高效液相色譜法測定達原飲中檳榔生物堿的含量

張瑩，劉冰，陳秀梅，黃濤，楊芳雨，張博雄

（襄陽職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院，湖北襄陽，441050）

0 引言

達原飲最早出自明代醫(yī)家吳又可所著的《瘟疫論》［1］，作為治療“濕濁”的抗疫古方，具有“辟穢化濁、開達膜原的功效”［2，3］，為我國新型冠狀病毒感染診療方案中第三版至第七版中醫(yī)治療的推薦處方［4］。在臨床治療和藥理學研究中效果甚佳［5-8］。達原飲藥方原文記載為：“檳榔二錢、厚樸一錢、草果仁五分、知母一錢、芍藥一錢、黃芩一錢、甘草五分。右用水二盅，煎八分，午后溫服。”其中，檳榔為君藥，厚樸和草果仁為臣藥，知母、芍藥和黃芩為佐藥，甘草為使藥。檳榔生物堿為君藥檳榔中的主要有效成分，具有抗血栓的作用［9］。臣藥厚樸的有效成分為厚樸酚與和厚樸酚，主要起抗炎抗氧化的藥理作用［10］；草果仁的主要成分為草果黃酮，具有抗氧化的作用［11］。目前，達原飲多以傳統(tǒng)中藥湯劑的形式在臨床中使用。中藥湯劑的制備是多環(huán)節(jié)的系統(tǒng)工程，中藥飲片的產(chǎn)地、種植、采集、加工炮制、煎煮等環(huán)節(jié)均會影響湯劑的質(zhì)量，而湯劑的質(zhì)量對中醫(yī)臨床而言至關(guān)重要，它直接影響著臨床治療的療效。目前對于達原飲中有效成分的質(zhì)量控制較少，并且現(xiàn)有的研究主要針對芍藥苷、黃芩苷和芒果苷等在傳統(tǒng)C18色譜柱上容易保留的物質(zhì)［12-14］。而對達原飲中君藥檳榔中檳榔生物堿的質(zhì)量控制未見報道。檳榔中的生物堿主要有檳榔堿、去甲基檳榔堿、檳榔次堿和去甲基檳榔次堿［9，15］。本研究利用高效液相色譜法，建立了采用離子色譜柱同時測定達原飲中4種檳榔生物堿含量的檢測方法，并對其方法進行了驗證，為達原飲全面的質(zhì)量控制提供了理論支撐。

1 材料

達原飲的七味中藥飲片，即檳榔、厚樸、草果仁、知母、芍藥、黃芩、甘草均購于當?shù)刂兴幏浚ㄏ尻柶仗飒毣畲笏幏浚?；對照品去甲檳榔堿（批號：Q-075-180930，成都瑞芬思生物科技有限公司）、氫溴酸檳榔堿（批號：Q-043-191022，成都瑞芬思生物科技有限公司）、去甲檳榔次堿鹽酸鹽（批號：Q-047-170929，成都瑞芬思生物科技有限公司）和檳榔次堿（批號Q-164-190830，成都瑞芬思生物科技有限公司），以上對照品的純度均大于98%。甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑純度均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀（四元泵、VWD檢測器、自動進樣器，美國安捷倫科技有限公司），BSA224S型分析天平（德國賽多利斯），TGL-16M 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），中藥自動煎煮壺（九陽股份有限公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的配制

經(jīng)典名方達原飲的出處為《瘟疫論》，原文記載：“檳榔二錢、厚樸一錢、草果仁五分、知母一錢、芍藥一錢、黃芩一錢、甘草五分。右用水二盅，煎八分，午后溫服。”據(jù)此確定中藥達原飲的制備工藝：稱取檳榔10 g、厚樸5 g、草果仁2.5 g、知母5 g、芍藥5 g、黃芩5 g、甘草2.5 g，平行稱取6份，分別加入300 mL純凈水浸泡60 min；頭煎，使用武火煎煮10 min待溶液沸騰后，轉(zhuǎn)文火慢煎20 min；用真空過濾器進行過濾，收集濾液；將濾渣進行二次煎煮，加入100 mL純凈水，使用武火煎煮10 min待溶液沸騰后，轉(zhuǎn)文火慢煎10 min；用真空過濾器進行過濾，收集濾液，將兩次煎煮濾液合并混勻，定容至400 mL，放冷，使用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液待測。

2.2 對照品溶液的配制

精密量取去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿各5.00 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用純甲醇溶解并定容至刻度，作為單個對照品溶液待用。精密吸取上述四種單個對照品溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，用純甲醇溶解并定容至刻度，作為檳榔生物堿混合對照品溶液待用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Venusil SCX 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，300 ?，天津博納艾杰爾科技有限公司）；流動相：甲醇：0.2%磷酸（氨水調(diào)節(jié)pH值至3.8）=60：40；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1。

