個共有峰，指認了山姜素、喬松素、小豆蔻明和榿木酮峰，各標準湯劑圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9。本文研究的標準湯劑出膏率、指標成分和揮發(fā)油含量轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜三個參數(shù)是其作為物質(zhì)基準的重要依據(jù)。本文的研究結(jié)果可以為草豆蔻配方顆粒后續(xù)的工藝研究、質(zhì)量控制方法制定等提供參考［6， 20］。