3 結(jié)果

3.1 HPLC圖譜

檳榔生物堿混合對照品溶液（A）和達原飲供試品溶液（B）的HPLC圖譜如圖1。

圖1 檳榔生物堿混合對照品（A）和達原飲供試品溶液（B）的HPLC圖譜

從圖1中可以看出，在此測試條件下，檳榔生物堿的4種對照品完全基線分離，分離度良好，各對照品峰型基本對稱，分離時間較短，并且在供試品中與其他組分無干擾。

3.2 線性關(guān)系的考察

取按2.2制備的檳榔生物堿混合對照品溶液2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL置于20 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，配制一系列質(zhì)量濃度的混合對照品，按照2.3色譜條件依次進樣，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積為縱坐標（y），對照品濃度為橫坐標（x）分別繪制四種檳榔生物堿的標準曲線，擬合得到線性回歸方程。線性回歸方程見表1。從表1中可以看出，4種檳榔生物堿各自的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

表1 4種檳榔生物堿的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

3.3 檢出限與定量限

將按2.2項下配制的檳榔生物堿混合對照品用50%的甲醇溶液進行逐級稀釋定容，按照2.3項下的色譜條件進行進樣檢測。信噪比（S/N）為3：1時，混合對照品溶液濃度為本檢測方法的檢出限（LOD）；信噪比（S/N）為10：1時，混合對照品溶液濃度為本檢測方法的定量限（LOQ），本方法的LOD和LOQ值見表1。

3.4 精密度試驗

取按2.2項配制的檳榔生物堿混合對照品，按照2.3項下的色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，分別計算四種檳榔生物堿對照品6次峰面積的相對標準偏差（RSD）（n=6）值。去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿的RSD值分別為1.21%、1.52%、1.43%和1.32%，此結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗

取2.1項下制備的同一份供試品溶液，在0、4h、8h，16h和24 h按照2.3項下的色譜條件進樣，分別記錄四種檳榔生物堿的峰面積和保留時間。n=6時，去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿峰面積的RSD值分別為1.12%、1.19%、1.30%和1.23%；保留時間的RSD值分別為0.91%、0.87%、0.91%和0.94%。結(jié)果表明在24 h內(nèi)供試品的穩(wěn)定性較好。

3.6 重復性試驗

取按2.1項制備的6份供試品溶液，分別按照2.3項下的色譜條件進樣，記錄四種檳榔生物堿的峰面積和保留時間。n=6時，去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿峰面積的RSD值分別為1.42%、1.32%、1.41%和1.34%；保留時間的RSD值分別為0.81%、0.80%、0.87%和0.90%。結(jié)果表明本檢測方法的重復性較好。

3.7 加標回收率試驗

精密移取按2.1項制備的同一份達原飲藥液供試品5.0 mL共9份，每3份為一組，每組按照供試品中檳榔生物堿含量的80%、100%和120%加入對照品溶液，稀釋定容，按2.3項下的色譜條件進樣。加標回收率結(jié)果見表2。從表2中可以看出，達原飲中去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿的平均加標回收率分別為100.41%、101.01%、102.11%和98.37%，RSD值分別為1.91%、1.25%、1.04%和1.18%，RSD值均小于2%。此加標回收率試驗結(jié)果表明該分析檢測方法準確度較好，可用于達原飲中4種檳榔生物堿含量的測定。

表2 達原飲中4種檳榔生物堿的加標回收率（n=9）

3.8 含量測定

將按2.1制備的達原飲藥液按照2.3項下的色譜條件進行檢測，測得達原飲藥液中去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿的含量分別為0.014 mg·mL-1、0.046 mg·mL-1、0.036 mg·mL-1和0.018 mg·mL-1。

4 結(jié)論

檳榔為中藥抗疫名方達原飲中的君藥，其中的檳榔生物堿是達原飲發(fā)揮藥理作用的主要成分之一，因此建立達原飲中檳榔生物堿的檢測方法以對其質(zhì)量進行控制十分必要。本文首次建立了達原飲中4種檳榔生物堿含量測定方法，采用高效液相色譜法對達原飲中4種檳榔生物堿的含量進行測定。色譜條件為Venusil SCX 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，300 ?）；流動相：甲醇：0.2%磷酸（氨水調(diào)節(jié)pH值至3.8）=60：40；檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1。經(jīng)過方法學驗證，結(jié)果表明，在49.6～250.5 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性較好，穩(wěn)定性和重復性良好，準確度較高，達原飲藥液中去甲檳榔堿、檳榔堿、去甲檳榔次堿和檳榔次堿的含量分別為0.014 mg·mL-1、0.046 mg·mL-1、0.036 mg·mL-1和0.018 mg·mL-1。該方法為達原飲藥液的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。